Summary

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Published: October 14, 2014
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Summary

Allergischen Reaktionen, gekennzeichnet durch die Aktivierung von Mastzellen und Basophilen, durch die Quervernetzung von IgE und Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren zurückzuführen. Eine quantitative Beurteilung von allergischen Reaktionen können mit Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären Permeabilität nach Allergenprovokation überwachen erreicht werden.

Abstract

Allergische Reaktionen sind das Ergebnis der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und die nachfolgende Freisetzung von vasoaktiven und proinflammatorische Mediatoren. Exposition gegenüber einem Allergen in einem sensibilisierten Individuum kann in der klinischen Symptome, die von leichten Hautrötung bis zu lebensbedrohlichen Anaphylaxie variieren führen. Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt worden, um die Mechanismen, die allergische Reaktionen zu verstehen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Veränderungen der vaskulären Permeabilität, um lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Die lokale Anaphylaxie-Assay wurde in den 1920er Jahren berichtet, und hat sich von der von Kojima et al Technik angepasst. 2007. 1 In diesem Test Mäuse-OVA sensibilisiert sind im linken Ohr mit Vehikel und im rechten Ohr mit OVA in Frage. Dies wird durch eine intravenöse Injektion von Evans Blue-Farbstoff gefolgt. Zehn Minuten nach der Injektion von Evans Blue, wird das Tier getötet und der Farbstoff, der in den Gefäßen hatin den Ohren wird über Nacht in Formamid extrahiert. Die Absorption der extrahierten Farbstoffs wird dann mit einem Spektrophotometer quantifiziert. Diese Methode zuverlässig eine visuelle und quantifizierbare Manifestation einer lokalen allergischen Reaktion.

Introduction

Typ-I-Hypersensitivität durch Antigen-induzierte Vernetzung von IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen vermittelt. Dies führt zu zellulären Degranulation und Freisetzung vasoaktiver und proinflammatorische Mediatoren, wie Histamin, Tryptase und Plättchen-aktivierender Faktor 2. Nach der Veröffentlichung der vorgeformten Mediatoren während der Degranulation, Mastzellen zu synthetisieren und frei Prostaglandinen und Leukotrienen, die Gefäßdurchlässigkeit 3 weiter zu erhöhen. Die ersten klinischen Reaktion schnell erfolgt und wird als eine "sofortige Reaktion" bezeichnet. In der Haut, ist eine Quaddel-und-Flare Reaktion innerhalb von Minuten nach Antigenexposition gut sichtbar. In Abhängigkeit von der Dosis der Herausforderung ist es möglich, ein "Spätphasenreaktion" ein paar Stunden später zu beobachten. Spätphase Schwellung ist durch lokalisierte Ödeme und die Rekrutierung von Leukozyten in das Gewebe 2. Histamin, allgemein als der Hauptmediator sein, die anallergische Sofortreaktionen, wirkt auf Histamin-Rezeptor-1 (HR1) bezogen auf die Gefäße und Histamin-Rezeptor-2 (HR2) bezogen auf die glatte Muskulatur. Die kombinierte Wirkung erhöht den Blutfluss und die vaskuläre Permeabilität in der Entzündungsstelle 4.

Eine Vielzahl von Tiermodellen für Allergie haben, um die Mechanismen bei allergischen Entzündungen beteiligt, darunter Modelle von allergischem Asthma, systemische Anaphylaxie, und lokale Anaphylaxie studieren entwickelt. Intravenöse Verabreichung Farbstoff verwendet wurde, um lokalisierte allergische Reaktionen in Tiermodellen für fast ein Jahrhundert zu messen, mit Veröffentlichungen, die diese Technik aus dem 1920er Jahren 5. Kaninchen und Meerschweinchen waren die ersten Tiermodelle verwendet werden, um sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen zu testen, und die empfindlichsten Antworten wurden in der Regel im Ohr 5,6 gefunden. Der Test wurde später für den Einsatz in Ratten und Mäusen 7 8 validiert.

Historischeine Vielzahl von experimentellen Methoden verwendet worden, einschließlich der Injektion des Antigens vor der Injektion von Farbstoff Injektion von Farbstoff vor der Injektion des Antigens, und gleichzeitiges Einspritzen von Farbstoff und Antigen. Intravenöse Verabreichung Farbstoff als ein Mittel zum Messen allergischen Reaktionen ist ein vielseitiges Assay kann zur Messung aktiv, passiv verwendet werden, und Rückwärts passive Reaktionen 5,9. Zahlreiche Farbstoffe wurden verwendet, um allergische Reaktionen, einschließlich Trypanblau, Pontamine Sky Blue, Evans-Blau, Blau 536 Geigy, und Tusche 5,6,9 bewerten. Eine Lösung von 0,5% Evans-Blau ist derzeit der Standard-Farbstoff zum Messen allergischen Reaktionen in der Haut.

Der anaphylaktische Reaktion auf Herausforderung ist vergänglich; maximale Intensität innerhalb von 10 erreicht – 15 min der Farbstoffinjektion, und keine Reaktion ist sichtbar, wenn Farbstoff mehr als 30 min nach der Exposition verabreicht werden, unabhängig von der zugrunde 9 Tiere. Quantifizierung der Farbstoff Extravasation war ursprünglichly erhalten durch Messung Quaddel Größe wie durch den blauen Farbstoff 7-9 angegeben. Zusätzlich können Zählungen degranulierten Mastzellen durch Ausschneiden Hautgewebe von der Stelle der Reaktion und Färbung mit Toluidinblau 7 quantifiziert werden. Mastzelldegranulation wird oft als Marker für Haut, IgE-vermittelten allergischen Reaktionen verwendet werden, wie Mastzellen sind die wichtigsten lokalen Zellpopulation des hochaffinen IgE-Rezeptors FcsRI ausdrückt. Spektrophotometrische Techniken zur Messung Farbstoff Extravasation in das Gewebe wurde für die passive kutane Anaphylaxie (PCA) bei Ratten 10 und der Maus 11 in den 1990er Jahren entwickelt.

Die folgenden lokalen Anaphylaxie Assay-Protokoll wurde von Kojima et al angepasst. 1 und nutzt Hühnerei Ovalbumin (OVA) als Antigen für die Auslösung allergischer Reaktionen. Jedoch können andere als OVA-Antigene, wenn gewünscht, verwendet werden. Der Assay verwendet dann Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären permeabilit überwacheny, die durch Zell IgE Vernetzung und Freisetzung von Histamin Mast auftreten.

Protocol

1. sensibilisieren Mäuse Vorbereiten eines OVA-Stammlösung durch Verdünnen von OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 20 mg / ml. Einfrieren unten Aliquots in Kryoröhrchen und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung. Bringen Sie einen oder mehrere Teilmengen von 20 mg / ml OVA Lager auf Raumtemperatur. Verdünnen OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml in einer 5 ml Polystyrolröhrchen mit rundem Boden einer Kappe. Vortex kurz zu mischen. Halten Sie die Polystyr…

Representative Results

Tiere, die den Test bestanden haben, müssen Haut und Augen, die blau erscheinen. PBS sensibilisierten Tieren sollte nicht entweder PBS oder OVA Herausforderung reagieren, daher beide Ohren sollten weiß (1A) bleiben. In OVA sensibilisierten Tieren, das Ohr Erhalt der PBS Herausforderung (links) sollte entweder ganz weiß oder in einer lokalisierten Weise an der Injektionsstelle leicht blau. Das Ohr Erhalt der OVA Herausforderung (rechts) sollten schrittweise dunkleres Blau während der 10 Minuten nach …

Discussion

Zahlreiche Markierungen von allergischen Erkrankungen verwendet werden, um die Stärke der allergischen Reaktionen nach Allergenprovokation, einschließlich Änderungen in der Konzentration von zirkulierendem Histamin, Th2-Cytokin Produktion und Zellrekrutierung in der bronchoalveolären Flüssigkeit in der Umgebung der Atemwegs Herausforderung zu bewerten. Während die Überwachung Änderungen dieser Parameter ist wichtig für die Untersuchung allergischen Reaktionen, biologische Marker nicht immer mit klinischen aller…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
BALB/c Mice The Jackson Laboratory 651
PBS pH 7.4 Quality Biologic 114-058-101
Ovalbumin Sigma A5503-10G
Imject Alum Thermo Scientific 77161 Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye Sigma E2129
Formamide Sigma 295876 99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP Phoenix NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes BD 329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle Terumo NDC 100861
27G Needles BD 305109
Forceps F.S.T. 11000-12
Surgical scissors F.S.T. 14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes BD Falcon 352058
1.5ml Microcentrifuge tubes Medical Supply Partners 15-1151
15ml Conical tubes BD Falcon 352097
Flat-bottom 96 well plate Costar 3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System VetEquip 922100
Vortex Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560 with 3 inch platform

References

  1. Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
  2. Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
  3. Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
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Cite This Article
Evans, H., Killoran, K. E., Mitre, E. Measuring Local Anaphylaxis in Mice. J. Vis. Exp. (92), e52005, doi:10.3791/52005 (2014).

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