Summary
작은 동물 이미징 기술은 직렬 진단 시험 및 생체 내에서 치료 적 개입을 허용한다. 최근, 응용 프로그램의 범위가 크게 확대하고 현재 대장 종양 발생의 평가, 상처 치유 및 염증의 모니터링이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 내시경 검사의 이러한 다양한 응용 가능성을 보여줍니다.
Abstract
마우스 모델은 널리 인간 질병의 발병 기전을 연구 및 전임상 진단 절차뿐만 아니라 치료 적 개입을 평가하는 데 사용됩니다. 그러나, 병리학 적 변화의 올바른 평가는 종종 조직 학적 분석을 필요로하고, 생체 외에서 수행 할 때, 동물의 사망을 필요로한다. 따라서 기존의 실험 설정에서, 내 개별 추적 검사는 거의 가능하다. 따라서, 살아있는 마우스에서 뮤린 내시경의 개발은 직접 위장 점막을 시각화와 같은 변경을 모니터링하는 절차를 반복 모두 처음 조사자 수있다. 생체 쥐 내시경 검사에 대한 수많은 응용 프로그램, 장 염증이나 상처 치유를 공부 반복 점막 생검 획득을 포함한, 존재하고,에 로컬 소형 주입 카테터를 사용하여 진단 또는 치료 에이전트를 관리 할 수 있습니다. 가장 최근에, 분자 영상은 확장했다 영상 진단 모특정 photoprobes를 구별하여 표적 분자의 검출을 허용하는 특정 dalities. 결론적으로, 쥐의 내시경 검사는 생체 영상 진단 실험을위한 새로운 첨단 기술로 떠오르고있다 상당히 다양한 분야에서 임상 연구에 영향을 미칠 수 있습니다.
Introduction
동물 모델은 크게 여러 장 병리에 대한 우리의 이해를 풍성하게했다. 실험실 마우스 (뮤스 musculus)는 인해 풍부한 유전자 및 게놈 정보를 생물 의학 연구에서 주요 동물 모델로 부상하고 유전자 녹아웃 균주에서 쉽게 사용할 수있다. 이해 질병 병인을 향상시키는 것 외에, 동물 모델은 또한 중요한 약물 후보뿐만 아니라 임상 진단이나 치료 개입을 테스트하기 위해 사용된다. 그러나, 인간의 질병을 흉내 낸 마우스 모델의 다양성에도 불구하고, 정기적으로 환자 치료에 사용되는 여러 진단 및 중재 적 옵션은 마우스 사용할 수 없습니다. 따라서, 감시 전략은 종종 간접 관찰에 한정되는 뮤린 질병 또는 치료 개입의 영향의 과정을 모니터링하거나 부검 분석 씀. 비 침습적 모니터링 마우스에 대한 질병 활동 지수와 같은 활력을 존재하지만, 한때체중 감소 또는 증가, 혈액, 소변 및 대변의 antification 다음은 간접 지표 간 약간의 차이에 의해 바이어스된다, 분석한다. 또한, 사후 부검은 반복 시점에서 종 관찰을 방지 분석합니다. 정교한 영상 기술은 최근 1,2 도입 된 마우스에서 질병 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 이 영상 기술은 반복적 인 분석이 가능하지만, 그들은 단지 직접 점막의 시각화를 활성화 또는 생검 수집 또는 약물 후보의 국소 및 점막 내암을 응용 프로그램으로 진단 또는 치료 개입을 허용하지 않는, 장에 설명하고 종종 부정확 한보기를 제공합니다.
최근 살아있는 마우스에 사용하기위한 고해상도의 내시경 시스템은 3,4 개발되었다. 처음 이러한 내시경 기술은 상처 치유 또는 장내 염증 제공 OBJ와 같은 endoluminal 대장 질환의 병리의 직접 시각화를 허용반복적 인 시점에서 동일 종의 동물 연구를 허용, 감정적, 실시간 상태. 이외에도 개별 마우스에서 반복 생검을 허용함으로써, 내시경 시스템은 또한 치료 적으로 관심 영역에 대한 물질의 직접적인 적용을 허용함으로써 구별 종양 또는 국소 염증에 영향을 미칠 수있다. 치료 및 제어 물질은 관심 영역에 직접 전달 될 수있다 더욱이,이 문제는 개인간 변동 제외한 동일한 마우스에서 수행 될 수있다. 이러한 시스템은 현재 이러한 대장염 심각도 (MEICS) 5-7의 뮤린 내시경 인덱스로 결장 염증, 상처 치유, 복강경 간 생검, 각종 점수 시스템을 사용하여 간 종양 8과 종양 발생의 동 소성 유도의 평가를 위해 사용되어왔다. 대장 벽의 비후, 혈관 패턴의 변화, 섬유소의 존재 mucos의 단위 : MEICS 염증을 평가하는 5 개의 매개 변수 구성알 표면 및 대변의 일관성.
이 프로토콜에서는 장내 상처 치유, 염증 및 결장암의 뮤린 모델에서 경질 내시경의 사용을 설명한다. 먼저, 상처 치유 및 염증의 대장 내시경 평가뿐만 아니라 대장염 활성 종 평가 및 뮤린 결장 cancerogenesis의 연구를 설명한다. 쥐 내시경의 사용 설명을 넘어, 우리는 조직 검사를 얻기 위해 내시경 장비의 사용에 대한 자세한 지침을 제공하고, 서로 다른 관심의 구성 요소 (예를 들어, 약물 후보 또는 종양 세포)의 국소 및 점막 내암 응용 프로그램입니다. 마지막으로, 우리는 대장 종양의 설정에서, 복잡한 분자 이미징 기술을 채용 뮤린 형광 내시경의 사용을 보여준다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험은 독일어 동물 보호법에 따라 Landesamt 엘리제 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz (LANUV)에 의해 승인되었다.
1 재료 및 실험 설정
- 동물 보호
- 20~25g 무게 균주의 여성 또는 남성 마우스를 사용하여 지역 동물 보호 법규에 따라이를 수용.
- 설치류에 대한 특별 차우와 마우스를 공급하고 알팔파없는 우를 적용 적어도 3 일 endoluminal 자동 형광을 최소화하기 위해 시험을에서 형광 전에.
- 멸균 마시는 임의 량의 물을 제공합니다.
- 급성 DSS 유발 성 대장염의 유도
- 물을 멸균 100 mL에 DSS의 3g을 용해시켜 용액 : 덱스 트란 황산 나트륨 (36,000-50,000 다 DSS, 분자량) (/ V w) 3 %를 준비합니다. 마우스 수의에 전용 식수로이 솔루션을 제공하고 마우스 / 일 당 DSS-용액 5 ㎖를 계산합니다. 공급 계속DSS 수의 9없이 멸균 물 ROL 마우스.
- 대장 암의 유도
- 돌연변이 azoxymethane (AOM) 용해 (암과 유전 적 손상을 일으킬 수 있음주의!) 멸균 식염수에 1 mg / ml의 최종 농도를 얻었다. 체중이 복강 1 ML의 주사기 (30 G) (10)를 사용하여 kg 당 10 mg을 AOM의 단일 용량을 적용합니다.
- 21 3퍼센트 7 일 0에서 (w / v)의 DSS, 14 일의 반복주기, 일 28-35 하루 42-49로 (제어 마우스 제외) 도전 마우스는 염증 구동 대장 cancerogenesis을 유도한다. 이들 과제 (자세한 시간 일정에 대한 그림 4A 참조) 사이에 멸균 물 쥐를 넣습니다. 실험을하는 동안 멸균 물을 제어 쥐를 넣습니다.
- 형광 내시경 검사의 준비 (FE)
- 사용 플루 오레 Isothiocyanat (FITC) - 덱스 트란 (분자량 70,000 다; FITC : 포도당 = 1 : 250)에 대한 dete이형성증 관련된 혈관 패턴의 시각 개선에 의한 대장 선종의 ction의.
- 정맥 5 분 형광 내시경 검사 전에 100 ㎕의 PBS에 희석 60 밀리그램 FITC - 복합 덱스 트란을 관리 할 수 있습니다.
- 마취
- (; 1.5-2 부피 %의 이소 플루 란 [2 - 클로로 2 - (다이 플루오 로메 톡시) -1,1,1 - 트라이 플루오로 - 에탄] 1.5 2 LO / 분보기) 이소 플루 란 마취를 위해 연속적인 공급을 제공한다. 단단히 마취를 제어하기 위해 안면 마스크와 특수 동물 용 마취 장비를 사용합니다.
- 관장의 준비
- 유체 관장 2 ㎖ 주입 (내용 : 나트륨이 수소에게 (/ w 1.5 %를 V) 및 나트륨 / v)의 와트 (11 % 인산이 수소) 결장에 중요한 배설물 적재가 의심되는 경우보기를 모호하게 할 수있다.
2 기술 장비
- 개발 및 작은 동물 내시경의 사용 승인 된 동물 내시경 워크 스테이션을 사용합니다. 우와 연결카메라 유닛, 크세논 광원, 공기 펌프 및 백색광 내시경 용 종래의 PC 모니터에 rkstation. 그런 다음 카메라와 소형 단단한 망원경 (; 그림 5 1.9 mm 외경 10cm 길이)를 연결합니다.
- 생검 겸자 또는 주입 관의 응용 프로그램에 대해 작동 채널 (그림 5D)와 내시경 칼을 사용합니다. 진단 대장 내시경 검사를위한 채널을 작동하지 않고 외피를 사용합니다.
- 사용되는 트레이서를 여기시키기 위해 형광 내시경 광원의 설정을 구성 (예를 들면, FITC-덱스 트란에 대한 공역 내지 490). 또한, 망원경 카메라 (FITC-결합 된 덱스 트란에 대한 예를 들면, 525 nm의) 사이의 적절한 대역 통과 필터를 통합 할 수 있습니다.
- 조직 검사를받을 수있는 내시경의 작업 채널을 통해 유연한 생검 겸자 (3 차르., 28cm)를 삽입합니다.
- 국소, 점막 내암의 작업 채널을 통해 유연한 주입 관 (0.96 mm)를 소개하거나를 endoluminal진단 또는 치료제의 dministration.
- 42 ° C의 온도로 가열 가능한 시험 테이블을 사용합니다. 이 마우스는 시험 기간 동안 저체온되는 것을 방지합니다.
동물의 3 마취
- 작지만 누액 방지 상자에 마우스를 놓고 이소 플루 란을 관리 (100 % (v / v)로, 5 부피 % / 분 3 L). 마우스가 의식을 잃을 때까지 기다립니다.
- 내시경 검사를위한 시험 테이블에 마우스를 전송합니다. 용량 100 %의 v / V, 1.5 부피 %, / 분 1.5 L와 얼굴에 마스크를 통해 이소 플루 란 흡입을 계속합니다. 항상 마취 동안 눈 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 반사 신경을 확인하여 마취의 효과를 평가합니다. '반사 주위에 회전을'확인 : 충분히 마취 경우, 뒷면에 누워 마우스 돌아서는 안된다. 확인 '발가락을 반사'마취 부드러운 다리의 철회 (의 단계로 이어질 안 동물의 발가락 사이에서 곤란, 적절한 때수술 허용).
4 대장 내시경 검사
- 시험 테이블에 해당 다시 / 마취 마우스 경향이 놓습니다.
- 중요한 배설물로드가보기를 가릴 수 있다는 의심되는 경우 콜론으로 놨는데 캐 뉼러를 통해 관장 2 ㎖를 관리. 마우스가 관장을 투여 한 후 배변 때까지 기다립니다. 천공을 피하기 위해 매우 조심스럽게 내시경을 삽입합니다.
- 그 중 하나는 에어 펌프에 연결되어있는 시스의 밸브를 모두 연다. 공기를 분배하기 위해 검지 손가락으로 다른 밸브를 밀봉합니다. 특히 조직 검사 또는 주사 가지 경우에, 천천히, 조심스럽게 공기와 콜론을 부풀려.
- 구멍 (항문에서 4~5cm)를 피하기 위해 오른쪽 대장의 굴곡으로 만까지 내시경을 진행합니다.
- 진단 대장 내시경 검사
- 내시경을 다시 잡아 당기면서 염증이나 악성 변화의 점막을 검사합니다. 창자의 전체 둘레를 평가하기 위해 다시 천천히 잡아 당깁니다. 관내 연평균 평가필요에 따라 적절한 설립 채점 시스템을 사용 thologies.
- 상처 영역의 반복적 인 시각화하는 동안 이미지 수집에 대해 동일 내시경의 위치를 보장하기 위해, 쥐의 항문 점막 병변 사이의 거리를 확인합니다. 또한, 내시경 화상 획득 동안에 상처 영역 사이에 동일한 거리를 달성하기 위해 스페이서로서 생검 겸자의 끝을 사용한다. 상처의 크기가 3mm를 포함 내시경 시쓰의 크기와 관련된다.
참고 : 이전 시험의 사진 문서와 광학 비교하여 동일한 위치에 배치 내시경. 각에서 같은 각도와 거리에서 측정 병변은 내시경 검사를 따릅니다.
- 생검 절차
- 이 연구자의 도움으로 조직 검사를 가져 가라. 핀셋의 선단이 제 조사자에 모니터에 표시 될 때까지 워킹 채널을 통해주의 깊게 생검 겸자를 소개한다. 신중하게 개폐 집게무효 천공.
- 병리의 사이트에 집게를 이동합니다.
- 사출 절차
- 이 연구자의 도움으로 주입 절차를 수행합니다. 완전히 제와 사전 채우기 유연한 주입 관 (0.96 mm)을 투여한다. 캐 뉼러 (30 G)이 두 번째 조사에 모니터에 표시 될 때까지 작업 채널을 통해 튜브를 밀어 넣습니다. 미세 주사기를 준비하고 조심스럽게 진단 또는 치료제의 요구 된 양을 관리 할 수 있습니다. 사출 볼륨은 50 ㎕의 최대해야한다.
- 15-30 도의 각도로 submocosa 바늘을 삽입한다. 점막의 방향으로 경사에 직면하고있다. 점막이 성공적으로 주입 후 특성 리프팅 기호를 보여줍니다.
- 형광 내시경 (FE)
- 정맥 전에 내시경 검사를 형광성 100 ㎕의 PBS에 희석 60 밀리그램 FITC - 복합 덱스 트란을 관리 할 수 있습니다.
- 주입 사이의 최적의 시점을 확인당신의 형광 표지 된 추적 및 추적 약리학에 의존하는 이미지를 만드는 절차. 사용되는 추적의 여기 및 발광 파장에 따라 대역 통과 필터 시스템의 설정을 구성합니다. 점막 표면의 혈관 패턴을 평가하기 위해 즉시 형광 염료의 정맥 내 주사 한 후 (예를 들면, FITC) 비특이적 혈액량 추적기위한 형광 내시경 검사를 수행한다.
- 배경 비율에 더 나은 목표를 제공하기 위해 타겟 추적자 또는 '스마트 프로브'가지 경우에 추적 신청 후 몇 시간 이미징 고려하십시오.
- 결과의 카메라, 비디오 문서를 수행합니다.
(5) 후 대장 내시경 검사
- 빈 새장에 마우스를 분리하고 쓰레기를 흡입에서 마우스를 보호하기 위해 종이 타월에 누워. 저체온증 않도록 redlight 램프 마우스 따뜻한. 마우스를 준수하고 충분한 회복 될 때까지 방치하지 않는다의식은 흉골 드러 누움을 유지합니다. 완전히 의식이되면, 다시 각각의 케이지에 마우스를 놓습니다.
- 그리고 작지만 누액 방지 상자 실험 도시 마우스의 끝에하면 CO 2 (100 % (v / v) 100 부피 %, 3 L / 분) 투여. 마우스가 완료 의식을 잃고 호흡이 정지 될 때까지 기다립니다. 경부 골절에 의한 파견 마우스입니다. 복부 개복술을 수행하고 콜론 이식편. 길이 방향으로 결장을 열고 더 조직 학적 또는 분자 평가를 씻는다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
장 상처 치유의 생체 모니터링에서
(;도 1a 1mm 같음) 루틴 내시경 동안 점막 상처 3 프랑스어의 직경 미니어처 생검 겸자에 의해 기계적으로 유도 하였다. 이어서, 상처 치유를 매일 내시경 검사에 의해 모니터링 및 예 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 잔류 상처 면적의 측정에 의해 정량 하였다, ImageJ에 (도 1b). 시간에 따른 개개의 상처 봉합 실제 상처 면적 / 초기 창상 면적의 몫으로 표현된다. 7 일째에 상처가 완전히 보통 (도 1C) 나았다 반면, 예를 들어, 상처 발생 후 3 일에, 상처 면적의 41 % ± 4.1 %가 회수되었다. 또한, 실험의 끝에, 상처는 생체 조직 학적 평가를 위해 절제 될 수있다. 헤 마톡 실린 및 에오신의 대표 이미지가 아르 묘사 (H & E)는 다에 상처 침대 -stainedy를 0 일 5 (그림 1D).
내시경 점막 내암을 유도 주사 치료
약학 제제의 적용 점막암 들어, 단부 (30 G)에 고정 된 캐 뉼러와 플렉시블 튜브 (0.96 mm의 직경)는, 내시경 (도 2a)의 작동 채널에 도입 하였다. 바늘 점막암 배치 후, 50 μL의 최대 조심스럽게 주입 하였다. 지표 성공 점막 내암을 응용 프로그램으로, 대장 점막의 리프팅 쉽게 (그림 2B, C) 육안으로 관찰 할 수있다.
실험 성 대장염의 생체 내 평가에서
대장염의 유도 후, 마우스는 19 %가 7 일 (도 3a)에서 발생의 체중의 최대 손실이 3 일에서 체중 감소를 보였다. 체중을 매일 측정 외에도 질병 활성은 반복적 인 내시경과 육안으로 모니터링 하였다 대장염의 심각도 (MEICS)의 쥐 내시경 인덱스에 의한 염증의 정량화. 체중 감량에 따라, MEICS 점수는 13 일 (도 3B)에서 개선 하였다 된 대장 점막의 염증성 대규모 손상을 나타내는 DSS 개시 후 7 일째에 증가 하였다. 조직 학적 손상의 생체 상관 관계를 들어, 대장 H & E 염색 부분의 염증 변화는 11 점수 Dieleman에 따라 정량 하였다. DSS 개시 후 7 일에, 조직 학적 손상이 상피 삭박에 의해 반사로 대조군에 비해 DSS 처리 된 마우스에서 유의하게 높았다, 점막 궤양뿐만 아니라 증가 된 호중구의 침윤이 크게 일 13 (그림 3C, E)로 향상되었다. 또한, 정기적으로 내시경 검사 중에 얻은 점막 생검의 조직 학적 평가가, 7 일 (도 3F-H)에서의 대장염 진행된를 확증.
약 팔십일 AOM과 DSS (도 4a)의 3주기에 의한 종양 유도 후 여러 결장 종양 (도 4C)뿐만 아니라 점막 과립 만성 염증 증상은 육안 (도 4b) (10)는 내시경 관찰되었다. H & E 염색에 의한 대장 종양의 조직 학적 평가와 함께 높은 수준의 상피내 신 생물없이 선종를 한 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, AOM-DSS-모델 (12)의 분자 발암 과정을 연구하기 위해,뿐만 아니라 새로운 진단 장치 (13)를 평가하기 위해 완벽 모델을 닮았다. 특정 분자를 대상으로 형광 이미징은 '사진 방법'(14, 15)와 생체 분자 영상에 있습니다. FE의 타당성을 입증하기 위해, 우리는 FITC, 널리 사용되는 형광 색소를 사용했다. 특정 FITC 검출 들어, 대역 통과 필터 시스템은 L과 결합광명 소스 제공 특정 여기 파장 필요 (490 nm의, 그림 4D). FITC 별 발광 파장 (525 nm의)의 정확한 검출, 제 대역 통과 필터는 카메라 헤드와, 내시경 (도 4E) 사이에 삽입 하였다. 추적 응용 프로그램없이 FE는 특정 신호 및 대장 조직이나 배설물자가 형광 (그림 4 층, G)와 어떤 상호 작용을 감지하지 않았다. 대조적으로, 즉시 정맥 응용 FITC-덱스 트란 후, 형광 색소는 대장 점막에서 관찰 될 수 있고 만성 염증의 영역 (도 4H)뿐만 아니라 악성 점막 (도 4I)에서 증가 된 혈류의 평가를 위해 사용될 수있다. 영향을받지 않는 대장 점막 (그림 4K)에 비해 따라서, 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 형광 강도의 정량화는 크게 악성 조직 내에서 형광 색소의 흡수를 증가 보였다.
= "항상"유지 - together.within 페이지> : FO "jove_content" 
상피의 그림 1 내시경 모니터링은 생체뿐만 아니라 상처 치유의 양적 및 조직 학적 평가에서 상처 치유. 대장 상처, 상처의 경계와 상처 폐쇄의 발생을 쉽게 발견 할 수 있습니다 후. 상처 영역 (흰색 화살표)을 정량적으로 상피 상처 치유를 따라 매일 추적 내시경 검사 중에 평가된다 (A - C) 생체 외, 상처 절제하고, H & 상처 치유 (D)의 조직 학적 분석을 위해 E-스테인드.. 저울이 묘사 눈금 막대에 의해 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 "FO : 콘텐츠 너비 ="다시 5 인치 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 51,875 / 51875fig2highres.jpg "너비 ="500 "/>
도 2 주사 치료 점막암 내시경 유도. 시각 제어하에, 바늘 (A)의 선단은 부드럽게 결장 점막에 배치되고, 용해 된 물질은 50 ㎕의 (B)에 주입된다. 그 후, 표시 점막 리프팅 (C)를 출혈 급성의 흔적없이 (별표)를 인식 할 수있다. 저울이 묘사 눈금 막대에 의해 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실험 DSS 대장염의 과정의 그림 3 내시경 평가. 대장염의 과정은 평가했다체중의 변화에 의해 D, 내시경 검사뿐만 아니라 염증이 대장 섹션과 내시경 생검의 조직 학적 분석. (; 배율 10 배 A, C, E), 내시경 검사 및 심한 염증 (B, D, G, H의 징후를 묘사 얻은 생검의 조직 학적 평가, 일 7시 체중 및 고급 조직 학적 손상의 대규모 손실을 줄에 배율 5 배 및 DSS 후 13 일에서 반면, 10X)은 염증성 변화가 크게 개선 하였다되었다 시작합니다. 저울이 묘사 눈금 막대에 의해 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인터넷대장 종양의 gure 4 FE. 진단을받은 만성 대장염 (B)과 다수의 endoluminal 병변 (C)를 나타내는 11주 (A), 백색광 내시경 검사를 감지 과립 점막 AOM과 순환 DSS 행정부 대장 cancerogenesis 유도 후 H & E 염색 생체 (G)에 의해 고급 상피내 신 생물로 선종. 만성 염증 (H)와 종양 (I)의 시각화를 사용하여 쉽게 할 수있는 동안 FE는 최종 종양 검출 (F, G)를 허용하지 않았다 추적 응용 프로그램없이 FITC, FE를 대상으로. 비 영향 결장 점막에 비해 따라서, 형광 강도의 정량화를 현저 계조 정보 (E, F)으로 도시 악성 조직 내에서 증가 하였다. 백색광 colonoscop 동안 형광 모드로 전환Y는, 특정 대역 통과 필터는 별도로 특정 여기 파장을 제공하는 초기 광원에 연결된다 (예를 들면, 490 nm의 FITC, D). 이 필터는 흰색 빛과 형광 모드 (D) 사이의 스위칭 (흰색 화살표)를 용이하게한다. 구체적인 발광 파장을 포착 (예를 들면, 525 nm의 FITC)는, 제 대역 통과 필터는 베이어 닛 조인트 (E)를 사용하여 내시경과 카메라 헤드 사이에 개재된다. 저울이 묘사 눈금 막대에 의해 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
내시경 작업 역의 그림 5 실험 장치. 내시경 작업 역 (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
상피 상처 치유는 계속적인 과정이라고 할 수 있습니다. 위장 점막 내의 표면 세포의 연속 생리 각질은 상피 세포 16의 빈번한 재생을 필요로 발생합니다. 따라서, 장애인 상처 치유 위장 궤양과 17 문 합부 누출 (18) 등 여러 가지 질병에 엄청난 영향을 미친다. 상피를 자극하는 분자 배경의 평가뿐만 아니라 잠재적 인 약물 후보는 불완전 19,20 체외에서의 세포 배양 시스템에서 수행 될 수있다. 따라서, 이러한 생검 겸자에 의해 정의 된 점막의 상처 세대 쥐의 대장 내시경 검사와 같은보다 정교한 실험 설정은 위장 상처 치유의 신뢰할 수있는 생체 내 평가를 활성화하고 장내 염증과 상처 치유 프로세스 간의 가능한 상호 작용을 평가하기 위해 필요하다.
또한, 주사 바늘은 L에 대해 사용될 수있다진단 염료 또는 잠재적 약물 후보의 개 지역의 점막 내암을 관리. 이 작업 채널을 통해 도입 될 수있다 단부에 고정 바늘 플렉시블 튜브 (0.96 mm의 직경)를 사용하여 달성 될 수있다. 테스트 에이전트뿐만 아니라 위약 제어가 동일 동물 내에서 분리 된 염증성 또는 종 양성 병변에 전달 될 수 있음을 감안할 때, 이러한 방식은 기존의 실험 설정에 비해 신뢰성 이점을 제공한다. 로컬 주사 상기 애플리케이션은 뮤린 결장 (21)에 동 소성 종양을 생성하기 위해 인간 또는 쥐의 종양 세포의 주입이다.
대장염의 뮤린 모델 기전을 해명뿐만 아니라 전임상 잠재적 치료제를 평가하기 위해 필요하다. 따라서, 질환 과정의 정밀한 모니터링은 매우 중요하다. 종래, 질환의 중증도와 같은 간접 보통 체중, haemoccult 테스트와 같은 파라미터뿐만 아니라 분석에 의하여 평가된다혈액과 대변의. 반면, 대장염의 심각성을 직접 결정은 종종 동물의 죽음을 필요로 조직 학적 분석 사후에 제한됩니다. 그러나, 쥐의 대장 내시경 라이브 쥐의 대장 점막의 직접적인 시각화를 제공합니다. 또한, 대장염의 기능에 대한 직접적이고 반복적 인 모니터링은 불 균질 질병 발병, 예를 들면, IL-10 결핍 마우스 또는 RAG가 결핍 된 생쥐에서 transfercolitis의 모델 실험 모델에 필수 인 할 수있다. 따라서, 대장염 쥐 내시경 지수는 점막 염증과 같은 동물의 시리얼 후속 시험의 목적 정량화 할 수 육을 설립되었습니다.
대장 암 발생의 맥락에서, 대장 내시경 검사는 여러 가지 유익한 기회를 제공합니다. 예를 들어, 비 침습적 방법을 달리 내시경 종양 크기의 생체 측정에 허용하는 첫 번째 방법은종양 번호. 또한, 특정 분자를 대상으로 형광 photoprobes의 사용은 시각화 및 분자 프로세스의 정량화 할 수 있습니다. Foersch 외 의해 수행 병진 연구. 악성 결장 점막 내 VEGF 발현의 특정 타겟팅 가능한 것으로 나타났다 병변 및 특성화 및 대장 암 (22)을 가진 인간 환자의 치료 반응의 예측에 이용 될 수있다. 또한,이 분자 영상 방식으로 인한 정보는 인간의 환자에 사용하기 위해 변환 할 수 있습니다. 이 내시경 검사시 의심되는 병변의 실시간 특성을 허용합니다. 마지막으로, 그래서 표적 병변 (23)의 측면에서 효소 적 방법에 의해 형광 물질의 활성화에 의해 이러한 트레이서의 스마트 프로브 '특이성 증가했다.
뮤린 내시경 검사를 수행 할 때, 주어진 프로토콜의 특정 단계가 특히 중요하다. 예를 들어, 다른 MO사용 균주는 마취 및 DSS 농도에 대한 감수성에 차이가 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 로컬 설정에 적응되도록 요구 될 수있다. 또한, 내시경 검사 및 쥐의 해부학의 정확한 지식을 수행하는 경험은 안전하고 목표 지향적 인 최적의 쥐 내시경 검사를 수행하는 데 필요합니다. 이 기술의 가능한 제한에 관해서는, 우리가 사용하는 내시경 시스템 따라서 멀리 오른쪽 렉셔 같은 결장 절차를 제한 경질임을 강조. 또한, FE에 적용 대부분의 형광 색소는 현재, 따라서 쥐의 연구에 사용할 수 있지만, 아직 인간의 환자에서 사용이 승인되지 않은, 안전성 프로파일에 대한 평가되고있다.
절차의 실용성에 관한 중요한 단계를 다음과 같습니다 교수실이있는 경우 (1) 다른 균주에 따라 다를 수 있습니다 유도 성 대장염을 DSS 감수성 때문에, 급성 DSS 대장염의 유도는 동물의 사망 위험을 감수 할 수 있습니다대장염의 고급 심각도. 따라서, 개개의 변형 및 사용 된 특정 DSS 배치에 가장 적합한 식별 여러 DSS 농도를 평가 고려한다. 내시경 검사는 큰 결장 내 의자 대중의 존재 어려울 수 있습니다. 중요한 찌꺼기가로드 뷰를 모호 수 것이라고 추측되면 시인성을 향상 놨는데 캐뉼라를 통해 관장 액 2 ㎖의 직장 프로그램을 사용해 이전 절차에 배변 유도. 생검 동안 높은 천공 율이 발생하면, 점막 생검을 얻기 전에 대장으로의 공기 공급을 감소시키고 지점을 닫기 전에 점막 표면 생검 겸자의 압력을 감소.
이러한 체중, 혈액 분변의 발생, 말초 혈액 또는 작성자 해부 조직 학적 분석의 분석, 단부 간접 파라미터에 의해 실험적 대장염 또는 cancerogenesis 질병의 활성을 평가하기위한 종래의 방법과는 대조적으로, 종합적oscopy 기반 기술은 시각적 인 통제하에 조직 검사를 수행 할 수있는 기회를 질병 물론 실시간 감시를 할 수 있습니다. 또한, 치유 발랐을 후보 약물의 치료 효과 생체 내에서 평가 될 수있다 상처.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 전문적인 기술 지원을 소냐 Dufentester 및 엘크 웨버 감사합니다. 우리는 의료 정보학 지원을위한 원고와 스테판 브루크너를 교정에 대한 Faekah Gohar 감사합니다. 이 작품은 그렇지-크로네 -는 Fresenius 재단 (2012_A94)에서 학제 보조금에 의해 지원되었다. D. Bettenworth 의학 학부, Westfälische Wilhelms-Universität 뮌스터에서 연구 친교에 의해 지원되었다. M. 브루크너는 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8)의 "Gerok"회전 위치에 의해 지원되었다. 우리는 마우스 만화의 그림은 헤이 케 블룸 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al.
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H.
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
