Summary
过敏性反应，其特征在于由肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化，是由交联的IgE和炎症介质的释放驱动。过敏性反应的定量评估可以用伊文思蓝染料监察过敏原刺激后改变血管通透性来实现。
Abstract
过敏性反应是肥大细胞和嗜碱性粒细胞，并随后释放血管活性和促炎介质的活化的结果。暴露于变应原的致敏个体可能会导致因不同轻微的红斑到危及生命的过敏反应临床症状。在实验室中，各种动物模型已经发展到理解驱动过敏性反应的机制。在这里，我们描述了用于测量变化，血管通透性量化局部过敏性反应的详细方法。局部过敏反应测定最早是在20世纪20年代的报道，并已改编自Kojima 等人发表的技术。在2007年1，在该试验中，敏化，以OVA小鼠左耳用车辆和在右耳用OVA激发。这后面是静脉注射伊文思蓝染料。注射伊文思蓝后十分钟，将动物安乐死，并在已渗出的染料到耳朵在一夜之间甲酰胺提取。所提取的染料的吸光率，然后定量用分光光度计。这种方法确实导致的局部过敏反应的可视化和可量化的表现。
Introduction
I型超敏反应是由IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面上的抗原诱导的交联介导的。这导致细胞脱颗粒和血管活性和炎症介质如组胺，类胰蛋白酶，和血小板活化因子2的释放。以下预成形介体的脱颗粒过程中释放细胞，肥大细胞合成和释放前列腺素和白三烯，这进一步增加血管渗透性，3。最初的临床反应迅速发生，并且被称为“直接反应”。在皮肤中，风团和耀斑响应的抗原激发分钟内很容易地看到。根据这一挑战的剂量，就可以看到一个“晚期反应”几个小时后。后期肿胀是由 于局部水肿和白细胞募集到组织2。组胺，一般被认为是主要的介体参与立即过敏性反应，作用于组胺受体1（HR1）表示对血管和组胺受体2（HR2）表达平滑肌。的联合作用增加了血流量和血管通透性在炎症4的位点。
多种过敏的动物模型已经发展为了研究参与过敏性炎症的机制，包括过敏性哮喘，全身性过敏反应，及本地过敏反应模型。静脉给药染料被用来衡量在动物模型中的局部过敏反应近一个世纪以来，随着出版物描述了这一技术可以追溯到20世纪20年代5。兔和豚鼠分别用于测试速发型超敏反应的第一个动物模型，以及最敏感的反应普遍发现在耳朵5,6。该法后来被证实为7大鼠和小鼠8使用。
从历史上看，各种实验方法已被使用，包括在注射之前，染料，染料注射之前注射抗原的注射抗原，以及同时注射的染料和抗原。静脉内给予染料作为测定过敏性反应的装置是一种多用途的测定法，它可以用于测量有源，无源，和反向被动反应的5,9。许多染料已被利用来评估过敏性反应，包括锥虫蓝，滂胺天蓝，伊文思蓝，嘉基蓝536，和印度油墨5,6,9。 0.5％伊文思蓝溶液是目前用于测定过敏性反应在皮肤上的标准染料。
挑战过敏性反应是短暂的;在10达到最大强度-染料注射15分钟，无反应是可见的，如果染料被施用多于30分钟挑战后，无论使用9的动物物种。染料外渗的定量原创LY获得通过测量风团大小的蓝色染料7-9所示。此外，脱颗粒的肥大细胞的数量可以通过从反应的部位切除的皮肤组织和甲苯胺蓝7染色来定量。肥大细胞脱颗粒经常被用来作为标记物用于皮肤，IgE介导的过敏性反应，如肥大细胞是表达高亲和力IgE受体了FcεRI主本地细胞群。分光光度技术测定染料外渗进入组织的被动皮肤过敏反应（PCA）在大鼠10和鼠标11，在20世纪90年代开发的。
以下本地过敏试验方案是改编自小岛等 。1，并利用鸡蛋卵白蛋白（OVA）作为抗原诱发过敏性反应。然而，可以使用的抗原相比OVA其他如果需要的话。该测定，然后使用伊文思蓝染料以监测变化的血管permeabilit发生由于肥大细胞的IgE交联和组胺释放年。
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Protocol
1，小鼠敏感
- 通过在1×PBS中稀释的OVA的20毫克/毫升的最终浓度制备OVA原液。冻结下在冷冻管并储存等分在-80℃下以供将来使用。
- 带来的20毫克/毫升OVA股票的一个或多个等分试样至室温。在1X PBS稀释的OVA为1毫克/毫升的最终浓度在5ml的聚苯乙烯圆底管帽。轻轻振荡混匀。
- 1的比例：在保持含有1毫克/毫升OVA上的旋涡设置在中等速度的聚苯乙烯管中，同时继续涡管，以产生1加彻底匀浆Imject明矾（40毫克/毫升）逐滴加入等体积明矾免疫原。
- 将瓶盖上的管带管的涡流。转涡旋上最低的设置，并允许OVA吸附到明矾30分钟。
- 不要让大量的时间来准备OVA /明矾和致敏小鼠之间传递。如果增感，不能直接OVA /明矾preparat后完成离子，商店OVA /明矾在室温下。旋涡使用前1分钟。
- 装入1 ml胰岛素注射器以OVA /明矾的混合物。顶盖采用27号针头的注射器。
- 注入100μl的OVA /明矾到BALB / c小鼠的腹膜为每只小鼠的50微克的OVA和2mg明矾剂量。
- 为阴性对照，致敏另一组小鼠以PBS中。制备1：明矾和PBS的混合物中同样地在上面列出，省略OVA。
- 敏感的所有小鼠（OVA和PBS对照），每周一次，连续3周，共注射3次。最后一次注射后，请等待至少2周进行局部过敏反应试验之前。
2，局部过敏反应含量
- 带来的OVA原液至室温。在1.5ml微量离心管中，稀释20毫克/毫升OVA库存到5毫克/毫升，用PBS的终浓度（1:4稀释的OVA在1X PBS）。轻轻振荡混匀。
- 麻醉采用RC 2 <老鼠/ SUP>啮齿动物麻醉系统（或类似的汽化输送系统）。填写水库异氟醚，然后打开氧气气流。小鼠放置在感应腔和异氟醚调节控制转盘至5％，开始麻醉。一旦老鼠被完全麻醉，由于缺乏流动性的指示，调整异氟烷控制转盘至3％，以维持深麻醉。麻醉在此过程的目的是为了固定所述动物。耳和尾静脉注射不会引起显著疼痛或痛苦的动物。
注：异氟醚可以让人类的生殖系统产生负面影响。请务必在通风良好的室内使用，并附上清除罐到感应室中和废气。如果您在使用异氟醚是孕妇，戴上碳滤光罩，以尽量减少风险。 - 负载10微升5毫克/毫升的OVA到3月10日CC胰岛素注射器上铺上一个31 G针。加载另一个3/10毫升的胰岛素注射器，10微升的1X PBS。
- 用解剖显微镜，注入10微升的OVA到麻醉小鼠的右耳为50微克OVA的挑战剂量。其他的剂量，例如20微克，也是可接受的。
- 为了稳定耳朵注射，包装胶带（粘性的一面朝上），围绕一个15毫升的锥形管。右耳的背侧面固定到磁带上。将针头斜面朝上两叶耳之间。慢慢地注入卵于耳组织的中心，注意不要打任何血管。
- 用上述同样的方法，注入10微升PBS中进左耳作为阴性对照。
- 等待3分钟。
- 在此期间，将鼠标的抑止住在热灯或温水浴1分钟，扩张血管的尾巴。
- 用1毫升注射器胰岛素盖有27G的针头，慢慢注入200微升0.5％伊文思蓝染料到尾vEIN鼠标。快速注入整个加入200μl之前可能破坏血管结构被施用。如果出现这种情况，试图对尾巴的相对侧染料的剩余体积注入静脉。
- 等待10分钟。
- 安乐死鼠标和删除使用镊子和手术剪两个耳朵。
- 抓耳的边缘与镊子，使得没有任何压力被施加到注射部位处的耳的中心。去除尽可能多的耳组织尽可能通过切割接近，但不通过，软骨存在于耳朵的底部的脊。少量的皮毛上可能存在的切除耳;这并不会影响该测定。
- 分装700微升甲酰胺用1.5 ml离心管中。准备每穗一管（每只小鼠两管）。
注意：甲酰胺是致畸，致突变和刺激性。戴上手套，保护眼睛和面部防护。搬运时，孕妇应谨慎使用Š甲酰胺可能是胎儿中毒。 - 添加耳甲酰胺，盖上盖子，并在干热浴中63℃孵育过夜。耳朵可能仍然会出现孵育后略带蓝色;然而大多数的染料将被提取到甲酰胺。
- 加入300μl各个样品，一式两份，向96孔板中。避免转印皮毛，如果它是存在于样品中。确保没有气泡存在于所述孔中，因为它们会影响到吸光率读数。
- 加入300μl甲酰胺中，一式两份，向96孔板中。这些孔将被用作空白。
- 用分光光度计在620nm处测量吸光度。减甲酰胺井从每个样品的读数。
注：根据批准的统一服务大学实验动物管理和使用委员会的协议进行所有的实验。
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Representative Results
已成功进行了试验动物都会有皮肤和眼睛呈现蓝色。 PBS致敏动物不应反应以PBS或OVA激发，因此两个耳朵应保持白色（ 图1A）。 OVA致敏的动物中，耳朵接收PBS挑战（左）应该是全白或在注射部位的局部的方式轻轻蓝色。耳接收OVA激发（右）应逐渐变暗的蓝色染料施用（ 图1B）之后的10分钟期间成为。
PBS致敏的动物将具有可忽略的吸光度读数为与PBS和OVA挑战（ 图2A）。对OVA致敏的动物中，注射PBS通常导致0.13的平均吸光率读数和0.04的标准偏差。相反，50微克OVA激发产生的0.58的平均吸光度读数和0.18的标准偏差（ 网络gure 2B）。在用于挑战OVA的量，如果必要，可以调整单个实验。例如，有20微克OVA激发的结果在0.30平均吸光度和0.10（ 图2C）的标准偏差，但不到20微克挑战可能不能给出可靠的结果。变化OVA浓度必须优化和使用之前进行验证。
结果可以用图形配对，用PBS吸收相比，OVA吸收。可替换地，结果可以被绘制成一个单一的值，用PBS中的吸光度从OVA吸光度为每个单独的动物中减去。
图1：在PBS和OVA致敏动物耳色素沉着。 （一）。在PBS耳色素增感型的动物。左耳（挑战用PBS）和右耳（挑战50微克OVA）显示几乎没有染料外渗（B）。耳色素沉着在OVA致敏动物。有在左耳（挑战以PBS）无过敏性反应，通过不存在的蓝色染料的外渗所指示的。右耳（挑战用50微克OVA）表示指示血管通透性增加，细胞活化中的耳组织的直接结果，一个明亮的蓝色着色。
图2：在OVA致敏动物代表的OD值在620nm处采取分光光度测量得到的OD值（A）。 50微克OVA激发的PBS致敏动物。为PBS中，OVA激发的OD值是可忽略的（B）。 50微克OVA挑战OVA致敏动物。 PBS挑战结果OD值<0.2和OVA挑战地区环境部门一道在OD值LTS> 0.3（C）。 20微克OVA挑战。 PBS挑战结果OD值<0.2。右耳朵已经略有减少，由于OVA的挑战较小剂量使用OD值。
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Discussion
许多过敏性疾病的标志物被用于评估下面的变应原激发过敏性反应，包括在气道激发的设置改变循环组胺，Th2型细胞因子的产生和细胞招募的水平进入支气管肺泡灌洗液的强度。而在这些参数监测的变化是研究过敏反应重要的是，生物标记物不总是关联与临床过敏性疾病。在本协议中所描述的地方过敏反应试验提供了本地化的血管通透性为局部过敏性疾病的一个相关可重复的测量。用蓝色染料外渗，该协议使双方的可视化和本地化的过敏反应相对定量。相反，依赖于临床评分过敏测定法，该测定法的（蓝染料外渗通过分光光度法测定吸光度）的主要成果是不容易受到观察者偏倚。另外ADVAntage是动物安乐死的挑战后不久，限制了潜在的过敏原的挑战和染料的管理造成任何不适。替代使用由秋山等人 10所述的手持式分光光度计的允许变化的血管通透性的连续测量。然而，伊文思蓝染料是有毒的，并且注射将最终导致动物的需要被实施安乐死。
虽然此法具有许多优势，但它的特点，是有点技术难度的限制。可靠的结果依赖于一致的，成功的耳和尾静脉注射。如果整个攻击剂量未给药于耳，如果耳注射导致的血管明显穿刺，或者如果伊文思蓝静脉注射是不完整的，该动物应排除分析。在我们的实验室中，研究人员不得不实行皮内注射耳的塞弗拉尔周开发能力之前。此外，对用于测定运行适当的控制是很重要的。具体而言，PBS注射应经常被用来作为内部对照，如动物似乎略有不同引起的针插入损伤作出反应。 PBS的读数表示为诱导注射本身的改变血管通透性的基线量度。代替使用皮内注射耳的，该测定也可以应用到小鼠背部皮肤。调查人员可能发现这条路线要少技术上具有挑战性，并且，此外，它允许多个抗原的同时检测。
局部过敏反应测定是非常通用的，因为攻击剂量可以根据不同的实验来操作。如果有必要看变化过敏性反应，这可能是有益的是使用较低的OVA激发剂量，例如20微克。这允许在吸光度监测变化的敏感性增加，如这将是不太可能的细胞活化的饱和点会到达。
另外，该测定可用于学习被动皮肤过敏反应（PCA）。在此设置中，抗原特异性IgE被注入到一个耳朵和车辆到其他。 24小时后，将动物给予抗原和伊文思蓝染料的静脉挑战。在PCA模型可以减少需要完成该实验中，所用动物的数量的时间，并允许调查者看的IgE交联的具体效果。
尽管需要较长时间来执行，也有一些优势，使用本文所描述的活性皮肤过敏反应（ACA）的模型。通过每周接触致敏抗原模拟由个人开发的过敏性疾病的过程中，由于过敏通常是系统性的，人们一般有两种过敏原特异性IgE和IgG抗体的循环。虽然IgE的交联是马云的主要手段ST细胞脱粒，肥大细胞也响应IgG抗体交联。因此，ACA模型允许研究人员进行调查的过敏性反应的机制，除了仅IgE介导的疾病。最后，虽然增感所用的方法是在研究者的判断，本地过敏测定法是通用的，并且可以与各种增感的方法中使用。
耳肿胀，常用的指标，以评估过敏性反应，也可以OVA激发后测量。我们已发现，耳挑战以OVA具有比耳挑战用PBS在1小时后喷射显著更加膨胀。与此相反的伊文思蓝的试验，我们已经观察到耳厚度测量比染料外渗并呈现研究者之间更大的可变性作为耳厚度可通过耳朵的压缩使用的测量设备时，可以改变较不敏感。
小鼠品系比其他BALB / c小鼠可用于局部过敏反应测定;然而吸光度读数会略有不同取决于所使用的菌株。因为他们的倾向发展强Th2应答的，BALB / c小鼠通常产生可靠的，可重复的读数与该测定。
此测定法可用于局部过敏反应的动物致敏多种抗原的定量。抗原的选择是灵活的，因为该测定法已被成功地与常见的过敏原，如OVA和匙孔血蓝蛋白（KLH）上进行。此外，代替致敏，局部过敏反应，可通过注射抗体引起的幼稚动物的交叉链接的IgE或IgE受体上嗜碱性粒细胞和肥大细胞，或通过对这些细胞如CD200R3 1结扎非IgE抗体激活受体。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
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