小鼠内窥镜检查技术 在体 内 癌症发生的多模态成像及肠道伤口愈合与炎症评估

摘要

小型动物成像技术可实现活体内的连续诊断检查和治疗干预。in vivo。近年来，其应用范围显著扩大，目前已包括结肠肿瘤发育评估、伤口愈合以及炎症监测。本方案展示了小鼠内窥镜的这些多样化潜在应用。

摘要

小鼠模型被广泛用于研究人类疾病的发病机制，并在临床前阶段评估诊断方法以及治疗干预措施。然而，对病理改变的有效评估通常需要进行组织学分析，而当分析执行时 离体 需要牺牲动物，因此在传统实验条件下，个体内部的随访检查很少能够实现。因此，小鼠内窥镜技术的发展在 活体 小鼠使研究人员首次能够直接观察胃肠道黏膜，并可重复进行该操作以监测其变化。该技术具有多种应用前景。 体内 小鼠内窥镜技术已存在，可用于研究肠道炎症或伤口愈合过程、反复获取黏膜活检样本，以及利用微型注射导管局部给予诊断或治疗试剂。最近，分子成像技术进一步拓展了诊断性影像模式，可通过特异性光探针实现对特定靶分子的精准检测。总之，小鼠内窥镜已成为诊断性实验研究中一种新兴的前沿技术 体内 成像技术可能对各个领域的临床前研究产生重大影响。

引言

动物模型极大地丰富了我们对多种肠道病理机制的理解。实验室小鼠（Mus musculus小鼠因其丰富的遗传和基因组信息，以及易于获得的转基因和基因敲除品系，已成为生物医学研究中的首选动物模型。除了有助于深入理解疾病发病机制外，动物模型还广泛用于药物候选物以及临床前诊断或治疗干预措施的测试。然而，尽管存在多种模拟人类疾病的鼠类模型，许多在临床诊疗中常规使用的方法在小鼠中却无法应用。因此，用于监测小鼠疾病进展或评估治疗干预效果的监测策略通常仅限于间接观察或 死后 分析。尽管存在一些非侵入性方法可用于监测小鼠的生命体征，例如疾病活动指数、体重增减的量化、血液、尿液和粪便分析，但这些仅为间接指标，且易受个体间变异性的干扰。此外， 死后 分析方法阻碍了在重复时间点进行纵向观察。用于监测小鼠疾病活动的复杂成像技术最近才被引入 ^1,2尽管这些成像技术能够实现重复分析，但仅能提供对肠道的描述性且常不精确的观察结果，无法实现黏膜的直接可视化，也不能进行活检取样或药物候选物的局部及黏膜内应用等诊断或治疗性干预。

近年来，已开发出用于活体小鼠的高分辨率内窥镜系统^3,4。这些内窥镜技术首次实现了对结肠腔内疾病病理的直接可视化观察，例如伤口愈合或肠道炎症，可提供客观、实时的状态评估，从而能够在同一只动物身上进行多次时间点的纵向研究。除了可在单只小鼠中重复进行活检外，内窥镜系统还可通过将物质直接施用于目标区域....

方案

所有动物实验均根据德国动物保护法，经自然、环境与消费者保护局（LANUV）批准。

1. 材料与实验设置

1. 动物护理
   1. 使用任何品系、体重为20至25克的雌性或雄性小鼠，并根据当地动物护理法规进行饲养。
   2. 在进行荧光检测前至少三天，给小鼠饲喂专用的无苜蓿啮齿类动物饲料，以减少管腔内的自发荧光。
   3. 提供经高压灭菌的饮用水 随意.
2. 急性DSS诱导性结肠炎的诱导
   1. 配制3%（w/v）葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量：36,000–50,000 Da）溶液，即将3 g DSS溶解于100 ml高压灭菌水中。将此溶液作为小鼠唯一的饮用水提供。 随意 按每只小鼠每天5 ml计算DSS溶液的用量。对照组小鼠饲喂不含DSS的高压灭菌水 随意摄取⁹.
3. 结直肠癌的诱导
   1. 将致突变剂偶氮甲烷（AOM）（注意！可能致癌并造成遗传损伤！）溶解于无菌等渗盐水中，配制成终浓度为1 mg/ml的溶液。使用1 ml注射器（30 G）经腹腔注射给予每公斤体重10 mg的单次剂量AOM。¹⁰.
   2. 从第0天到第7天、第14天到第21天、第28天到第35天以及第42天到第49天，对小鼠（....

结果

在体 肠道伤口愈合的监测
在常规内镜检查过程中，使用直径为3法式（相当于1 mm）的微型活检钳通过机械方式诱导产生黏膜伤口； 图1A随后通过每日内镜检查监测伤口愈合情况，并利用图像编辑软件测量残留伤口面积以进行量化分析。 例如， ImageJ图1B）。单个伤口随时间的闭合情况以实际伤口面积与初始伤口面积的比值表示。例如，在造伤后第3天，伤口面积恢复了41% ± 4.1%，而在第7天时伤口通常已完全愈合（图1C此外，在实验结束时，可将伤口切除以进行组织学评估 离体. 图示为苏木精-伊红（H&E）染色的代表性图像&E）染色的创面床在第0天和第5天（图1D).

内镜引导下黏膜内注射治疗
为进行药物的黏膜内给药，将一根带有固定于末端的套管（30 G）的柔性导管（直径 0.96 m.......

讨论

上皮伤口愈合是一个持续进行的过程。胃肠道黏膜表层细胞不断发生生理性脱落，需要上皮细胞频繁再生。 ¹⁶因此，伤口愈合受损对多种疾病具有重大影响，包括胃肠道溃疡和 ¹⁷ 吻合口漏 ¹⁸分子背景评估以及潜在药物候选物对上皮愈合的促进作用，仅通过细胞培养系统进行研究可能并不充分 体外^19,20因此，需要更复杂的实验装置，例如使用活检钳制造明确黏膜损伤的小鼠结肠镜检查，以实现可靠的 体内 评估胃肠道伤口愈合情况，并探究肠道炎症与伤口愈合过程之间可能存在的相互作用。

此外，可使用注射针头对诊断性染料或潜在药物候选物进行局部黏膜内给药。可通过工作通道插入一根末端固定有针头的软管（直径为0.96 mm）来实现该操作。由于可在同一动物的不同炎症或肿瘤病灶内分别给予试验药物及安慰剂对照，因此该方法相较于传统实验设置具有更高的可靠性优势。局部注射的另一应用是植入人源或小鼠肿瘤细胞，以在小鼠结肠内建立原位肿瘤模型²¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
无苜蓿饮食	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
偶氮甲烷（AOM）	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A5486
Bepanthen 眼膏	Bayer, Leverkusen, Germany	80469764
硫酸葡聚糖钠（DSS）	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
伊红	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 4382
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Falcon 管 50 ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070
Florene 100 V/V	Abbott, Wiesbaden, Germany	B506
苏木精	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	HHS32-1L
异戊烷（2-甲基丁烷）	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	M32631-1L
亚甲蓝	Merck, Darmstadt, Germany	1159430025
O.C.T. Tissue Tek 包埋剂	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583
Omnican F - 套管	Braun, Melsungen, Germany	9161502
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza, Verviers, Belgium	4629
氯化钠 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
标准饮食	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek 冷冻模具	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Vitro – Clud	R. Langenbrinck, Teningen, Germany	04-0002
设备
AIDA 控制系统	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20 096020
带通滤光片	Semrock, Rochester, USA	HC 716/40
带通滤光片	Semrock, Rochester, USA	HC 809/81
活检钳，3 Fr.，28 cm	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	61071ZJ
Dell 显示器	Dell, Frankfurt am Main, Germany	U2412Mb
检查鞘管，9 Fr.	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	61029D
检查鞘管，9 Fr.	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	61029C
光纤导光缆，3.5 mm	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	69495NL
荧光素蓝滤光系统	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20100032
荧光素阻断滤光片	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20100033
脚踏开关	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20010430
HOPKINS 望远镜，1.9 mm，长度 10 cm	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	1830231
SCB D-light P	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20 133720
SCB tricam SL II	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20 2230 20
VETPUMP II 仪器管路套装	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	69811
Tricam PDD PAL	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	20221037
UniVet Porta	Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany	BKGM 0451
Vetpump 2	Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany	69321620