Summary
Små dyr billeddiagnostiske teknikker tillade serielle diagnostiske undersøgelser og terapeutiske interventioner in vivo. For nylig, er omfanget af ansøgninger betydeligt udvidet og omfatter i dag vurdering af colon tumor udvikling, sårheling og overvågning af betændelse. Denne protokol illustrerer disse forskellige mulige anvendelser af murine endoskopi.
Abstract
Musemodeller er almindeligt anvendt til at studere patogenesen af sygdomme, samt at evaluere diagnostiske procedurer samt terapeutiske interventioner præklinisk. Men gyldig vurdering af patologiske forandringer ofte kræver histologisk analyse, og når de udføres ex vivo, nødvendiggør dyrets død. Derfor vil der i konventionelle eksperimentelle indstillinger, er sjældent mulig intraindividuelle opfølgende undersøgelser. Således udvikling af muse endoskopi i levende mus giver efterforskere for første gang til både direkte visualisere den gastrointestinale mucosa og også gentage proceduren for at kontrollere for ændringer. Talrige anvendelser til in vivo muse endoskopi findes, herunder at studere tarmbetændelse eller sårheling, opnåelse af slimhinder biopsier gentagne gange, og til lokalt at administrere diagnostiske eller terapeutiske midler ved hjælp af miniature injektion katetre. Senest har molekylær billeddannelse udvidet diagnostisk billeddannelse modalities muliggør specifik påvisning af forskellige målmolekyler med særlige fotoprober. Sammenfattende har muse endoskopi opstået som en ny banebrydende teknologi til diagnostisk eksperimentel in vivo billeddannelse og kan få alvorlige konsekvenser på præklinisk forskning på forskellige områder.
Introduction
Dyremodeller har i høj grad beriget vores forståelse af talrige intestinale patologier. Laboratoriet mus (Mus musculus), har vist sig som en førsteklasses dyremodel i biomedicinsk forskning på grund af sin rigelige genetiske og genomisk information og er let tilgængelige i transgene og knockout-stammer. Ud over at øge forståelsen sygdom patogenese er dyremodeller også vigtigt bruges til at teste lægemiddelkandidater samt prækliniske diagnostiske eller terapeutiske indgreb. Men på trods af de mange forskellige musemodeller efterligner menneskelig sygdom, mange diagnostiske og interventionelle muligheder, der rutinemæssigt anvendes i patientbehandlingen er ikke tilgængelige for mus. Derfor tilsynsforanstaltninger strategier overvåge forløbet af murine sygdom eller effekten af terapeutiske indgreb er ofte begrænset til indirekte observationer eller post mortem analyser. Mens ikke-invasive procedurer for overvågning mus vitalitet lignende sygdom aktivitet indeks, quantification af vægttab eller gevinst, blod, urin og afføring analyser, er disse kun indirekte indikatorer og er forspændt af inter-individuel variation. Derudover post mortem analyser forhindre langsgående observationer ved gentagne tidspunkter. Avancerede billeddiagnostiske teknikker til at overvåge sygdomsaktivitet hos mus først for nylig blevet indført 1,2. Selv om disse billeddiagnostiske teknikker gør det muligt for gentagne analyser, de kun giver en beskrivende og ofte upræcise syn på tarmen, skal du ikke aktivere direkte slimhinde-visualisering eller tillade diagnostiske eller terapeutiske indgreb såsom biopsi erhvervelse eller aktuel og intramucosal anvendelse af lægemiddelkandidater.
For nylig har høj opløsning endoskopiske systemer til anvendelse i levende mus blevet udviklet 3,4. For første gang disse endoskopiske teknikker gør det muligt direkte visualisering af endoluminale colon sygdom patologier såsom sårheling eller tarmbetændelse levere objektiv, real-time status tillader langsgående studier i det samme dyr ved gentagne tidspunkter. Bortset fra at tillade gentagne biopsier i en enkelt mus, kan endoskopiske systemer også anvendes til terapeutisk at påvirke en særskilt tumor eller lokaliseret betændelse ved at tillade en direkte anvendelse af et stof til området af interesse. Desuden som terapeutiske og bekæmpelsesmidler kan leveres direkte til området af interesse, kan dette udføres i samme mus, bortset fra inter-individuel variation. Disse systemer er nu blevet anvendt til vurdering af colon inflammation, sårheling, laparoskopiske leverbiopsier og ortotopisk induktion af levertumorer 8 og tumor udvikling ved hjælp af forskellige pointsystemer, såsom det murine endoskopisk indeks colitis sværhedsgrad (MEICS) 5-7. MEICS består af fem parametre til vurdering betændelse: fortykkelse af tyktarmen væggen, ændringer i det vaskulære mønster, tilstedeværelse af fibrin, granulering af MUCOSal overflade, og afføring konsistens.
I denne protokol vi beskrive brugen af stive endoskopi i murine modeller af tarm sårheling, inflammation og tyktarmskræft. Først, vi demonstrere endoskopisk evaluering af sårheling og colon inflammation samt langsgående vurdering af colitis aktivitet og studiet af cancerogenesis i den murine kolon. Ud over den beskrivende brug af murine endoskopi, vi give detaljerede anvisninger om brugen af endoskopisk instrumentering at opnå biopsier, og den aktuelle og intramucosal anvendelse af forskellige komponenter af interesse (f.eks lægemiddelkandidater eller tumorceller). Endelig vil vi demonstrere brugen af murine fluorescens endoskopi, som beskæftiger sofistikerede molekylære billeddiagnostiske teknikker i fastsættelsen af kolorektale tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) i henhold til den tyske Animal Protection Law.
1. Materialer og forsøgsopstilling
- Animal pleje
- Brug kvindelig eller mandlig mus af en stamme, der vejer 20 til 25 g og huse dem i henhold til lokal pasning af dyr lovgivning.
- Feed mus med særlige chow til gnavere og anvende lucerne-fri chow mindst tre dage før fluorescens prøver at minimere endoluminal auto-fluorescens.
- Giv autoklaveret drikkevand ad libitum.
- Induktion af akut DSS-induceret colitis
- Der fremstilles en 3% (w / v) dextransulfat-natrium (DSS, molekylvægt: 36,000-50,000 Da) opløsning ved at opløse 3 g DSS i 100 ml autoklaveret vand. Tilbyde denne løsning som den eksklusive drikkevand til mus ad libitum og beregne 5 ml DSS-opløsning pr mus / dag. Feed fortsrol mus med autoklaveret vand uden DSS ad libitum 9.
- Induktion af kolorektal cancer
- I steril isotonisk saltopløsning Opløs mutagene azoxymethan (AOM) (ADVARSEL! Kan fremkalde kræft og genetiske skader!) For at opnå en slutkoncentration på 1 mg / ml. Påfør en enkelt dosis på 10 mg AOM per kg legemsvægt intraperitonealt under anvendelse af en 1 ml sprøjte (30 G) 10.
- Challenge-mus (undtagen kontrolmus) med gentagne cyklusser af 3% (vægt / volumen) DSS fra dag 0 til 7, 14 til 21 dage fra 28 til 35 og dag 42 til 49 til at inducere inflammatorisk drevet kolorektal cancerogenesis. Foder mus med autoklaveret vand kun i mellem disse udfordringer (se figur 4A for en detaljeret tidsplan). Feed kontrol mus med autoklaveret vand under hele forsøget.
- Fremstilling af fluorescens endoskopi (FE)
- Brug Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) - dextran (molekylvægt 70.000 Da; FITC: Glukose = 1: 250) for detektion af adenom ved visuel forbedring af dysplasi tilknyttet vaskulære mønster.
- Injicer 60 mg FITC-dextran fortyndet i 100 pi PBS intravenøst 5 minutter før fluorescens endoskopisk undersøgelse.
- Anæstesi
- Giv kontinuerlig isofluran forsyning til anæstesi (1,5 LO 2 / min; 1,5-2 vol% isofluran [2-chlor-2-(difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan]). Brug særligt veterinær anæstesiapparater med en ansigtsmaske for stramt styre anæstesi.
- Fremstilling af lavement
- Inddryp 2 ml flydende klyster (indhold: dinatriumhydrogenphosphat 1,5% (w / v) og natriumdihydrogenphosphat 11% (w / v)) i tyktarmen, hvis der er mistanke om en betydelig fækal belastning, der kan forstyrre udsynet.
2. Teknisk udstyr
- Brug en veterinær endoskopisk arbejdsstation, der er udviklet og godkendt til brug af små dyr endoskopi. Tilslut workstation til et kamera enhed, en xenon lyskilde, en luftpumpe og til en konventionel PC-skærm af hvidt lys endoskopi. Tilslut derefter kameraet og miniature stive teleskop (1,9 mm ydre diameter, 10 cm længde, figur 5).
- Brug endoskop kappe med arbejde kanal (figur 5D) for anvendelsen af biopsi pincet eller injektion rør. Brug hylsteret uden at arbejde kanal til diagnostisk koloskopi.
- Konfigurer indstillingerne for den lyskilde til fluorescens endoskopi at ophidse brugte sporstoffer (f.eks 490 nm for FITC-dextran). Derudover integrere en passende filter Båndpas mellem teleskopet og kameraet (fx 525 nm for FITC-dextran).
- Indsæt fleksible biopsitænger (3 Charr., 28 cm) gennem arbejde endoskopets kanal for at opnå biopsier.
- Indføre fleksible injektion rør (0,96 mm) igennem arbejdskanalen til topisk, intramucosal eller endoluminalt endministration af diagnostiske eller terapeutiske midler.
- Brug en opvarmet undersøgelse bord med en temperatur på 42 ° C. Dette forhindrer mus blive underafkølet under undersøgelsen.
3. Anæstesi af dyr
- Placer mus i en lille, men tætte kasse og administrere isofluran (100% (v / v), 5 vol%, 3 l / min). Vent musen mister bevidstheden.
- Overfør musen på undersøgelse bordet endoskopi. Fortsæt isofluran inhalering via ansigtsmaske med en dosis på 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 l / min. Påfør altid øje salve for at forhindre øjet tørhed, mens under anæstesi.
- Evaluere virkningen af anæstesi ved at kontrollere reflekser. Check "turn around Reflex: hvis de er tilstrækkeligt bedøvet, bør en mus om på ryggen ikke vende rundt. Kontroller tæer reflex ': når anæstesi er passende, blød klemme i mellem dyrenes tæer bør ikke føre til inddragelse af ben (fase afkirurgisk tolerance).
4. Koloskopi
- Lay bedøvede mus udsat / på ryggen på undersøgelse bordet.
- Indgiv 2 ml lavement via knappet kanyle ind i tyktarmen, hvis der er mistanke om en betydelig fækal belastning, som kan forstyrre udsynet. Vent for mus at defecate efter administration af lavement. Sæt endoskopet meget omhyggeligt for at undgå perforering.
- Åbn begge ventiler af hylsteret med en af dem er forbundet med luftpumpen. Forsegl anden ventil med din pegefinger til at dispensere luft. Pump kolon med luft, langsomt og forsigtigt, især i tilfælde af biopsi eller injektion.
- Advance endoskopet kun så langt som den højre colon bøjning for at undgå perforering (4-5 cm fra anus).
- Diagnostisk koloskopi
- Undersøg slimhinden for inflammatoriske eller maligne forandringer, mens du trækker tilbage endoskop. Træk langsomt tilbage at vurdere hele omkredsen af tarmen. Vurdere intraluminal pathologies ved hjælp af passende etablerede pointsystemer efter behov.
- Til at berettige identisk endoskopisk stilling til billedbehandling erhvervelse under gentagne visualiseringer af viklede områder, bemærk afstanden mellem det murine anus og slimhinden læsion. Desuden skal du bruge spidsen af biopsi pincet som spacer for at opnå ens afstand mellem endoskop og såret området under billedet erhvervelse. Såret størrelse er relateret til størrelsen af endoskopet kappe, som består af 3 mm.
BEMÆRK: Sted endoskop i ens position ved optisk sammenligning med fotodokumentation af tidligere undersøgelser. Mål læsioner i samme vinkel og afstand ved hver opfølgning endoskopisk undersøgelse.
- Biopsi procedure
- Tag biopsier ved hjælp af to efterforskere. Introducere de biopsitang omhyggeligt igennem arbejdskanalen indtil spidsen af tangen er synlig på skærmen til den anden investigator. Åbne og lukke pincet omhyggeligt til enugyldig perforering.
- Flyt pincet til stedet for patologi.
- Injektion procedure
- Udfør injektion procedure ved hjælp af to efterforskere. Pre-fill fleksibel injektion rør (0,96 mm) helt med midlet, der skal administreres. Skub røret gennem arbejdsgruppen kanal, indtil kanylen (30 g) er synlig på skærmen til den anden investigator. Forbered fint sprøjten og forsigtigt administrere det ønskede beløb af diagnostisk eller terapeutisk middel. Injektionsvolumener skal være pi højst 50.
- Stik nålen ind i submocosa i en vinkel på 15-30 grader. Face affasning i retning af slimhinden. Slimhinden viser et karakteristisk løft tegn efter vellykket injektion.
- Fluorescens endoskopi (FE)
- Administrer 60 mg FITC-konjugeret dextran fortyndet i 100 ul PBS intravenøst før fluorescens endoskopisk undersøgelse.
- Kontroller optimale tidspunkt mellem injektion afdin fluorescensmærket sporstof og imagografiproceduren som er afhængig af sporstof farmakologi. Konfiguration indstillinger båndpasfilter systemet i overensstemmelse med excitation og emission bølgelængde anvendte sporstof. Udfør fluorescens endoskopi for ikke-specifikke blodvolumen sporstoffer (fx FITC) straks efter intravenøs injektion af det fluorescerende farvestof for at vurdere det vaskulære mønster af slimhindeoverfladen.
- Overvej imaging flere timer efter sporstof anvendelse i tilfælde af målrettede sporstoffer eller »intelligente sonder 'for at give et bedre mål baggrund-ratio.
- Udfør foto- og video-dokumentation af resultaterne.
5. Post-koloskopi
- Adskil musen i en ledig bur og læg den på et stykke køkkenrulle til at beskytte musen fra aspirere kuldet. Varm musen med en redlight lampe til at forhindre hypotermi. Overhold musen og ikke efterlades uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkeligbevidsthed til at opretholde brystleje. Når de er fuldstændig bevidst at placere musens tilbage til dets respektive bur.
- Ved afslutningen af eksperimentet sted mus i en lille, men tætte kasse og administrere CO 2 (100% (v / v), 100 vol%, 3 l / min). Vent, indtil musen mister fuldstændig bevidsthed og stopper vejrtrækning. Afsendelse musen ved hals fraktur. Udfør abdominal laparotomi og eksplanteres tyktarmen. Åbn kolon langs og vaske det til yderligere histologisk eller molekylær evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo overvågning af intestinal sårheling
Under rutinemæssig endoskopi blev slimhindeirriterende sår induceret mekanisk ved miniature biopsitænger med en diameter på 3 fransk (lig med 1 mm; figur 1a). Efterfølgende blev sårheling overvåget af daglige endoskopiske undersøgelser og kvantificeres ved måling af den resterende sår området ved hjælp af et billedredigeringsprogram, f.eks ImageJ (figur 1B). Den enkelte sår lukning over tid er udtrykt ved kvotienten af faktiske sårområde / indledende sår-området. For eksempel, på dag 3 efter sår generation, 41% ± 4,1% af sårområdet blev udvundet, mens på dag 7 såret var normalt fuldstændig helet (figur 1C). Derudover, ved afslutningen af eksperimentet, sår kan resekteres til histologisk evaluering ex vivo. Afbildet er repræsentative billeder af hæmatoxylin og eosin (H & E) -stained viklede senge på day 0 og dag 5 (figur 1D).
Endoskopi-guidede intramucosal injektion terapi
Ved intramucosal anvendelse af farmakologiske midler, blev et fleksibelt rør (diameter 0,96 mm) med en kanyle fastgjort til enden (30 g) blev indført til bearbejdning endoskopets kanal (figur 2A). Efter intramucosal placering af nålen blev et maksimum på 50 pi omhyggeligt injiceres. Vejledende vellykket intramucosal ansøgning, kan ophævelse af tyktarmsslimhinden let iagttages makroskopisk (figur 2B, C).
In vivo-bedømmelse af eksperimentel colitis
Efter induktion af colitis, udviste mus vægttab fra dag 3 med maksimalt vægttab på 19% forekommende på dag 7 (figur 3A). Ud over daglig måling af legemsvægten blev sygdomsaktivitet overvåges ved gentagne røntgenbilleder og makroskopisk kvantificering af inflammation af det murine endoskopisk indeks colitis alvorlighed (MEICS). I overensstemmelse med tabet af legemsvægt blev MEICS score forhøjet på dag 7 efter DSS starten indikerer en massiv inflammatorisk beskadigelse af tyktarmsslimhinden, som blev lindres ved dag 13 (figur 3B). Til ex vivo korrelation af histologiske skader blev inflammatoriske ændringer i colon H & E-farvede snit værdi i overensstemmelse med Dieleman Score 11. På dag 7 efter DSS start, var histologisk skader betydeligt højere i DSS-behandlede mus sammenlignet med kontroller som afspejlet ved epitelial blotlægning blev ulceration af slimhinden samt øget neutrofil infiltration og væsentligt forbedret på dag 13 (figur 3C, E). Desuden histologisk evaluering af mucosale biopsier, rutinemæssigt opnået under endoskopiske undersøgelser, bekræftede på et fremskredent stadium af colitis på dag 7 (figur 3F-H).
Ca. 80 dage efter tumor-induktion af AOM og tre cyklusser af DSS (figur 4A), flere colon tumorer (figur 4C) samt makroskopiske tegn på kronisk inflammation, såsom granuleret slimhinde (figur 4B) 10 blev observeret endoskopisk. Histologisk evaluering af kolorektale tumorer af H & E farvning afslørede adenomer med og uden high-grade intraepitelialneoplasi. Derfor ligner AOM-DSS-model en perfekt model til at studere molekylære processer carcinogenese 12, såvel som til at vurdere nye diagnostiske enheder 13. Fluorescensimagografi rettet mod specifikke molekyler muliggør in vivo molekylær billeddannelse med 'fotografiske metoder «14,15. At demonstrere gennemførligheden af FE, brugte vi FITC, en udbredt fluorochrom. For specifikke FITC afsløring, et båndpasfilter system kombineret med løjre kilde forudsat specifik ekscitationsbølgelængde behov (490 nm, figur 4D). For nøjagtig detektion af FITC-specifikke emission bølgelængde (525 nm) blev et andet båndpasfilter indskudt mellem kamerahoved og endoskop (Figur 4E). FE uden sporstof ansøgning ikke afsløre nogen specifikt signal og ingen interaktion med colonvæv eller fækal autofluorescens (Figur 4F, G). I modsætning hertil umiddelbart efter intravenøs anvendelse af FITC-dextran fluorochromet kunne observeres på tyktarmens slimhinde og kan anvendes til vurdering af øget vaskularisering i regioner af kronisk inflammation (figur 4H) samt maligne mucosa (figur 4I). Derfor viste kvantificering af fluorescens intensitet med et billedredigeringsprogram software signifikant øget optagelse af fluorochromet inden malignt væv sammenlignet med ikke-afficerede kolonmucosa (Figur 4K).
"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "altid"> 
Figur 1. Endoskopisk overvågning af epitelial sårheling in vivo samt kvantitativ og histologisk vurdering af sårheling. Efter generering af colon sår, sår grænse og sårlukning let kan afsløres. Sårområdet (hvide pile) vurderes under daglige opfølgende endoskopi til kvantitativt følge epitel sårheling (A - C) ex vivo, blev sårene resekteret og H & E-farvet til histologisk analyse af sårheling (D).. Skalaer er defineret ved afbildet skala bar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ad 2 "FO: indhold-width =" 5in "src =" / filer / ftp_upload / 51875 / 51875fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Endoskopi-styret intramucosal injektionsterapi. Under visuel kontrol, er spidsen af nålen (A) sagte anbragt i tyktarmens slimhinde og 50 pi af opløste stoffer injiceres (B). Efterfølgende kan mærkes mukosa løft anerkendes (stjerne) uden tegn på akut blødning (C). Skalaer er defineret ved afbildet skala bar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Endoskopisk evaluering af forløbet af eksperimentel DSS colitis. Forløbet af colitis var evaluered ved ændringer i kropsvægt, endoskopiske undersøgelser samt histologiske analyser af betændte colon sektioner og endoskopiske biopsier. I tråd med massive tab af kropsvægt og avanceret histologiske skader på dag 7 (A, C, E, forstørrelse 10x), endoskopiske undersøgelser og histologisk vurdering af opnåede biopsier afbildede tegn på alvorlig betændelse (B, D, G, H, forstørrelse 5X og 10X), mens på dag 13 efter DSS starte inflammatoriske forandringer blev væsentligt forbedres. Skalaer er defineret ved afbildet skala bar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. FE af kolorektale tumorer. Efter induktion af kolorektal cancerogenesis af AOM og cyklisk DSS administration i 11 uger (A), hvidt lys endoskopi opdaget granuleret slimhinde vejledende af kronisk colitis (B), og talrige endoluminale læsioner (C), som blev diagnosticeret som adenomer med høj kvalitet intraepitelialneoplasi af H & E farvning ex vivo (G). Mens visualisering af kronisk inflammation (H) og tumorer (I) var let muligt ved hjælp af FE målrettet FITC FE uden sporstof ansøgning ikke tillade endelig tumordetektion (F, G). Følgelig blev kvantificering af fluorescensintensitet signifikant forøget i malignt væv sammenlignet med ikke-sygdomsramte colonmucosa, fremgår af gråskalaniveauer profiler (E, F). For at skifte til fluorescens-mode under hvidt lys colonoscopy, er en specifik båndpasfilter desuden sat i koldlyskilden at tilvejebringe specifikke ekscitationsbølgelængde (fx 490 nm for FITC, D). Dette filter letter skift (hvid pil) mellem hvidt lys og fluorescens tilstande (D). For at fange den specifikke emission bølgelængde (fx 525 nm for FITC), et andet båndpasfilter er indskudt mellem endoskop og kamerahoved hjælp af en bajonetfatning (E). Skalaer er defineret ved afbildet skala bar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Eksperimentel opsætning af endoskopisk arbejdsplads. Den endoskopiske arbejdsstation (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelial sårheling er en løbende proces. Kontinuerlig fysiologiske eksfoliering af overfladeceller inden mavetarmslimhinden opstår kræver hyppig regenerering af epitelceller 16. Derfor forringet sårheling har en enorm betydning på flere sygdomme, herunder gastrointestinale sår og 17 anastomotisk lækage 18. Evaluering af molekylære baggrund samt potentielle lægemiddelkandidater til at stimulere epitelial heling må kun ufuldstændigt udført i cellekultur systemer in vitro 19,20. Således er mere avancerede forsøgsopstillinger såsom murine koloskopi med generering af definerede mucosale sår med en biopsi pincet nødvendigt for at sikre pålidelig in vivo evaluering af mave sårheling og vurdere mulige interaktioner mellem tarmbetændelse og sårheling processer.
Desuden kan en kanyle kan anvendes til local intramucosal administration af diagnostiske farvestoffer eller potentielle lægemiddelkandidater. Dette kan opnås ved hjælp af et fleksibelt rør (diameter 0,96 mm) med en nål fastgjort til enden kan indføres gennem arbejdskanalen. Eftersom en test middel samt placebo-kontrol kan leveres i separate inflammatoriske eller neoplastiske læsioner i det samme dyr, denne fremgangsmåde giver en fordel i pålidelighed i forhold til traditionelle eksperimentelle indstillinger. En yderligere anvendelse af lokale injektioner er implantation af humane eller murine tumorceller til at generere ortotopisk tumorer i det murine colon 21.
Murine modeller af colitis er nødvendige for at belyse patofysiologi samt at vurdere de potentielle terapeutiske midler i prækliniske undersøgelser. Derfor nøjagtig overvågning af sygdomsforløbet er af allerstørste betydning. Konventionelt sygdommens sværhedsgrad vurderes normalt ved indirekte parametre som kropsvægt, haemoccult test samt analyseaf blod og fæces. I modsætning hertil er direkte bestemmelse af colitis sværhedsgraden ofte begrænset til histologisk analyse post mortem, som kræver, at dyret dør. Imidlertid murint koloskopi tilbyder en direkte visualisering af tyktarmsslimhinden af levende mus. Desuden direkte og gentagne overvågning af træk ved colitis er muligt, hvilket er en forudsætning i eksperimentelle modeller med uhomogen sygdomsstart fx IL-10-deficiente mus eller i modellen af transfercolitis i RAG-mangel mus. Derfor har en muse endoskopisk indeks for colitis blevet etableret 6, som muliggør objektiv kvantificering af slimhindeinflammation og serielle opfølgende undersøgelser af det samme dyr.
I forbindelse med kolorektal carcinogenese, koloskopi tilbyder forskellige fordelagtige muligheder. For eksempel, i modsætning til ikke-invasive metoder, endoskopi er den første fremgangsmåde for at tillade in vivo bestemmelse af tumorstørrelseog tumor-numre. Desuden er brugen af fluorescerende fotoprober rettet mod specifikke molekyler muliggør visualisering og kvantificering af molekylære processer. I en translationel undersøgelse foretaget af Foersch et al. specifik målretning af VEGF-ekspression i malign kolonmucosa viste sig at være gennemførlige og kan anvendes til karakterisering af læsioner og forudsigelse af behandlingsrespons i humane patienter med kolorektal cancer 22. Endvidere kan oplysningerne fra denne molekylær billeddannelse tilgang kunne oversættes til brug i humane patienter. Dette ville muliggøre levende karakterisering af mistænkelige læsioner under endoskopi. Endelig såkaldte »smart sonder 'stigning specificitet af disse sporstoffer ved aktivering af fluoroforerne ved enzymatiske processer ved siden af mållæsionen 23.
Ved udførelse af murin endoskopi, visse trin i given protokol er særligt kritiske. For eksempel, forskellige mobrug stammer forskellige i deres følsomhed over for anæstesi og DSS koncentrationer. Derfor kan det være nødvendigt denne protokol, der skal tilpasses de lokale indstillinger. Endvidere er erfaring i at udføre endoskopiske undersøgelser og præcis viden om murine anatomi kræves for at udføre en optimal murine endoskopi, der er sikkert og målrettet. Med hensyn til eventuelle begrænsninger i denne teknik, vi understrege, at endoskopet system, der anvendes, er stive, derfor så vidt den rigtige bøjning begrænse proceduren til tyktarmen. Desuden har de fleste fluorochromer gælder for FE er i øjeblikket ved at blive evalueret med hensyn til deres sikkerhedsmæssige profiler, og derfor mens rådighed for murine studier er endnu ikke godkendt til brug i humane patienter.
Følgende er vigtige skridt vedrørende de praktiske aspekter af proceduren: (1) Siden modtagelighed for DSS induceret colitis kan variere mellem forskellige stammer, kan induktion af akut DSS colitis risikerer dyrenes død, hvis der er advceret sværhedsgraden af colitis. Derfor overveje at evaluere en række DSS koncentrationer for at identificere den mest egnet til en individuel belastning og den specifikke DSS parti anvendes. Endoskopisk undersøgelse kan være svært i tilstedeværelsen af store intracolon afføring masserne. Induktion afføring forud for proceduren ved hjælp af rektal anvendelse af 2 ml lavement væske via knappet kanyle vil forbedre synligheden, hvis der er mistanke om en betydelig fækal belastning, som kan forstyrre udsynet. Hvis der opstår høje perforation satser i biopsi, mindske lufttilførslen ind i tyktarmen, før de får mucosale biopsier og mindske presset fra biopsi pincet på slimhindeoverfladen før lukning grenene.
Taget sammen, i modsætning til traditionelle fremgangsmåder til vurdering af sygdomsaktivitet af eksperimentel colitis eller cancerogenesis ved indirekte parametre, såsom legemsvægt, forekomsten af fækalt blod analyse af perifert blod eller post mortem-histologisk analyse, endeoscopy-baserede teknikker muliggøre levende overvågning af sygdom kursus med mulighed for at udføre biopsier under visuel kontrol. Desuden sårheling og terapeutisk virkning af topisk påførte lægemiddelkandidater kan vurderes in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Sonja Dufentester og Elke Weber ekspert teknisk bistand. Vi takker Faekah Gohar for korrekturlæsning af manuskriptet og Stefan Brückner for medicinsk informatik støtte. Dette arbejde blev støttet af en tværfaglig bevilling fra Else-krone-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth blev understøttet af en forskningsstipendiat fra Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner blev understøttet af en "Gerok" Drejeplan af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Vi takker Heike Blum til illustration af musen tegneserie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al.
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H.
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
