Summary
Klein dier beeldvormende technieken laten seriële diagnostische onderzoeken en therapeutische interventies in vivo. Onlangs heeft de reikwijdte van de toepassingen aanzienlijk verbreed en omvat momenteel de beoordeling van het colon tumor ontwikkeling, wondgenezing en de monitoring van de ontsteking. Dit protocol illustreert deze diverse mogelijke toepassingen van muizen endoscopie.
Abstract
Muismodellen zijn op grote schaal gebruikt voor pathogenese van menselijke ziekten te bestuderen en diagnostische procedures en therapeutische interventies preklinisch evalueren. Echter, deugdelijke bepaling van pathologische veranderingen vereist vaak histologische analyse, en als ex vivo uitgevoerd, vereisen dood van het dier. Daarom wordt in conventionele experimentele instellingen, intra-individuele follow-up onderzoeken zijn zelden mogelijk. Aldus ontwikkeling van muizen endoscopie in levende muizen kunnen onderzoekers voor het eerst zowel direct visualiseren de maag mucosa en ook herhaal de procedure te controleren op wijzigingen. Tal van toepassingen voor in vivo muizen endoscopie bestaan, waaronder het bestuderen van intestinale ontsteking of wondgenezing, het verkrijgen van mucosale biopten herhaaldelijk, en lokaal toe te dienen diagnostische of therapeutische middelen met behulp van miniatuur injectie katheters. Onlangs heeft moleculaire beeldvorming uitgebreid diagnostische beeldvorming modalities om specifieke detectie van afzonderlijke doelmoleculen met specifieke photoprobes. De conclusie is dat muizen endoscopie ontpopt als een nieuwe cutting-edge technologie voor diagnostische experimentele in vivo beeldvorming en kan een aanzienlijke impact hebben op preklinisch onderzoek op diverse terreinen.
Introduction
Diermodellen zijn sterk verrijkt ons begrip van talrijke intestinale pathologieën. Het laboratorium muis (Mus musculus) heeft zich als eerste diermodel in biomedisch onderzoek vanwege de overvloedige genetische en genomische informatie en is direct beschikbaar in transgene en knockout stammen. Naast de verbetering van het begrip ziekte pathogenese, zijn diermodellen ook belangrijker is gebruikt voor het testen van kandidaat-geneesmiddelen evenals preklinische diagnostische of therapeutische ingrepen. Ondanks de verschillende muismodellen nabootsen menselijke ziekten, vele diagnostische en interventionele opties die routinematig worden gebruikt in patiëntenzorg zijn niet beschikbaar voor muizen. Dienovereenkomstig surveillance strategieën om het toezicht op de gang van muizen ziekte of het effect van therapeutische interventies zijn vaak beperkt tot indirecte waarnemingen of post mortem analyses. Terwijl niet-invasieve procedures zijn voor de controle muizen vitaliteit zoals de ziekte-activiteit indices, quantification van gewicht verlies of winst, bloed, urine en ontlasting analyseert, dit zijn slechts indirecte indicatoren en worden beïnvloed door de inter-individuele variabiliteit. Bovendien, post mortem analyse voorkomen longitudinale observaties op repetitieve tijdstippen. Geavanceerde beeldvormende technieken om de ziekte in muizen zijn pas recentelijk geïntroduceerd 1,2 bewaken. Hoewel deze beeldvormende technieken maken voor herhaalde analyses, ze bieden alleen een beschrijvende en vaak onnauwkeurige uitzicht op de darmen, niet in staat directe mucosale visualisatie of toestaan diagnostische of therapeutische interventies, zoals biopsie verwerving of actueel en intramucosaal toepassing van kandidaat-geneesmiddelen.
Recent zijn hoge-resolutie endoscopische voor toepassing in levende muizen ontwikkeld 3,4. Voor het eerst deze endoscopische technieken maken directe visualisatie van endoluminale colonaandoeningen pathologieën zoals wondgenezing of darmontsteking verschaffen objectief, real-time status waardoor longitudinale studies in hetzelfde dier op zich herhalende tijdstippen. Naast waardoor herhaalde biopsies per individu muis kan endoscopische systemen ook worden gebruikt om therapeutisch te beïnvloeden een afzonderlijke tumor of lokale ontsteking aangezien rechtstreekse toepassing van een stof aan het interessegebied. Zoals therapeutische en controlestoffen direct naar aandachtsgebied kan worden geleverd, kan worden uitgevoerd in dezelfde muis, behalve interindividuele variabiliteit. Deze systemen zijn nu gebruikt voor de beoordeling van colon ontsteking, wondheling, laparoscopische leverbiopsie en orthotope inductie van levertumoren 8 en tumorontwikkeling met verschillende scoresysteem zoals muizen endoscopische index van colitis ernst (MEICS) 5-7. MEICS bestaat uit vijf parameters inflammatie: verdikking van de darmwand, veranderingen van de vasculaire patroon, aanwezigheid van fibrine, granulariteit van de Mucosal oppervlak, en ontlasting consistentie.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van starre endoscopie in muismodellen van intestinale wondgenezing, ontsteking en colonkanker. Ten eerste tonen we de endoscopische beoordeling van wondgenezing en ontsteking colon en longitudinale beoordeling van colitis activiteit en de studie van cancerogenesis in de murine colon. Voorbij de beschrijvende gebruik van muizen endoscopie, gedetailleerde instructies over het gebruik van endoscopische instrumenten bieden we biopsieën, en de actuele en intramucosaal toepassing van verschillende componenten van belang (bijvoorbeeld, kandidaat-geneesmiddelen of tumorcellen). Tot slot tonen we het gebruik van muizen fluorescentie-endoscopie, waarbij geavanceerde moleculaire beeldvormende technieken in dienst heeft, in de setting van colorectale tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) volgens de Duitse wet op de dierenbescherming.
1 Materialen en Experimentele Setup
- Dierenverzorging
- Gebruik vrouwelijke of mannelijke muizen van een stam met een gewicht van 20 tot 25 g en het huis aan de ter plaatse verzorging van dieren wetgeving.
- Feed muizen met speciale chow voor knaagdieren en toepassen-alfalfa gratis chow ten minste drie dagen voor de examens fluorescentie te endoluminal auto-fluorescentie te minimaliseren.
- Bieden geautoclaveerd drinkwater ad libitum.
- Inductie van acute DSS-geïnduceerde colitis
- Bereid een 3% (w / v) dextran sulfaat natrium (DSS, molecuulgewicht: 36,000-50,000 Da)-oplossing door het oplossen van 3 g DSS 100 ml geautoclaveerd water. Bieden deze oplossing als de exclusieve drinkwater aan muizen ad libitum en bereken 5 ml van de DSS-oplossing per muis / dag. Feed control muizen met geautoclaveerd water zonder DSS ad libitum 9.
- Inductie van colorectale kanker
- Ontbinden mutageen azoxymethane (AOM) (LET OP! Kan kanker en genetische schade veroorzaken!) In een steriele isotone zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml te verkrijgen. Breng een enkele dosis van 10 mg AOM per kg lichaamsgewicht intraperitoneaal met een 1 ml injectiespuit (30 G) 10.
- Challenge muizen (exclusief controlemuizen) met repetitieve cycli van 3% (w / v) DSS van dag 0 tot 7, dag 14 tot 21, dag 28 tot 35 en dag 42-49 inflammatoire aangedreven colorectale cancerogenesis induceren. Feed muizen met geautoclaveerd water alleen tussen deze uitdagingen (zie figuur 4A voor een gedetailleerd tijdschema). Feed controle muizen met geautoclaveerd water gedurende het experiment.
- Voorbereiding van fluorescentie-endoscopie (FE)
- Gebruik fluoresceïne- Isothiocyanat (FITC) - dextran (moleculair gewicht van 70.000 Da; FITC: Glucose = 1: 250) voor detectie van colonadenoom door visuele verbetering van dysplasie bijbehorende vasculaire patroon.
- Dien 60 mg FITC-geconjugeerde dextran verdund in 100 pi PBS intraveneus 5 min voordat fluorescentie endoscopisch onderzoek.
- Anesthesie
- Zorg continue isofluraan voeding voor anesthesie (1,5 LO 2 / min; 1,5-2 vol% isofluraan [2-chloor-2-(difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethaan]). Gebruik speciale veterinaire anesthesie apparatuur met een gezichtsmasker om streng te controleren, anesthesie.
- Voorbereiding van klysma
- Inboezemen 2 ml vloeistof klysma (inhoud: dinatriumwaterstoffosfaat 1,5% (w / v) en natriumdiwaterstoffosfaat 11% (w / v)) in de dikke darm als belangrijke fecale lading wordt vermoed dat kan van oordeel vertroebelen.
2 Technische apparatuur
- Gebruik een veterinair endoscopische werkstation dat is ontwikkeld en goedgekeurd voor het gebruik van kleine dieren endoscopie. Sluit de workstation een camera-unit, een xenon lichtbron, een luchtpomp en een conventionele pc-monitor voor wit licht endoscopie. Vervolgens sluit u de camera en de miniatuur stijve telescoop (1,9 mm buitendiameter, 10 cm lengte, figuur 5).
- Gebruik endoscoop schede met werkkanaal (Figuur 5D) voor de toepassing van biopsietangen of injectie buis. Gebruik de schede zonder werkkanaal voor diagnostische colonoscopie.
- Configureren van de instellingen van de lichtbron voor fluorescentie-endoscopie om gebruikte tracers prikkelen (bijvoorbeeld 490 nm voor de FITC-geconjugeerde dextran). Daarnaast integreert een passende bandpass filter tussen de telescoop en de camera (bijvoorbeeld 525 nm voor FITC-geconjugeerde dextran).
- Plaats flexibele biopsietang (3 Charr., 28 cm) door het werkkanaal van de endoscoop biopsieën.
- Breng flexibele injectiebuis (0,96 mm) door het werkkanaal voor topische, intramucosaal of een endoluminaleDMINISTRATIE van diagnostische of therapeutische middelen.
- Gebruik een verwarmbaar onderzoek tafel met een temperatuur van 42 ° C. Dit voorkomt dat muizen steeds onderkoeld tijdens het onderzoek.
3 Anesthesie van Dieren
- Plaats muis in een kleine maar dichte doos en beheren isofluraan (100% (v / v), 5 vol%, 3 L / min). Wacht tot de muis verliest het bewustzijn.
- Breng de muis op de onderzoekstafel voor endoscopie. Doorgaan isofluraan inademing via een gezichtsmasker met een dosis van 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 L / min. Altijd van toepassing oogzalf om droge ogen te voorkomen terwijl ze onder narcose.
- Evalueren effectiviteit van de anesthesie door het controleren van de reflexen. Controleer de 'turn around reflex': indien voldoende verdoofd, moet een muis tot op zijn rug niet omdraaien. Controleer de 'tenen reflex': wanneer verdoving voldoende is, zacht knijpen in tussen de tenen van het dier mag niet leiden tot intrekking van het been (stadium vanchirurgische tolerantie).
4 colonoscopie
- Leg verdoofde muis gevoelig / op zijn rug op de onderzoekstafel.
- Dien 2 ml klysma via dichtgeknoopt canule in de dikke darm als belangrijke fecale belasting wordt vermoed dat het zicht kunnen belemmeren. Wachten voor muizen om te poepen na het toedienen van het klysma. Plaats de endoscoop zeer zorgvuldig om perforatie te vermijden.
- Open beide kleppen van de mantel met een daarvan is verbonden met de luchtpomp. Sluit de andere klep met uw wijsvinger aan de lucht afgeven. Opblazen dikke darm met lucht, langzaam en voorzichtig, vooral in het geval van biopsie of injectie.
- Advance endoscoop slechts voor zover de rechter colon buiging tot perforatie (4-5 cm vanaf de anus) te vermijden.
- Diagnostische colonoscopie
- Onderzoeken het slijmvlies van inflammatoire of maligne veranderingen tijdje terug te trekken van de endoscoop. Trek langzaam de gehele omtrek van de darm te beoordelen. Beoordelen intraluminale pathologies met behulp van geschikte opgericht scoring systemen zoals vereist.
- Om identieke endoscopische positie voor het verwerven garandeert tijdens repetitieve visualisaties van de wond gebieden, let op de afstand tussen de anus en de muizen mucosale laesie. Bovendien, met de punt van de biopsietang als afstandhouder identieke afstand tussen de endoscoop en het wondgebied tijdens beeldacquisitie bereiken. De wond maat is gerelateerd aan de omvang van de endoscoop huls, waarvan 3 mm omvat.
OPMERKING: Plaats endoscoop in identieke positie met optische vergelijking met foto documentatie van eerdere onderzoeken. Meet laesies in dezelfde hoek en afstand naar elkaar opvolgen endoscopisch onderzoek.
- Biopsie procedure
- Neem biopten met de hulp van twee onderzoekers. Breng de biopsietang voorzichtig door het werkkanaal totdat de punt van de tang is zichtbaar op het beeldscherm voor het tweede onderzoeker. Open en sluit tang voorzichtig naar eenleegte perforatie.
- Verplaats een tang om de site van de pathologie.
- Injectie procedure
- Voeren injectie procedure met de hulp van twee onderzoekers. Pre-fill flexibele injectieslang (0.96 mm) volledig met het middel worden toegediend. Duw buis door het werkkanaal totdat de canule (30 G) is zichtbaar op de monitor om de tweede onderzoeker. Bereid de fijne spuit en voorzichtig beheer van het gevraagde bedrag van diagnostisch of therapeutisch middel. Injectievolumes moet 50 pl maximum.
- Steek de naald in de submocosa onder een hoek van 15-30 graden. Geconfronteerd met de schuine kant in de richting van het slijmvlies. Het slijmvlies toont een karakteristiek tillen teken na een succesvolle injectie.
- Fluorescentie-endoscopie (FE)
- Dien 60 mg FITC-geconjugeerde dextran verdund in 100 pl PBS intraveneus voor endoscopisch onderzoek fluorescentie.
- Controleer het optimale tijdstip tussen injectie vande fluorescent gelabelde tracer en imaging procedure die afhankelijk tracer farmacologie. Instellingen van bandfilter systeem te configureren in overeenstemming met excitatie en emissie golflengte van de tracer gebruikt. Voer fluorescentie endoscopie aspecifieke bloedvolume tracers (bijvoorbeeld FITC) onmiddellijk na intraveneuze injectie van de fluorescente kleurstof aan de vasculaire patroon van het slijmvliesoppervlak beoordelen.
- Overweeg beeldvorming enkele uren na tracer toepassing in geval van gerichte tracers of 'smart probes' om een beter doel voor achtergrond-verhouding bieden.
- Presteren foto-en video-documentatie van de resultaten.
5 Post-colonoscopie
- Scheid de muis in een leegstaande kooi en leg het op een stuk keukenpapier om de muis te beschermen tegen het opzuigen van het nest. Verwarm de muis met een rosse lamp om onderkoeling te voorkomen. Let op de muis en niet onbeheerd achter, totdat het voldoende is hersteldbewustzijn te borstligging behouden. Eenmaal volledig bij bewustzijn, plaats de muis terug naar zijn respectievelijke kooi.
- Eind experiment plaats muis in een kleine maar dichte doos en beheren CO 2 (100% (v / v), 100 vol%, 3 L / min). Wacht tot de muis verliest volledige bewustzijn en stopt de ademhaling. Dispatch muis door de nek breken. Voeren abdominale laparotomie en explanteren de dikke darm. Open de dikke darm in de lengte en was het voor verdere histologische of moleculaire evaluatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo opvolging van intestinale wondgenezing
Tijdens routine endoscopie werden mucosale wonden mechanisch geïnduceerd door miniatuur biopsietang met een diameter van 3 French (gelijk aan 1 mm Figuur 1A). Vervolgens werd de wondgenezing gecontroleerd door dagelijkse endoscopische onderzoeken en gekwantificeerd door het meten van de resterende wond gebied met behulp van software voor beeldbewerking, bijvoorbeeld ImageJ (Figuur 1B). De individuele wondsluiting tijd wordt uitgedrukt door het quotiënt van de werkelijke wondgebied / oorspronkelijke wond. Bijvoorbeeld op dag 3 na wond generatie, 41% ± 4,1% van het wondgebied werd gewonnen, terwijl op dag 7 de wond meestal volledig genezen (Figuur 1C). Bovendien, aan het einde van het experiment, wonden worden gereseceerd histologische evaluatie ex vivo. Afgebeeld zijn representatief beelden van hematoxyline en eosine (H & E) -stained wond bedden bij day 0 en dag 5 (figuur 1D).
-Endoscopie begeleide intramucosale injectie therapie
Voor intramucosaal toepassing van farmacologische middelen, een flexibele buis (diameter 0,96 mm) met een canule naar het einde (30 G) bevestigd werd aan het werkkanaal van de endoscoop (Figuur 2A). Na intramucosaal plaatsing van de naald, werd een maximum van 50 pl zorgvuldig geïnjecteerd. Indicatie van succesvolle darmslijmvlies toepassing, het opheffen van de colonmucosa kunnen gemakkelijk macroscopisch waargenomen (Figuur 2B, C).
In vivo evaluatie van experimentele colitis
Na inductie van colitis, muizen bleek gewichtsverlies vanaf dag 3 met maximale verlies aan lichaamsgewicht van 19% optreedt op dag 7 (Figuur 3A). Naast de dagelijkse meting van gewicht, werd ziekteactiviteit gevolgd door repeterende endoscopie en macroscopische kwantificering van ontsteking door het murine endoscopische index van colitis ernst (MEICS). In overeenstemming met het verlies van lichaamsgewicht werd MEICS score verhoogd op dag 7 na DSS start hetgeen een enorme inflammatoire beschadiging van het colon mucosa, die is verbeterd op dag 13 (Figuur 3B). Voor ex vivo correlatie van histologische schade, werden inflammatoire veranderingen van het colon H & E-gekleurde coupes gekwantificeerd volgens de Dieleman Score 11. Op dag 7 na DSS start, histologische schade was significant hoger in-DSS behandelde muizen in vergelijking met controles, zoals weerspiegeld door epitheliale denudatie, werd mucosale ulceraties alsmede een toename van de infiltratie van neutrofielen en aanzienlijk verbeterd op dag 13 (Figuur 3C, E). Daarnaast histologische evaluatie van mucosale biopten, routinematig verkregen tijdens endoscopische onderzoeken, bevestigde het gevorderde stadium van colitis op dag 7 (Figuur 3F-H).
Ongeveer 80 dagen na tumor-inductie door AOM en drie cycli van DSS (figuur 4A), verschillende colon tumoren (figuur 4C) en macroscopische verschijnselen van chronische ontsteking zoals gegranuleerde mucosa (Figuur 4B) 10 werden endoscopisch waargenomen. Histologisch onderzoek van colorectale tumoren door H & E kleuring onthulde adenomen met en zonder hoogwaardige intra-epitheliale neoplasie. Daarom is de AOM-DSS-model lijkt op een perfect model moleculaire processen van carcinogenese 12 bestuderen, alsook om nieuwe diagnostische apparaten 13 evalueren. Fluorescentie beeldvorming gericht op specifieke moleculen maakt in vivo moleculaire beeldvorming 'fotografische methoden' 14,15. Om de haalbaarheid van de FE te tonen, gebruikten we FITC, een veel gebruikte fluorchroom. Voor specifieke FITC detectie, een bandpass filter-systeem in combinatie met de lechts bron mits specifieke golflengte nodig is (490 nm; Figuur 4D). Voor een nauwkeurige detectie van FITC-specifieke emissie golflengte (525 nm), werd een tweede bandfilter geplaatst tussen de camera hoofd en de endoscoop (Figuur 4E). FE zonder tracer toepassing geen specifieke signaal en geen interactie met colon weefsel of fecale autofluorescentie (Figuur 4F, G) niet detecteren. Daarentegen, onmiddellijk na intraveneuze toediening van FITC-dextran, het fluorochroom kan worden waargenomen bij de colonmucosa en kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van verhoogde vascularisatie in gebieden van chronische ontsteking (figuur 4H) als maligne mucosa (Figuur 4I). Bijgevolg kwantificering van fluorescentie-intensiteit door een beeldbewerking vertoonden significant verhoogde opname van het fluorochroom in kwaadaardig weefsel in vergelijking met niet-aangetaste colon (figuur 4K).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figuur 1 endoscopische controle van epitheliale wondheling in vivo alsook kwantitatieve en histologische evaluatie van wondgenezing. Na generatie colon wonden, wond rand en wondsluiting gemakkelijk gedetecteerd kunnen worden. Het wondgebied (witte pijlen) wordt bepaald tijdens dagelijks follow-up endoscopies kwantitatief volgen epitheliale wondgenezing (A - C) Ex vivo, werden wonden gereseceerd en H & E gekleurde histologische analyse van wondgenezing (D).. Schalen worden gedefinieerd door afgeschilderd schaal bar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
re 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / files / ftp_upload / 51875 / 51875fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2 Endoscopie-geleide darmslijmvlies injectietherapie. Onder visuele controle, wordt de punt van de naald (A) zacht geplaatst in de colonmucosa en 50 ui van opgeloste stoffen geïnjecteerd (B). Vervolgens kan gemarkeerd mucosale heffen herkend (asterisk) zonder tekenen van acute bloeding (C). Schalen worden gedefinieerd door afgeschilderd schaal bar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Endoscopische evaluatie van het verloop van experimentele DSS colitis. Het verloop van colitis was te evaluerend door veranderingen in lichaamsgewicht, endoscopische onderzoeken en histologische analyse van ontstoken dikke secties en endoscopische biopsieën. Overeenkomstig massale verlies van lichaamsgewicht en advanced histologische schade op dag 7 (A, C, E, vergroting 10X), endoscopische onderzoeken en histologische evaluatie van biopten verkregen afgebeeld tekenen van ernstige ontsteking (B, D, G, H; vergroting 5X en 10X), terwijl op dag 13 na de DSS beginnen inflammatoire veranderingen waren aanzienlijk verbeterd. Schalen worden gedefinieerd door afgeschilderd schaal bar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Fifiguur 4 FE colorectale tumoren. Na inductie van colorectale cancerogenesis door AOM en cyclische DSS toediening gedurende 11 weken (A), wit licht endoscopie gedetecteerd gegranuleerd mucosa indicatie van chronische colitis (B) en talrijke endoluminale laesies (C) die zijn gediagnosticeerd als adenomen met hoogwaardige intraepithelial neoplasia door H & E kleuring ex vivo (G). Hoewel visualisatie van chronische ontsteking (H) en tumoren (I) was goed mogelijk middels FE gerichte FITC, FE zonder tracer toepassing heeft definitieve tumordetectie (F, G) niet mogelijk. Bijgevolg kwantificering van fluorescentie-intensiteit significant binnen kwaadaardig weefsel verhoogd in vergelijking met niet-aangetaste colon mucosa, blijkt uit grijsschaal profielen (E, F). Om over te schakelen naar de fluorescentie-modus tijdens wit licht colonoscopy is een specifiek banddoorlaatfilter bovendien aangesloten op de koud-lichtbron de specifieke excitatiegolflengte verschaffen (bijvoorbeeld 490 nm voor FITC, D). Dit filter maakt schakelen (witte pijl) tussen wit licht en fluorescentie modes (D). Om de specifieke emissiegolflengte vangen (bijvoorbeeld 525 nm voor FITC), een tweede banddoorlaatfilter is tussen endoscoop en camerakop met een bajonetsluiting (E). Schalen worden gedefinieerd door afgeschilderd schaal bar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Experimentele set-up van endoscopische werkplek. De endoscopische werkstation (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitheliale wondheling is een continu proces. Continue fysiologische afschilfering van huidcellen in de maag mucosa optreedt die regelmatig regeneratie van epitheelcellen 16. Bijgevolg verminderde wondgenezing heeft een enorme impact op een aantal ziekten, waaronder gastro-intestinale ulcera en 17 naadlekkage 18. Evaluatie van de moleculaire achtergrond als potentiële kandidaat-geneesmiddelen te epitheliale genezing te stimuleren kan slechts gedeeltelijk worden uitgevoerd in celkweek systemen in vitro 19,20. Aldus, meer geavanceerde experimentele opstellingen zoals muizen colonoscopie met het opwekken van gedefinieerde mucosale wonden door een biopsietang nodig zijn betrouwbaar in vivo evaluatie van gastrointestinale wondgenezing staat en mogelijke interacties tussen intestinale inflammatie en wondgenezingsprocessen beoordelen.
Daarnaast kan een injectienaald worden voor lokale intramucosaal toediening van diagnostische kleurstoffen of potentiële kandidaat-geneesmiddelen. Dit kan worden bereikt met een flexibele buis (diameter 0,96 mm) met een naald bevestigd aan het uiteinde kan worden ingevoerd via het werkkanaal. Aangezien een testmiddel en de placebocontrole kunnen worden geleverd in afzonderlijke inflammatoire of neoplastische laesies in hetzelfde dier deze aanpak een voordeel betrouwbaarheid in vergelijking met traditionele experimentele opstellingen. Een verdere toepassing van lokale injecties is de implantatie van menselijke of murine tumorcellen orthotope tumoren genereren in het muizen colon 21.
Murine modellen van colitis nodig pathofysiologie helderen en om potentiële therapeutische middelen preklinisch evalueren. Daarom is een nauwkeurige controle van de ziekte is natuurlijk van het grootste belang. Gewoonlijk ernst van de ziekte wordt doorgaans bepaald door indirecte parameters zoals gewicht, Haemoccult testen en analysesbloed en ontlasting. Daarentegen is directe bepaling van colitis ernst vaak beperkt tot histologisch onderzoek post mortem, die de dood van het dier vereist. Echter, muizen colonoscopie biedt een directe visualisatie van het colon mucosa van levende muizen. Bovendien directe en repetitieve controle op kenmerken van colitis worden, waardoor een vereiste in experimentele modellen met inhomogene begin van de ziekte, bijvoorbeeld IL-10 deficiënte muizen of in het model van transfercolitis in RAG-deficiënte muizen. Bijgevolg heeft een muizen endoscopische index van colitis vastgesteld 6, die objectieve kwantificering van ontsteking van de slijmvliezen en de seriële follow-up onderzoek van hetzelfde dier maakt.
In het kader van darmkanker, colonoscopie biedt verschillende voordelige mogelijkheden. Bijvoorbeeld, in tegenstelling tot niet-invasieve methoden, endoscopie is de eerste benadering om in vivo bepaling van tumorgrootteen tumor nummers. Bovendien is het gebruik van fluorescerende photoprobes gericht specifieke moleculen maakt visualisatie en kwantificering van moleculaire processen. In een translationele studie uitgevoerd door Foersch et al. specifiek richten van VEGF expressie in kwaadaardige colon bleek haalbaar en kan worden gebruikt voor laesie karakterisering en voorspelling van geneesmiddelen in menselijke patiënten met colorectaal kanker 22. Bovendien kan informatie naar aanleiding van deze moleculaire beeldvorming aanpak kunnen worden vertaald voor gebruik in menselijke patiënten. Dit zou voor live karakterisering van verdachte letsels mogelijk te maken tijdens endoscopie. Tenslotte zogenaamde "smart probes" verhoging specificiteit van de tracers door activering van de fluoroforen door enzymatische processen op de zijkant van de doellaesie 23.
Bij het uitvoeren murine endoscopie, bepaalde stappen van de gegeven protocol zijn bijzonder kritisch. Bijvoorbeeld verschillende mogebruik stammen verschillen in hun gevoeligheid voor anesthesie en DSS concentraties. Daarom is dit protocol kan nodig zijn om te worden aangepast aan de lokale instellingen. Bovendien is de ervaring in het uitvoeren van endoscopische onderzoeken en exacte kennis van de anatomie van muizen die nodig is om optimaal muizen endoscopie, dat is veilig en doelgericht uit te voeren. Voor mogelijke beperkingen van deze techniek, hebben we de endoscoop gebruikte hard is derhalve beperkt de procedure van het colon tot aan de juiste buiging. Bovendien hebben de meeste fluorchromen toepassing voor FE worden momenteel geëvalueerd met betrekking tot hun veiligheid profielen en daarom maar beschikbaar is om muizen studies, zijn nog niet goedgekeurd voor gebruik in menselijke patiënten.
De volgende zijn kritische stappen met betrekking tot de praktische aspecten van de procedure: (1) omdat de gevoeligheid voor geïnduceerde colitis kunnen variëren tussen verschillende stammen DSS, de inductie van acute DSS colitis kan de dood van de dieren riskeren als er advwichtige ernst van colitis. Daarom verhelpen evalueren DSS verscheidene concentraties te identificeren het meest geschikt voor een individuele stam en de specifieke DSS batch gebruikt. Endoscopisch onderzoek kan moeilijk in de aanwezigheid van grote intracolon ontlasting massa's. Inducerende stoelgang voorafgaand aan de procedure met behulp van rectale toepassing van 2 ml klysma vloeistof via dichtgeknoopt canule zal de zichtbaarheid verbeteren als belangrijke fecale belasting wordt vermoed dat het uitzicht kunnen belemmeren. Indien hoge perforatie frequenties tijdens biopsie optreden verlagen luchttoevoer in de colon voor het verkrijgen mucosale biopsies en verminderen de druk van de biopsietang op het slijmvliesoppervlak voor het sluiten van de takken.
Samengevat, in tegenstelling tot conventionele methoden voor de beoordeling ziekteactiviteit van experimentele colitis of cancerogenesis door indirecte parameters zoals gewicht, voorkomen van fecale bloed analyse van perifeer bloed of post mortem histologische analyse, end-oscopy gebaseerde technieken mogelijk te maken voor live monitoring van de ziekte uiteraard met de mogelijkheid om biopten te voeren onder visuele controle. Bovendien, wondgenezing en therapeutische effect van topisch geneesmiddelkandidaten kunnen in vivo worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Sonja Dufentester en Elke Weber voor deskundige technische bijstand. Wij danken Faekah Gohar voor het proeflezen van het manuscript en Stefan Brückner voor medische informatica ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een interdisciplinaire subsidie van de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Faculteit der Geneeskunde, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner werd ondersteund door een "Gerok" draai stand van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Wij danken Heike Blum ter illustratie van de muis cartoon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al.
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H.
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
