Summary
Allergischen Reaktionen, gekennzeichnet durch die Aktivierung von Mastzellen und Basophilen, durch die Quervernetzung von IgE und Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren zurückzuführen. Eine quantitative Beurteilung von allergischen Reaktionen können mit Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären Permeabilität nach Allergenprovokation überwachen erreicht werden.
Abstract
Allergische Reaktionen sind das Ergebnis der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und die nachfolgende Freisetzung von vasoaktiven und proinflammatorische Mediatoren. Exposition gegenüber einem Allergen in einem sensibilisierten Individuum kann in der klinischen Symptome, die von leichten Hautrötung bis zu lebensbedrohlichen Anaphylaxie variieren führen. Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt worden, um die Mechanismen, die allergische Reaktionen zu verstehen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Veränderungen der vaskulären Permeabilität, um lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Die lokale Anaphylaxie-Assay wurde in den 1920er Jahren berichtet, und hat sich von der von Kojima et al Technik angepasst. 2007. 1 In diesem Test Mäuse-OVA sensibilisiert sind im linken Ohr mit Vehikel und im rechten Ohr mit OVA in Frage. Dies wird durch eine intravenöse Injektion von Evans Blue-Farbstoff gefolgt. Zehn Minuten nach der Injektion von Evans Blue, wird das Tier getötet und der Farbstoff, der in den Gefäßen hatin den Ohren wird über Nacht in Formamid extrahiert. Die Absorption der extrahierten Farbstoffs wird dann mit einem Spektrophotometer quantifiziert. Diese Methode zuverlässig eine visuelle und quantifizierbare Manifestation einer lokalen allergischen Reaktion.
Introduction
Typ-I-Hypersensitivität durch Antigen-induzierte Vernetzung von IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen vermittelt. Dies führt zu zellulären Degranulation und Freisetzung vasoaktiver und proinflammatorische Mediatoren, wie Histamin, Tryptase und Plättchen-aktivierender Faktor 2. Nach der Veröffentlichung der vorgeformten Mediatoren während der Degranulation, Mastzellen zu synthetisieren und frei Prostaglandinen und Leukotrienen, die Gefäßdurchlässigkeit 3 weiter zu erhöhen. Die ersten klinischen Reaktion schnell erfolgt und wird als eine "sofortige Reaktion" bezeichnet. In der Haut, ist eine Quaddel-und-Flare Reaktion innerhalb von Minuten nach Antigenexposition gut sichtbar. In Abhängigkeit von der Dosis der Herausforderung ist es möglich, ein "Spätphasenreaktion" ein paar Stunden später zu beobachten. Spätphase Schwellung ist durch lokalisierte Ödeme und die Rekrutierung von Leukozyten in das Gewebe 2. Histamin, allgemein als der Hauptmediator sein, die anallergische Sofortreaktionen, wirkt auf Histamin-Rezeptor-1 (HR1) bezogen auf die Gefäße und Histamin-Rezeptor-2 (HR2) bezogen auf die glatte Muskulatur. Die kombinierte Wirkung erhöht den Blutfluss und die vaskuläre Permeabilität in der Entzündungsstelle 4.
Eine Vielzahl von Tiermodellen für Allergie haben, um die Mechanismen bei allergischen Entzündungen beteiligt, darunter Modelle von allergischem Asthma, systemische Anaphylaxie, und lokale Anaphylaxie studieren entwickelt. Intravenöse Verabreichung Farbstoff verwendet wurde, um lokalisierte allergische Reaktionen in Tiermodellen für fast ein Jahrhundert zu messen, mit Veröffentlichungen, die diese Technik aus dem 1920er Jahren 5. Kaninchen und Meerschweinchen waren die ersten Tiermodelle verwendet werden, um sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen zu testen, und die empfindlichsten Antworten wurden in der Regel im Ohr 5,6 gefunden. Der Test wurde später für den Einsatz in Ratten und Mäusen 7 8 validiert.
Historischeine Vielzahl von experimentellen Methoden verwendet worden, einschließlich der Injektion des Antigens vor der Injektion von Farbstoff Injektion von Farbstoff vor der Injektion des Antigens, und gleichzeitiges Einspritzen von Farbstoff und Antigen. Intravenöse Verabreichung Farbstoff als ein Mittel zum Messen allergischen Reaktionen ist ein vielseitiges Assay kann zur Messung aktiv, passiv verwendet werden, und Rückwärts passive Reaktionen 5,9. Zahlreiche Farbstoffe wurden verwendet, um allergische Reaktionen, einschließlich Trypanblau, Pontamine Sky Blue, Evans-Blau, Blau 536 Geigy, und Tusche 5,6,9 bewerten. Eine Lösung von 0,5% Evans-Blau ist derzeit der Standard-Farbstoff zum Messen allergischen Reaktionen in der Haut.
Der anaphylaktische Reaktion auf Herausforderung ist vergänglich; maximale Intensität innerhalb von 10 erreicht - 15 min der Farbstoffinjektion, und keine Reaktion ist sichtbar, wenn Farbstoff mehr als 30 min nach der Exposition verabreicht werden, unabhängig von der zugrunde 9 Tiere. Quantifizierung der Farbstoff Extravasation war ursprünglichly erhalten durch Messung Quaddel Größe wie durch den blauen Farbstoff 7-9 angegeben. Zusätzlich können Zählungen degranulierten Mastzellen durch Ausschneiden Hautgewebe von der Stelle der Reaktion und Färbung mit Toluidinblau 7 quantifiziert werden. Mastzelldegranulation wird oft als Marker für Haut, IgE-vermittelten allergischen Reaktionen verwendet werden, wie Mastzellen sind die wichtigsten lokalen Zellpopulation des hochaffinen IgE-Rezeptors FcsRI ausdrückt. Spektrophotometrische Techniken zur Messung Farbstoff Extravasation in das Gewebe wurde für die passive kutane Anaphylaxie (PCA) bei Ratten 10 und der Maus 11 in den 1990er Jahren entwickelt.
Die folgenden lokalen Anaphylaxie Assay-Protokoll wurde von Kojima et al angepasst. 1 und nutzt Hühnerei Ovalbumin (OVA) als Antigen für die Auslösung allergischer Reaktionen. Jedoch können andere als OVA-Antigene, wenn gewünscht, verwendet werden. Der Assay verwendet dann Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären permeabilit überwacheny, die durch Zell IgE Vernetzung und Freisetzung von Histamin Mast auftreten.
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Protocol
1. sensibilisieren Mäuse
- Vorbereiten eines OVA-Stammlösung durch Verdünnen von OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 20 mg / ml. Einfrieren unten Aliquots in Kryoröhrchen und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung.
- Bringen Sie einen oder mehrere Teilmengen von 20 mg / ml OVA Lager auf Raumtemperatur. Verdünnen OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml in einer 5 ml Polystyrolröhrchen mit rundem Boden einer Kappe. Vortex kurz zu mischen.
- Halten Sie die Polystyrol-Röhrchen mit dem 1 mg / ml OVA auf einem Vortex bei mittlerer Geschwindigkeit eingestellt, das gleiche Volumen von gut homogenisiert Imject Alum (40 mg / ml) tropfenweise, während es das Rohr, um eine 1 zu produzieren vortexen: 1-Verhältnis von Alaun Immunogen.
- Zeigen Kappe auf dem Rohr und Band Rohr Wirbel. Schalten Wirbel auf niedrigster Stufe und lassen OVA zu Alum 30 min zu adsorbieren.
- Erlauben nicht eine große Menge an Zeit, um zwischen der Vorbereitung OVA / Alum und Sensibilisierung Mäuse passieren. Wenn Sensibilisierung kann nicht direkt nach OVA / Alum Präparate abgeschlossen werdenIonen, speichern OVA / Alum bei Raumtemperatur. Wirbel für 1 min vor der Verwendung.
- Legen Sie eine 1 ml Insulinspritze mit OVA / Alum-Mischung. Verschließen Sie die Spritze mit 27-Gauge-Nadel.
- Injizieren 100 ul OVA / Alum in das Peritoneum von BALB / c-Mäusen eine Dosis pro Maus von 50 ug OVA und 2 mg Alaun.
- Für eine negative Kontrolle, sensibilisieren andere Gruppe von Mäusen, die PBS. Eine 1: 1-Mischung von Alaun und PBS in derselben Weise wie oben aufgeführt, jedoch ohne OVA.
- Sensibilisieren Alle Mäuse (OVA und PBS-Kontrolle) einmal pro Woche für 3 Wochen für insgesamt 3 Injektionen. Nach letzten Injektion warten mindestens 2 Wochen vor der Durchführung der lokalen Anaphylaxie-Assay.
2. Lokale Anaphylaxie Assay
- Bringen OVA-Stammlösung auf Raumtemperatur. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt 20 mg / ml OVA Lager bis zu einer Endkonzentration von 5 mg / ml mit PBS (1: 4-Verdünnung von OVA in 1X PBS). Vortex kurz zu mischen.
- Betäuben Mäuse mit RC 2 </ Sup> Nageranästhesiesystem (oder einem vergleichbaren verdampft Liefersystem). Füllen Reservoir mit Isofluran, und schalten Sie O 2 Luftstrom. Ort Mäuse in Induktionskammer und passen Isofluran Steuerregler, um 5% auf Betäubung zu initiieren. Sobald die Mäuse vollständig betäubt, durch einen Mangel an Mobilität angedeutet, stellen Isofluran Steuerregler, um 3% auf tiefe Betäubung erhalten. Der Zweck der Narkose bei diesem Verfahren ist, um das Tier zu immobilisieren. Die Ohr und Schwanzvene Injektionen verursachen keine erhebliche Schmerzen oder Leiden für das Tier.
HINWEIS: Isofluran kann negative Auswirkungen auf die menschliche Fortpflanzungssystem. Achten Sie darauf, in einem gut belüfteten Raum verwenden und fügen Sie eine Aufräum Kanister zur Induktionskammer zur Abgas neutralisieren. Wenn Sie bei der Verwendung von Isofluran schwanger sind, tragen eine Maske Kohlefilter, um die Exposition zu minimieren. - Last 10 ul 5 mg / ml OVA in eine 3/10 cc-Insulinspritze mit einer 31 G Nadel begrenzt. Legen Sie eine weitere 10.3 ccm Insulinspritze mit 10 ul1x PBS.
- Verwendung eines Binokular injizieren 10 ul OVA in das rechte Ohr eines anästhesierten Maus für eine Expositionsdosis von 50 ug OVA. Andere Dosierungen wie 20 ug, sind ebenfalls akzeptabel.
- , Um die Injektion zu stabilisieren das Ohr, wickeln Klebeband (Klebeseite nach oben) um eine 15 ml konischen Röhrchen. Sichern die dorsale Seite der rechten Ohr auf das Band. Führen Sie die Nadel Kegel Seite nach oben zwischen die beiden Blätter des Ohres. Langsam spritzen OVA in der Mitte des Ohrgewebe, kümmert sich nicht um irgendwelche Blutgefäße betroffen.
- Unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen Verfahren injizieren 10 ul PBS in das linke Ohr als negative Kontrolle.
- 3 min warten.
- Während dieser Zeit, die Maus in einem Restrainer und halten den Schwanz unter einer Wärmelampe oder in einem warmen Wasserbad für 1 min, um die Blutgefäße erweitern.
- Verwendung einer 1 ml Insulin-Spritze mit einer 27 G Nadel nach oben begrenzt, langsam injizieren 200 ul 0,5% Evans Blue-Farbstoff in den Schwanz vEin von der Maus. Schnelle Injektion kann die Gefäßstruktur, bevor die gesamte 200 ul zerstören verabreicht wird. Wenn dies geschieht, versucht, das Restvolumen des Farbstoffs in die Vene auf der gegenüberliegenden Seite des Schwanzes injiziert.
- Warten Sie 10 min.
- Euthanize die Maus und entfernen Sie die beiden Ohren mit einer Pinzette und chirurgische Schere.
- Greifen die Kanten des Ohres mit einer Zange, um sicherzustellen, dass kein Druck auf die Injektionsstelle in der Mitte des Ohrs aufgebracht. Entfernen Sie so viel wie möglich Ohrgewebe durch Schneiden der Nähe, aber nicht durch die Rippe der vorliegenden Knorpel an der Basis des Ohres. Kleine Mengen von Fell kann auf dem ausgeschnittenen Ohr vorhanden sein; Dies hat keine Auswirkungen auf den Test.
- Aliquoten 700 ul Formamid in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Bereiten Sie eine Röhre pro Ohr (zwei Röhren pro Maus).
HINWEIS: Formamid teratogen, mutagen und reizend. Handschuhe, Schutzbrille und Gesichtsschutz tragen. Schwangere Frauen sollten beim Umgang mit dem Vorsicht verwendens Formamid kann fötotoxischen sein. - Fügen Ohren zu Formamid, Kappe die Rohre, und Inkubation über Nacht in einem trockenen Wärmebades auf 63 ° C eingestellt. Ohren können noch leicht blau nach Inkubation erscheinen; aber der Großteil des Farbstoffs in die Formamid extrahiert werden.
- Geben Sie 300 ul jeder Probe, in zweifacher Ausfertigung, in eine 96-Well-Platte. Übertragen vermeiden Fell, wenn er in der Probe vorhanden ist. Sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden ist, da sie die Absorptionsmessung beeinflussen.
- Fügen Sie 300 ul Formamid, in zweifacher Ausfertigung an die 96-Well-Platte. Diese Brunnen werden als Rohlinge verwendet werden.
- Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption bei 620 nm messen. Subtrahieren Formamid Brunnen von jeder Probe zu lesen.
HINWEIS: Alle Experimente wurden unter Protokolle, die von der Universität uniformierten Diensten Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt geführt.
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Representative Results
Tiere, die den Test bestanden haben, müssen Haut und Augen, die blau erscheinen. PBS sensibilisierten Tieren sollte nicht entweder PBS oder OVA Herausforderung reagieren, daher beide Ohren sollten weiß (1A) bleiben. In OVA sensibilisierten Tieren, das Ohr Erhalt der PBS Herausforderung (links) sollte entweder ganz weiß oder in einer lokalisierten Weise an der Injektionsstelle leicht blau. Das Ohr Erhalt der OVA Herausforderung (rechts) sollten schrittweise dunkleres Blau während der 10 Minuten nach der Farbstoff Verwaltung (Abbildung 1B) zu werden.
PBS sensibilisiert Tiere vernachlässigbare Absorptionswerte sowohl für die PBS-und OVA-Challenge (2A). Für OVA sensibilisierten Tieren, PBS Injektion führt im allgemeinen zu einer mittleren Absorptionswert von 0,13 und eine Standardabweichung von 0,04. Umgekehrt wird ein 50 ug OVA Herausforderung ergibt sich eine mittlere Absorptionswert von 0,58 und eine Standardabweichung von 0,18 (Figurieren 2B). Die Höhe der OVA für Herausforderung verwendet werden, können für die einzelnen Versuche eingestellt werden, wenn nötig. Zum Beispiel, ein 20 ug OVA Herausforderung ergibt sich eine mittlere Extinktion von 0,30 und einer Standardabweichung von 0,10 (Abbildung 2C), jedoch eine Herausforderung, weniger als 20 ug darf nicht zu verlässlichen Ergebnissen führen. Änderungen in der OVA-Konzentration muss optimiert und validiert vor Gebrauch.
Die Ergebnisse können grafisch gekoppelt werden, mit PBS Absorption im Vergleich zu OVA-Absorption. Alternativ können die Ergebnisse als einen einzigen Wert aufgetragen werden, wobei die Extinktion von dem PBS OVA Absorption für jedes einzelne Tier abgezogen.
Abbildung 1: Ohr Pigmentierung in PBS und OVA sensibilisierten Tieren. (A). Ohr Pigmentierung in PBS sensibilisierten Tieren. Das linke Ohr (mit PBS herausgefordert) und das rechte Ohr (mit 5 herausgefordert0 ug OVA) zeigen wenig bis kein Farbstoff Extravasation. (B). Ohr Pigmentierung in OVA sensibilisierten Tieren. Es gibt keine allergische Reaktion im linken Ohr (mit PBS gefordert), wie durch das Fehlen einer blauen Farbstoff Extravasation angezeigt. Das rechte Ohr (mit 50 ug OVA in Frage) eine helle blaue Färbung auf erhöhte vaskuläre Permeabilität, eine direkte Folge der Zellaktivierung in das Ohrgewebe.
Figur 2: Repräsentative OD-Werte für OVA sensibilisierten Tieren OD Werte von spektrophotometrischen Messungen bei 620 nm aufgenommen (A) abgeleiteten... 50 ug OVA Herausforderung in PBS sensibilisierten Tieren. OD-Werte für beide PBS und OVA Herausforderung vernachlässigbar sind. (B). 50 ug OVA OVA sensibilisiert Herausforderung in Tiere. PBS Herausforderung ergibt OD-Werte <0,2 und OVA Herausforderung resuLTS in OD-Werte> 0,3. (C). 20 ug OVA Herausforderung. PBS Herausforderung ergibt OD-Werte <0,2. Die rechten Ohren leicht reduziert OD-Werte durch eine geringere Belastungsdosis von OVA verwendet.
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Discussion
Zahlreiche Markierungen von allergischen Erkrankungen verwendet werden, um die Stärke der allergischen Reaktionen nach Allergenprovokation, einschließlich Änderungen in der Konzentration von zirkulierendem Histamin, Th2-Cytokin Produktion und Zellrekrutierung in der bronchoalveolären Flüssigkeit in der Umgebung der Atemwegs Herausforderung zu bewerten. Während die Überwachung Änderungen dieser Parameter ist wichtig für die Untersuchung allergischen Reaktionen, biologische Marker nicht immer mit klinischen allergischen Erkrankung korrelieren. Die in diesem Protokoll beschriebenen lokalen Anaphylaxie Test liefert reproduzierbare Mess von lokalisierten Gefäßdurchlässigkeit als Korrelat für lokalisierte allergische Erkrankung. Durch die Verwendung von blauem Farbstoff Extravasation, dieses Protokoll ermöglicht sowohl Visualisierung und relative Quantifizierung von einer lokalisierten allergischen Reaktion. Im Gegensatz zu Allergie-Tests, die auf klinischen Scoring verlassen, die primäre Ergebnisse dieses Assays (blauer Farbstoff hervor, wie durch spektrophotometrische Absorption gemessen) ist nicht leicht, den Beobachter Bias unterzogen. Ein weiterer ADVAntage ist, dass die Tiere kurz nach Herausforderung eingeschläfert, die Begrenzung, keine Beschwerden möglicherweise durch die Allergenprovokation und Farbstoff Verwaltung verursacht. Die alternative Verwendung eines von Akiyama et al. 10 beschriebene Hand-Spektrophotometer ermöglicht die kontinuierliche Messung von Veränderungen der vaskulären Permeabilität. Allerdings ist Evans Blau giftig, und die Einspritz wird letztlich auf das Tier zu müssen eingeschläfert werden führen.
Während dieser Test weist eine Anzahl von Stärken, hat sie die Begrenzung wobei etwas technisch anspruchsvoll. Zuverlässige Ergebnisse sind abhängig von konsequente und erfolgreiche Ohr und Schwanzvenen-Injektionen. Wenn die gesamte Test-Dosis nicht in den Gehör verabreicht, wenn Ohr Injektion führt offensichtlich Punktion eines Blutgefäßes oder wenn der Evans Blue intravenöse Injektion nicht vollständig ist, sollte das Tier von der Analyse ausgeschlossen werden. In unserem Labor haben Forscher mussten die intradermale Injektionen Ohr für Seve übenral Wochen vor der Entwicklung Kenntnisse. Zusätzlich ist es wichtig, geeignete Kontrollen für den Assay auszuführen. Insbesondere sollte PBS Injektion regelmäßig als interne Kontrolle verwendet werden, wie Tieren scheint etwas anders, um Schäden durch Einführen der Nadel verursacht reagieren. Die PBS-Lese gibt eine Baseline-Messung für Veränderungen der vaskulären Permeabilität durch die Injektion selbst induziert. Anstelle der Verwendung von intradermalen Injektionen Ohr kann der Assay auch für die Rückenhaut der Mäuse aufgetragen werden. Ermittler können diese Strecke zu finden sein technisch weniger anspruchsvoll, und darüber hinaus ermöglicht sie die Prüfung mehrerer Antigene gleichzeitig.
Die lokale Anaphylaxie-Test ist sehr vielseitig, da die Test-Dosis kann je nach Experiment manipuliert werden. Wenn es notwendig ist, um Veränderungen in der allergischen Reaktionen sehen ist, kann es vorteilhaft sein, einen unteren OVA Challenge-Dosis zu verwenden, beispielsweise 20 ug. Dies ermöglicht eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Überwachung der Änderungen der Absorption, wiewird es weniger wahrscheinlich, dass der Sättigungspunkt für die Zellaktivierung erreicht.
Zusätzlich kann dieser Assay verwendet werden, um passive kutane Anaphylaxie (PCA) zu untersuchen. In dieser Einstellung wird antigenspezifischen IgE in einem Ohr und Fahrzeug in das andere eingespritzt. 24 Stunden später werden die Tiere eine intravenöse Herausforderung Antigen und Evans Blue-Farbstoff angegeben. Das PCA-Modell kann die Zeit es braucht, um das Experiment, die Zahl der verwendeten Tiere vervollständigen zu reduzieren, und ermöglichen es Forschern, um auf die spezifischen Wirkungen von IgE Vernetzung aussehen.
Trotz Einnahme mehr durchführen, gibt es einige Vorteile bei der Verwendung der in dieser Veröffentlichung beschriebenen aktiven Hautanaphylaxie (ACA)-Modell. Sensibilisierung durch wöchentliche Exposition gegen ahmt die Antigen-Prozess, durch den Menschen entwickeln allergische Erkrankung, wie Sensibilisierung ist in der Regel eine systemische und die Menschen haben in der Regel sowohl die Allergen-spezifische IgE-und IgG im Umlauf. Während IgE Vernetzung ist das wichtigste Mittel der mast Zellen Degranulation, Mastzellen zu IgG Vernetzung reagieren auch. Daher ermöglicht die ACA Modell für Forscher, die Mechanismen der allergischen Reaktionen neben nur IgE-vermittelten Erkrankung zu untersuchen. Zusammenfassend, während die Methode der Sensibilisierung verwendet, liegt im Ermessen des Forschers, der lokale Anaphylaxie Assay vielseitig und kann mit einer Vielzahl von Sensibilisierungsmethoden verwendet werden.
Ohrschwellung, eine häufig verwendete Marker für die Beurteilung der allergischen Reaktionen, kann auch nach der OVA Herausforderung gemessen werden. Wir haben festgestellt, dass die Ohren mit OVA herausgefordert haben deutlich mehr als Schwellung Ohren mit PBS herausgefordert zu 1 Stunde nach der Injektion. Im Gegensatz zu der Evans Blue-Test, haben wir diese Ohrdicke-Messungen sind weniger empfindlich als Farbstoff Extravasation und weisen eine größere Variabilität zwischen den Ermittlern als Ohrdicke kann durch Kompression des Ohres bei der Verwendung von Messeinrichtungen verändert werden beobachtet.
Andere als MausstämmeBALB / c kann für den lokalen Anaphylaxie Test verwendet werden; Absorptionswerte jedoch leicht je nach Stamm variieren. Wegen ihrer Neigung zu starken Th2-Reaktionen zu entwickeln, BALB / c-Mäuse produzieren im Allgemeinen zuverlässige, reproduzierbare Messwerte mit diesem Test.
Dieser Assay ermöglicht die Quantifizierung der lokalisierten allergischen Reaktionen bei Tieren, die verschiedene Antigene sensibilisiert. Antigenselektion ist flexibel, da der Test erfolgreich mit häufigen Allergenen, wie Eizellen und Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) durchgeführt. Darüber hinaus statt der Sensibilisierung, eine lokale allergische Reaktion kann in einem naiven Tier durch Injektion von Antikörpern hervorgerufen werden, dass Cross-Link-IgE oder IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und basophilen Granulozyten, oder durch Ligation nicht-IgE-Rezeptoren auf der Aktivierung dieser Zellen, wie CD200R3 1 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z.
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
