Måling Lokale anafylaksi hos mus

Summary

Allergiske reaktioner, karakteriseret ved aktivering af mastceller og basofile, drives af krydsbinding af IgE og frigørelsen af ​​proinflammatoriske mediatorer. En kvantitativ vurdering af allergiske reaktioner kan opnås ved hjælp af Evans Blå farvestof for at overvåge ændringer i vaskulær permeabilitet efter allergen.

Abstract

Allergiske reaktioner er resultatet af aktiveringen af ​​mastceller og basofile og den efterfølgende frigivelse af vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer. Udsættelse for et allergen i et sensibiliseret individs kan resultere i kliniske symptomer, der varierer fra mindre erytem til livstruende anafylaksi. I laboratoriet har forskellige dyremodeller blevet udviklet til at forstå mekanismerne køre allergiske reaktioner. Heri beskriver vi en detaljeret metode til at måle ændringer i vaskulær permeabilitet til at kvantificere lokaliserede allergiske reaktioner. Den lokale anafylaksi assay blev først rapporteret i 1920'erne, og er blevet tilpasset fra den teknik publiceret af Kojima et al. i 2007 ^1. I dette assay mus sensibiliseret til OVA udfordres i det venstre øre med køretøj, og i højre øre med OVA. Dette er efterfulgt af en intravenøs injektion af Evans blå farvestof. Ti minutter efter injektion af Evans Blå, dyret aflivet, og farvestoffet, der har ekstravaseret itil ørerne udvindes natten over i formamid. Absorbansen af ​​det ekstraherede farvestof derefter kvantificeres med et spektrofotometer. Denne metode med sikkerhed giver en visuel og kvantificerbar manifestation af en lokal allergisk reaktion.

Introduction

Type I-overfølsomhed medieret af antigen-induceret tværbinding af IgE på overfladen af ​​mastceller og basofiler. Dette resulterer i cellulær degranulering og frigivelse af vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer såsom histamin, tryptase, og blodpladeaktiverende faktor ^2. Efter frigivelsen af præfabrikerede mediatorer under degranulering, mastceller syntetiserer og frigiver prostaglandiner og leukotriener, hvilket yderligere øger vaskulær permeabilitet ^3. Den indledende kliniske respons sker hurtigt og omtales som en "øjeblikkelig reaktion". I huden, en vabler-og flare reaktion er umiddelbart synlige i løbet af minutter antigen. Afhængig af den dosis af udfordringen, er det muligt at observere en "sen fase respons" et par timer senere. Sene fase hævelse skyldes lokalt ødem og leukocytrekruttering ind i vævene ^2. Histamin, der generelt anses for at være vigtig mediator deltager iumiddelbare allergiske reaktioner, virker på histamin-receptor 1 (HR1) udtrykt på skibe og histamin receptor 2 (HR2) udtrykt på den glatte muskulatur. Den kombinerede effekt øger blodgennemstrømningen og karpermeabilitet på stedet for inflammation ^4.

En række dyremodeller for allergi er blevet udviklet med henblik på at undersøge de mekanismer, der er involveret i allergisk inflammation, herunder modeller for allergisk astma, systemisk anafylaksi, og lokale anafylaksi. Intravenøs farvestof administration er blevet brugt til at måle lokale allergiske reaktioner i dyremodeller i næsten et århundrede, med publikationer, der beskriver denne teknik går tilbage til 1920'erne. ⁵ Kaniner og marsvin var de første anvendte dyremodeller til at teste umiddelbare overfølsomhedsreaktioner, og de ​​mest følsomme besvarelser blev generelt fundet i øret ^5,6. Assayet blev senere godkendt til brug i rotter ⁷ og mus ^8.

Historisken række eksperimentelle metoder er blevet anvendt, herunder injektion af antigen før injektion af farvestof, injektion af farvestof før injektion af antigen, og samtidig injektion af farvestof og antigen. Intravenøs farvestof administration som et middel til måling af allergiske reaktioner er en alsidig assay som det kan anvendes til måling af aktiv og passiv, og omvendt passive reaktioner ^5,9. Talrige farvestoffer er blevet brugt til at vurdere allergiske reaktioner, herunder trypanblåt, Pontamine Sky Blue, Evans Blå, Geigy Blå 536, og Indien Ink ^5,6,9. En opløsning af 0,5% Evans Blue er i øjeblikket standard farvestof anvendes til måling af allergiske reaktioner i huden.

Den anafylaktisk reaktion på udfordringen er forbigående; maksimal intensitet nås inden 10 – 15 min farvestof injektion og ingen reaktion er synlig, hvis farvestoffet indgives mere end 30 minutter efter udfordring, uanset de anvendte dyrearter ^9. Kvantificering af farvestof ekstravasation var oprindeligly opnås ved at måle vabler størrelse som angivet af det blå farvestof ^7-9. Derudover kan tællinger af degranulerede mastceller kvantificeres ved udskæring af hud væv fra stedet for reaktionen og farvning med toluidinblåt ^7. Mastcelledegranulering bruges ofte som en markør for kutant, IgE-medierede allergiske reaktioner, som mastceller er den vigtigste lokale cellepopulation udtrykker højaffinitets IgE-receptor FceR. Spektrofotometriske teknikker til måling af farvestof ekstravasation i vævet blev udviklet for passive kutane anafylaksi (PCA) hos rotter ¹⁰ og mus ¹¹ i 1990'erne.

Følgende lokale anafylaksi assayprotokollen blev tilpasset fra Kojima et al. ^1, og udnytter kylling æg ovalbumin (OVA) som antigen til at fremkalde allergiske reaktioner. Imidlertid kan andre end OVA antigener om ønsket anvendes. Assayet derefter bruger Evans Blå farvestof for at overvåge ændringer i vaskulær permeability, der opstår på grund af mast celle IgE krydsbinding og histamin frigivelse.

Protocol

1. bevidstgøre Mus Forbered en OVA-stamopløsning ved fortynding OVA i 1x PBS til en slutkoncentration på 20 mg / ml. Frys ned portioner i kryoglas og opbevares ved -80 ° C til senere brug. Bring en eller flere portioner af 20 mg / ml OVA lager til stuetemperatur. Fortynd OVA i 1x PBS til en slutkoncentration på 1 mg / ml i et 5 ml polystyren rundbundet rør med en hætte. Vortex kortvarigt at blande. Hold polystyrenrør indeholdende 1 mg / ml OVA i en hvirvel indstillet til medium has…

Representative Results

Dyr, der har undergået analysen held vil have hud og øjne, der vises blå. PBS sensibiliserede dyr bør ikke reagere på enten PBS eller OVA Udfordringen består derfor begge ører bør forblive hvid (figur 1A). I OVA sensibiliserede dyr, øret modtager PBS udfordring (til venstre) skal enten være helt hvide eller svagt blå i en lokaliseret måde ved injektionsstedet. Øret modtager OVA udfordring (til højre), bør blive gradvist mørkere blå i løbet af 10 min efter farvestof administration <stro…

Discussion

Talrige markører for allergisk sygdom bruges til at vurdere styrken af ​​allergiske reaktioner efter allergen udfordring, herunder ændringer i niveauer af cirkulerende histamin, Th2 cytokin produktion, og celle rekruttering til bronkoalveolær væske i fastsættelsen af ​​luftvejene udfordring. Mens overvåge ændringer i disse parametre er vigtig for at studere allergiske reaktioner, behøver biologiske markører ikke altid overens med de kliniske allergisk sygdom. Den lokale anafylaksi assay beskrevet i denn…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform