Summary
Techniques d'imagerie de petits animaux permettent examens diagnostiques de série et les interventions thérapeutiques in vivo. Récemment, le champ des applications a considérablement élargi et comprend actuellement évaluation du développement de la tumeur du côlon, la cicatrisation des plaies et la surveillance de l'inflammation. Ce protocole illustre ces diverses applications potentielles de l'endoscopie murin.
Abstract
Des modèles de souris sont largement utilisés pour étudier la pathogenèse des maladies humaines et d'évaluer les procédures de diagnostic ainsi que des interventions thérapeutiques précliniques. Cependant, l'évaluation convenable d'altérations pathologiques nécessite souvent l'analyse histologique, et lorsqu'elle est effectuée ex vivo, nécessite la mort de l'animal. Par conséquent, dans les paramètres expérimentaux classiques, les examens de suivi intra-individuelles sont rarement possible. Ainsi, le développement de l'endoscopie murin chez la souris en direct permet aux enquêteurs pour la première fois à la fois de visualiser directement la muqueuse gastro-intestinale et aussi répéter la procédure à suivre pour les modifications. De nombreuses applications pour in vivo murin endoscopie existent, y compris l'étude de l'inflammation intestinale ou la cicatrisation des plaies, obtenir des biopsies de la muqueuse à plusieurs reprises, et à administrer localement des agents diagnostiques ou thérapeutiques utilisant des cathéters d'injection miniatures. Plus récemment, l'imagerie moléculaire a étendu l'imagerie diagnostique modalités permettant la détection spécifique de molécules cibles distinctes à l'aide de fractions photosensibles spécifiques. En conclusion, l'endoscopie murin a émergé comme une technologie de pointe roman expérimental pour diagnostic en imagerie in vivo et peut avoir un impact significatif sur la recherche préclinique dans divers domaines.
Introduction
Les modèles animaux ont considérablement enrichi notre compréhension de nombreuses pathologies intestinales. La souris de laboratoire (Mus musculus) est apparue comme un modèle animal de choix dans la recherche biomédicale en raison de son information génétique et génomique abondante et est facilement disponible dans les souches transgéniques et knock-out. En plus d'améliorer la compréhension des maladies pathogenèse, les modèles animaux sont également important utilisés pour tester des médicaments candidats ainsi que des interventions diagnostiques ou thérapeutiques précliniques. Cependant, malgré la diversité des modèles de souris mimant la maladie humaine, de nombreuses options de diagnostic et d'intervention qui sont couramment utilisés dans les soins aux patients ne sont pas disponibles pour les souris. En conséquence, les stratégies de surveillance pour surveiller le cours de la maladie murine ou l'effet des interventions thérapeutiques sont souvent limitées à des observations indirectes ou poster analyse mortem. Bien que les procédures non invasives existent pour les souris de contrôle vitalité comme activité de la maladie indices, quantification de perte ou gain de poids, le sang, l'urine et les matières fécales des analyses, ce ne sont que des indicateurs indirects et sont biaisées par la variabilité inter-individuelle. En outre, les analyses post-mortem empêcher les observations longitudinales à des moments répétitifs. Techniques d'imagerie sophistiquées pour surveiller l'activité de la maladie chez les souris n'ont été que récemment introduit 1,2. Bien que ces techniques d'imagerie permettent des analyses répétitives, ils ne donnent qu'une vue descriptif et souvent imprécis sur l'intestin, ne pas permettre une visualisation directe de la muqueuse ou permettre des interventions diagnostiques ou thérapeutiques tels que l'acquisition d'une biopsie ou une application topique et intramucosale de candidats-médicaments.
Récemment, des systèmes endoscopiques à haute résolution pour une utilisation dans des souris vivantes ont été développés 3,4. Pour la première fois ces techniques endoscopiques permettent une visualisation directe des endoluminaux pathologies de maladies du côlon comme la cicatrisation et l'inflammation intestinale fournir objstatut cace, en temps réel permettant d'études longitudinales chez le même animal à des moments répétitifs. En plus de permettre des biopsies répétées en particulier une souris, des systèmes endoscopiques peuvent également être utilisés pour agir sur le plan thérapeutique d'une tumeur ou une inflammation localisée distinct en permettant une application directe de la substance de la zone d'intérêt. En outre, en tant que substances thérapeutiques et de commande peuvent être fournis directement à la zone d'intérêt, ce qui peut être réalisé de la même souris, à l'exclusion de la variabilité inter-individuelle. Ces systèmes ont été utilisés pour l'évaluation de l'inflammation du colon, la cicatrisation des plaies, des biopsies du foie laparoscopiques et induction orthotopique de tumeurs hépatiques 8 et le développement de la tumeur à l'aide de divers systèmes de marquage tel que l'indice endoscopique murin de colite gravité (MEICS) 5-7. MEICS est constitué de cinq paramètres pour évaluer l'inflammation: épaississement de la paroi du côlon, des changements de la vascularisation, de la présence de la fibrine, la granularité des Mucossurface al, et des selles de consistance.
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de l'endoscopie rigide dans des modèles murins de la cicatrisation de la plaie intestinale, l'inflammation et le cancer du côlon. Tout d'abord, nous démontrons l'évaluation endoscopique de la cicatrisation des plaies et l'inflammation du côlon, ainsi que l'évaluation de l'activité longitudinal de la colite et de l'étude de la cancérogenèse du côlon murin. Au-delà de l'usage descriptif de l'endoscopie murin, nous fournissons des instructions détaillées sur l'utilisation de l'instrumentation endoscopique pour obtenir des biopsies, et l'application topique et intramucosale des différentes composantes d'intérêt (par exemple, des candidats médicaments ou des cellules tumorales). Enfin, nous avons démontré l'utilisation de la souris endoscopie par fluorescence, qui utilise des techniques d'imagerie moléculaire sophistiquées, dans le cadre des tumeurs colorectales.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) conformément à la loi allemande de protection des animaux.
1. Matériel et configuration expérimentale
- Les soins aux animaux
- Utilisez des femmes ou des souris mâles de souche tout pesant 20 à 25 g et les héberger conformément à la législation de protection des animaux.
- Nourrir les souris avec chow spécial pour les rongeurs et appliquer nourriture sans luzerne au moins trois jours avant la fluorescence des examens afin de minimiser l'auto-fluorescence endoluminale.
- Fournir autoclave boire de l'eau ad libitum.
- L'induction de la colite induite par le DSS-aiguë
- Préparation d'un 3% (p / v) de sulfate de dextrane sodique (DSS, poids moléculaire: 36,000-50,000 Da) solution en dissolvant 3 g de DSS dans l'autoclave 100 ml d'eau. Proposer cette solution comme l'eau potable exclusif à des souris ad libitum et calculer 5 ml de solution par DSS-souris / jour. Flux suiterol souris avec de l'eau à l'autoclave sans DSS ad libitum 9.
- L'induction du cancer colorectal
- Dissoudre azoxyméthane mutagène (AOM) (ATTENTION! Peut provoquer le cancer et des dommages génétiques!) Dans une solution saline isotonique stérile pour obtenir une concentration finale de 1 mg / ml. Appliquer une dose unique de 10 mg par kg de poids AOM intra-péritonéale à l'aide d'une seringue de 1 ml (30 G) 10.
- souris de défi (à l'exclusion des souris témoins) avec des cycles répétitifs de 3% (p / v) DSS du jour 0 à 7, jour 14 à 21, 28 à 35 jours et le jour 42 à 49 pour induire inflammatoire entraîné la cancérogenèse colorectale. Nourrir les souris avec de l'eau en autoclave que entre ces défis (voir la figure 4A pour un calendrier détaillé). Nourrir les souris témoins avec de l'eau autoclavée pendant toute l'expérience.
- Préparation d'endoscopie par fluorescence (FE)
- Utilisez la fluorescéine Isothiocyanat (FITC) - dextran (poids moléculaire 70 000 Da; FITC: Glucose = 1: 250) pour detection de adénome colique par l'amélioration visuelle de modèle vasculaire de la dysplasie associée.
- Administrer 60 mg conjugué au FITC dextran dilués dans 100 ul de PBS par voie intraveineuse 5 min avant l'examen fluorescence endoscopique.
- Anesthésie
- Fournir un approvisionnement en continu de l'anesthésie à l'isoflurane (1,5 LO 2 / min, de 1,5 à 2% en volume d'isoflurane [2-chloro-2-(difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane]). Utiliser un équipement d'anesthésie vétérinaire spécial avec un masque à contrôler étroitement l'anesthésie.
- Préparation de lavement
- Instiller 2 ml de lavement liquide (contenu: hydrogénophosphate disodique 1,5% (p / v) et de sodium dihydrogénophosphate 11% (p / v)) dans le côlon si le chargement fécale importante soupçonne que peut obscurcir la vue.
2. Équipement Technique
- Utilisez un poste de travail endoscopique vétérinaire qui est élaboré et approuvé pour l'utilisation de l'endoscopie petit animal. Connectez le workstation à une unité de la caméra, une source de lumière au xénon, une pompe à air et à un moniteur de PC classique pour la lumière blanche endoscopie. Ensuite, connectez l'appareil photo et le télescope rigide miniature (diamètre extérieur 1,9 mm, 10 cm de longueur; Figure 5).
- Utilisation gaine de l'endoscope avec le canal de travail (figure 5D) pour l'application de la pince à biopsie ou tube d'injection. Utilisez la gaine sans canal de travail pour la coloscopie diagnostique.
- Configurez les paramètres de la source de lumière pour endoscopie de fluorescence pour exciter traceurs utilisés (par exemple, 490 nm pour le dextran conjugué au FITC). De plus, l'intégration d'un filtre passe-bande approprié entre le télescope et la caméra (par exemple, 525 nm pour le dextrane conjugué à FITC).
- Insérer une pince à biopsie flexibles (3, 28 Charr. Cm) à travers le canal opérateur de l'endoscope afin d'obtenir des biopsies.
- Présentez tube d'injection flexible (0,96 mm) à travers le canal de travail pour une application topique, intramucosale ou endoluminale undministration d'agents diagnostiques ou thérapeutiques.
- Utilisez une table d'examen pouvant être chauffé à une température de 42 ° C. Cela empêche les souris de devenir hypothermie lors de l'examen.
3. anesthésie des animaux
- Passer la souris dans une boîte étanche, mais petite et administrer l'isoflurane (à 100% (v / v), 5% en volume, 3 L / min). Attendez jusqu'à ce que la souris perd conscience.
- Transférer la souris sur la table d'examen pour l'endoscopie. Continuer isoflurane inhalation au masque avec une dose de 100% v / v, 1,5% en volume, de 1,5 L / min. Toujours appliquer la pommade oculaire à prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie.
- Évaluer l'efficacité de l'anesthésie en vérifiant les réflexes. Cochez la case 'tour autour réflexe: si suffisamment anesthésié, une souris portant sur son dos ne doit pas tourner autour. Vérifiez les «orteils réflexe»: quand l'anesthésie est adéquate, pincement doux entre les orteils de l'animal ne doit pas conduire à un retrait de la jambe (stade detolérance chirurgicale).
4. coloscopie
- Poser souris anesthésiée sujettes / sur le dos sur la table d'examen.
- Administrer 2 ml de lavement via une canule boutonnée dans le côlon si le chargement fécale importante soupçonne que peut obscurcir la vue. Attendez que les souris de déféquer après l'administration du lavement. Insérez l'endoscope très soigneusement pour éviter la perforation.
- Ouvrir les deux soupapes de la gaine avec l'un d'eux étant relié à la pompe à air. Sceller l'autre vanne avec votre index pour distribuer l'air. Gonflez côlon avec de l'air, lentement et avec précaution, en particulier en cas de biopsie ou d'injection.
- Endoscope avancer que dans la mesure où l'angle colique droite pour éviter la perforation (4-5 cm de l'anus).
- Coloscopie diagnostique
- Examiner la muqueuse des altérations inflammatoires ou malignes tout en tirant l'endoscope. Tirez lentement à évaluer toute la circonférence de l'intestin. Évaluer intraluminale pathologies utilisant des systèmes de notation établies appropriées, au besoin.
- Pour garantir la position endoscopique identique pour l'acquisition des images au cours de la visualisation des zones répétitives de la plaie, la distance en mètres entre l'anus et le murine lésion de la muqueuse. En outre, en utilisant la pointe de la pince à biopsie comme un espaceur pour obtenir la distance identique entre l'endoscope et la zone de la plaie au cours de l'acquisition d'image. La taille de la plaie est liée à la taille de la gaine de l'endoscope, qui comprend 3 mm.
NOTE: La place endoscope en position identique par rapport optique avec photo documentation des examens précédents. lésions de mesure dans le même angle et la distance à chaque suivi examen endoscopique.
- Procédure de biopsie
- Prenez biopsies avec l'aide de deux enquêteurs. Introduire la pince à biopsie attentivement le canal de travail jusqu'à ce que la pointe de la pince est visible sur l'écran de la deuxième enquêteur. Pinces s'ouvrent et se ferment avec soin à unperforation vide.
- Déplacer la pince vers le site de la pathologie.
- Méthode d'injection
- Exécutez la procédure d'injection à l'aide de deux enquêteurs. Pré-remplissage du tube d'injection flexible (0,96 mm) complètement avec l'agent à administrer. Poussez tube à travers le canal de travail jusqu'à ce que la canule (30 G) est visible sur l'écran de la deuxième enquêteur. Préparer l'amende seringue et administrer doucement le montant demandé de l'agent diagnostique ou thérapeutique. Les volumes d'injection doivent être 50 au maximum ul.
- Insérez l'aiguille dans la submocosa à un angle de 15-30 degrés. Face à la biseau dans le sens de la muqueuse. La muqueuse montre un signe de levage caractéristique après injection réussie.
- Endoscopie de fluorescence (FE)
- Administrer 60 mg conjugué au FITC dextran dilués dans 100 ul de PBS par voie intraveineuse avant fluorescence examen endoscopique.
- Vérifiez le moment optimal entre l'injection dele traceur marqué fluorescent, et la procédure de formation d'image qui est fonction de la pharmacologie traceur. Configurer des paramètres de système de filtre passe-bande en accord avec la longueur d'onde d'excitation et d'émission du traceur utilisé. Procéder pour l'endoscopie par fluorescence des traceurs non spécifiques volume sanguin (par exemple, FITC) immédiatement après injection intraveineuse du colorant fluorescent pour évaluer le motif vasculaire de la surface de la muqueuse.
- Considérez imagerie plusieurs heures après l'application de traceur en cas de traceurs ciblées ou «sondes intelligentes» pour fournir une meilleure cible pour background-rapport.
- Effectuer photo et vidéo documentation des résultats.
5. post-coloscopie
- Séparer la souris dans une cage vide et le poser sur une serviette en papier pour protéger la souris de l'aspiration de la litière. Réchauffez la souris avec une lampe Redlight pour éviter l'hypothermie. Observez la souris et ne pas laisser sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait retrouvé suffisammentconscience de maintenir décubitus sternal. Une fois tout à fait conscient, placez la souris vers sa cage respective.
- A la fin de l'expérience, le lieu souris dans une boîte étanche, mais petite et administrer CO 2 (100% (v / v), à 100% en volume, 3 L / min). Attendez jusqu'à ce que la souris perd conscience complète et cesse de respirer. Dispatch souris par fracture du col. Laparotomie abdominale et l'explantation du côlon. Ouvrez le côlon longitudinalement et le laver pour plus d'évaluation histologique ou moléculaire.
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Representative Results
Dans le suivi in vivo de cicatrisation intestinale
Au cours de l'endoscopie de routine, les blessures des muqueuses ont été induites mécaniquement par des pinces miniatures biopsie d'un diamètre de 3 Français (égale à 1 mm; figure 1A). Par la suite, la cicatrisation des plaies a été surveillée par des examens quotidiens endoscopiques et quantifiée par mesure de la surface résiduelle de la plaie en utilisant un logiciel d'édition d'images, par exemple, ImageJ (figure 1B). La fermeture de la plaie individu au cours du temps est exprimée par le quotient de la surface de la plaie réelle / surface de la plaie initiale. Par exemple, au jour 3 après la génération de la plaie, de 41% ± 4,1% de la surface de la plaie a été récupéré, au jour 7 alors que la plaie est généralement complètement guéri (Figure 1C). En outre, à la fin de l'expérience, les plaies peuvent être réséquées pour une évaluation histologique ex vivo. Représentés sont des images représentatives de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) -stained lits plaies à day 0 et le jour 5 (figure 1D).
Traitement par injection intra-muqueuse endoscopique guidée
Pour une application intra-muqueuse d'agents pharmacologiques, un tube flexible (diamètre de 0,96 mm) avec une canule fixée à l'extrémité (30 g) a été introduit dans le canal de travail de l'endoscope (figure 2A). Après le placement de l'aiguille intra-muqueuse, un maximum de 50 ul a été injecté avec soin. D'application indicative intramucosale succès, la levée de la muqueuse du côlon peut être facilement observée macroscopiquement (figure 2B, C).
Evaluation in vivo de colite expérimentale
Après l'induction de la colite, les souris ont montré une perte de poids de 3 jours avec une perte maximale de poids de corps de 19% se produisant à 7 jours (Figure 3A). En plus de la mesure quotidienne du poids corporel, de l'activité de la maladie a été contrôlée par endoscopie répétitifs et macroscopique quantification de l'inflammation par l'indice endoscopique murin de sévérité de la colite (MEICS). Conformément à la perte de poids corporel, le score MEICS a augmenté au jour 7 après le début DSS indiquant un dommage inflammatoire massive de la muqueuse du côlon, qui a été amélioré au jour 13 (figure 3B). Ex vivo corrélation de détérioration histologique, des altérations inflammatoires du côlon sections H & E-colorées ont été quantifiées en fonction de la Dieleman Note 11. Au jour 7 après le début DSS, dommage histologique était significativement plus élevée chez les souris DSS-traités comparés à des contrôles tels qu'ils sont exprimés par la dénudation épithéliale, ulcérations des muqueuses ainsi que augmentation de l'infiltration de neutrophiles et a été considérablement améliorées à jour 13 (figure 3C, E). En outre, l'évaluation histologique des biopsies des muqueuses, habituellement obtenus lors des examens endoscopiques, corroboré le stade avancé de la colite au jour 7 (figure 3F-H).
Environ 80 jours après l'induction de tumeurs par l'AOM et trois cycles de DSS (figure 4A), de multiples tumeurs du côlon (Figure 4C) ainsi que les signes macroscopiques de l'inflammation chronique tels que la muqueuse granulé (figure 4B) 10 ont été observées par endoscopie. L'examen histologique des tumeurs colorectales par coloration H & E a révélé adénomes avec et sans haute qualité néoplasie intra-épithéliale. Par conséquent, l'AOM-DSS-modèle ressemble à un modèle idéal pour étudier les processus moléculaires de la cancérogenèse 12, ainsi que pour évaluer les nouveaux dispositifs de diagnostic 13. imagerie de fluorescence des molécules cibles spécifiques permet à l'imagerie moléculaire in vivo avec des «méthodes photographiques» 14,15. Pour démontrer la faisabilité de FE, nous avons utilisé FITC, un fluorochrome largement utilisé. Pour la détection de FITC spécifique, un système de filtre passe-bande associé à la lsource d'ight fourni longueur d'onde d'excitation spécifiques nécessaires (490 nm; figure 4D). Pour la détection précise de la longueur d'onde d'émission spécifique au FITC (525 nm), un second filtre passe-bande est interposé entre la tête de caméra et l'endoscope (figure 4E). FE sans application de traceur ne détecte pas de signal spécifique et aucune interaction avec les tissus du côlon ou autofluorescence fécale (Figure 4F, G). En revanche, par voie intraveineuse immédiatement après l'application de FITC-dextran, le fluorochrome a pu être observée à la muqueuse du côlon et peut être utilisée pour l'évaluation de l'augmentation de la vascularisation dans les régions d'inflammation chronique (figure 4H), ainsi que la muqueuse maligne (figure 4E). Par conséquent, la quantification de l'intensité de fluorescence par un logiciel de traitement d'image a montré significativement augmenté l'absorption du fluorochrome dans le tissu malin par rapport à la muqueuse colique non affectée (figure 4K).
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Figure 1: surveillance endoscopique de la cicatrisation épithéliale in vivo ainsi que l'évaluation quantitative et histologique de la cicatrisation des plaies. Après la génération des plaies coliques, frontière de la plaie et fermeture de la plaie peut être facilement détecté. La surface de la plaie (flèches blanches) est évaluée au cours quotidiens endoscopies de suivi pour suivre quantitativement la cicatrisation épithéliale (A - C) ex vivo, les blessures ont eu une résection et H & E colorées pour l'analyse histologique de la cicatrisation des plaies (D).. Les barèmes sont définis par la barre d'échelle représenté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2 endoscopique guidée par un traitement par injection intra-muqueuse. Sous contrôle visuel, la pointe de l'aiguille (A) est doucement placé dans la muqueuse du côlon et 50 ul de substances dissoutes est injecté (B). Par la suite, la levée de la muqueuse marquée peut être reconnu (astérisque) sans aucun signe de saignement aigu (C). Les barèmes sont définis par la barre d'échelle représenté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 évaluation endoscopique du cours de DSS colite expérimentale. L'évolution de la colite était d'évaluerd par des changements dans le poids corporel, les examens endoscopiques ainsi que l'analyse histologique de sections du côlon enflammés et des biopsies endoscopiques. Conformément à la perte massive de poids corporel et les dommages histologiques avancée au jour 7 (A, C, E, grossissement 10X), les examens endoscopiques et l'évaluation histologique des biopsies des signes d'inflammation sévère (B, D, G, H représentés; grossissement 5X et 10X) alors qu'au jour 13 après DSS commencer modifications inflammatoires ont été considérablement améliorés. Les barèmes sont définis par la barre d'échelle représenté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 FE des tumeurs colorectales. Après l'induction de la cancérogenèse colorectale par OMA et de l'administration de DSS cyclique pendant 11 semaines (A), la lumière blanche endoscopie détecté muqueuse granulé indicatifs de colite chronique (B) et de nombreuses lésions endoluminaux (C) qui ont été diagnostiqués comme adénomes de haut grade néoplasie intraépithéliale par coloration H & E ex vivo (G). Bien que l'inflammation chronique de visualisation (H) et de tumeurs (I) a été facilement possible à l'aide de FITC ciblé FE, FE, sans application de traceur n'a pas permis la détection de la tumeur définitif (F, G). Par conséquent, la quantification de l'intensité de fluorescence était significativement augmentée dans les tissus malins par rapport à la muqueuse colique non affecté, représenté par les profils d'échelle de gris (E, F). Pour passer en mode de fluorescence au cours colonoscop lumière blanchey, un filtre passe-bande spécifique est en outre raccordé à la source de lumière froide pour fournir l'excitation de longueur d'onde spécifique (par exemple, 490 nm pour FITC, D). Ce filtre facilite commutation (flèche blanche) entre blancs modes de lumière et de fluorescence (D). Pour saisir la longueur d'onde d'émission spécifique (par exemple, 525 nm pour FITC), un second filtre passe-bande est interposé entre la tête de l'endoscope et caméra à l'aide d'un joint à baïonnette (E). Les barèmes sont définis par la barre d'échelle représenté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 expérimental de la station de travail endoscopique. La station de travail endoscopique (
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Discussion
Épithéliale la cicatrisation est un processus continu. Exfoliation physiologique continue de cellules de surface dans la muqueuse gastro-intestinale se produit nécessitant une régénération fréquente des cellules épithéliales 16. Par conséquent, des problèmes de cicatrisation a un immense impact sur plusieurs maladies, y compris les ulcères gastro-intestinaux et les fuites 17 d'anastomose 18. Evaluation de fond moléculaire ainsi que des médicaments candidats potentiels pour stimuler la cicatrisation de l'épithélium ne peuvent être effectuées de manière incomplète dans les systèmes de culture cellulaire in vitro 19,20. Ainsi, les montages expérimentaux plus sophistiqués tels que la coloscopie murin avec des plaies des muqueuses génération définies par une pince à biopsie sont nécessaires pour permettre une évaluation fiable in vivo de la cicatrisation des plaies gastro-intestinal et d'évaluer les interactions possibles entre l'inflammation intestinale et les processus de cicatrisation des plaies.
En outre, une aiguille d'injection peut être utilisé pour lvecinal administration de intramucosale de colorants de diagnostic ou de médicaments potentiels. Ceci peut être réalisé à l'aide d'un tube flexible (diamètre de 0,96 mm) avec une aiguille fixée à l'extrémité peut être introduite à travers le canal de travail. Étant donné que l'agent de test ainsi que le contrôle de placebo peuvent être livrés dans les lésions inflammatoires ou néoplasiques distincts dans le même animal, cette approche offre un avantage en termes de fiabilité par rapport aux paramètres expérimentaux traditionnels. Une autre application des injections locales est l'implantation de cellules tumorales humaines ou murines de générer des tumeurs orthotopiques dans le côlon de souris 21.
Les modèles murins de colite sont nécessaires pour élucider la physiopathologie ainsi que pour évaluer des agents thérapeutiques potentiels préclinique. Par conséquent, un suivi précis de l'évolution de la maladie est d'une importance capitale. Classiquement, la sévérité de la maladie est habituellement évaluée par des paramètres indirects tels que le poids corporel, le test de Haemoccult ainsi que l'analysede sang et de fèces. En revanche, la détermination directe de sévérité de la colite est souvent limitée à l'autopsie de l'analyse histologique, qui exige la mort de l'animal. Cependant, la coloscopie murin offre une visualisation directe de la muqueuse colique de souris vivantes. En outre, une surveillance directe et répétitive pour les fonctions de la colite est possible, ce qui est une condition dans des modèles expérimentaux avec l'apparition de la maladie hétérogène, par exemple, l'IL-10 souris déficientes ou dans le modèle de transfercolitis chez des souris RAG-déficient. En conséquence, un index endoscopique murin de colite a été établie 6 qui permet la quantification objective de l'inflammation des muqueuses et des examens en série de suivi du même animal.
Dans le cadre de la cancérogenèse colorectale, la coloscopie offre diverses opportunités bénéfiques. Par exemple, contrairement aux méthodes non invasives, l'endoscopie est la première approche pour permettre à la détermination in vivo de la taille des tumeurset le nombre de tumeurs. En outre, l'utilisation de molécules de ciblage photosondes fluorescents spécifiques permet la visualisation et la quantification des processus moléculaires. Dans une étude réalisée par translation Foersch et al. un ciblage spécifique de l'expression du VEGF au sein de la muqueuse du côlon malin s'est avéré possible et peut être utilisé pour la caractérisation des lésions et la prédiction de la réponse au traitement chez les patients humains atteints de cancer colorectal 22. En outre, les informations résultant de cette approche d'imagerie moléculaire peut être en mesure de traduire pour les utiliser chez les patients humains. Cela permet une caractérisation en direct des lésions suspectes pendant l'endoscopie. Enfin, dite augmentation de spécificité "sondes intelligentes" de ces traceurs par activation des fluorophores par des procédés enzymatiques au niveau du côté de la lésion ciblée 23.
Lors d'une endoscopie murin, certaines étapes du protocole donné sont particulièrement critiques. Par exemple, mo différentesouches d'utilisation diffèrent dans leur sensibilité à l'anesthésie et les concentrations DSS. Par conséquent, ce protocole peut être nécessaire pour être adaptées aux contextes locaux. En outre, l'expérience dans la réalisation d'examens endoscopiques et la connaissance exacte de l'anatomie murin est nécessaire pour effectuer l'endoscopie murin optimale qui est sûr et ciblée. En ce qui concerne les limitations possibles de cette technique, nous mettons en évidence que le système d'endoscope rigide est utilisé, ce qui limite donc la procédure pour le côlon dans la mesure où la flexion droite. En outre, la plupart des fluorochromes applicables pour FE sont actuellement en cours d'évaluation en ce qui concerne leurs profils de sécurité et, par conséquent, tout en étant disponible pour les études de souris, ne sont pas encore approuvé pour une utilisation chez des patients humains.
Ce qui suit sont des étapes cruciales concernant les modalités pratiques de la procédure: (1) depuis la susceptibilité au MAS colite induite peut varier entre les différentes souches, l'induction de la colite aiguë DSS peut risquer la mort des animaux s'il ya advbrée gravité de la colite. Par conséquent, envisager d'évaluer plusieurs concentrations SSD afin de repérer le plus approprié pour une souche individuelle et le lot de DSS spécifique utilisé. Examen endoscopique pourrait être difficile en présence de grandes masses de selles intracoliques. Induire un mouvement de l'intestin avant la procédure en utilisant l'application rectale de 2 ml de liquide de lavement via canule boutonné permettra d'améliorer la visibilité si le chargement fécale importante soupçonne que peut obscurcir la vue. Si le taux de perforation élevés se produisent au cours de la biopsie, diminuer l'alimentation en air dans le côlon avant d'obtenir des biopsies de la muqueuse et de diminuer la pression de la pince à biopsie sur la surface de la muqueuse avant de fermer les branches.
Pris dans leur ensemble, à la différence des méthodes classiques d'évaluation de l'activité de la maladie de colite expérimentale ou par cancérogenèse paramètres indirects tels que le poids corporel, l'apparition de sang dans les selles, l'analyse de sang périphérique ou d'une analyse histologique post-mortem, fintechniques basées oscopy-permettent la surveillance en direct des cours de la maladie avec la possibilité de réaliser des biopsies sous contrôle visuel. En outre, la cicatrisation et l'impact thérapeutique de candidats-médicaments administrés par voie topique peut être évaluée in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Sonja Dufentester et Elke Weber pour l'assistance technique d'experts. Nous remercions Faekah Gohar pour la relecture du manuscrit et Stefan Brückner pour le soutien de l'informatique médicale. Ce travail a été soutenu par une subvention interdisciplinaire de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth a été soutenue par une bourse de recherche de la Faculté de médecine, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner a été soutenu par une "Gerok" position de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8) de rotation. Nous remercions Heike Blum à titre d'illustration de la bande dessinée de la souris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
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