Summary
Allergiske reaksjoner, karakterisert ved at aktivering av mastceller og basofiler, er drevet av kryssbinding av IgE og frigjøring av proinflammatoriske mediatorer. En kvantitativ vurdering av allergiske reaksjoner som kan oppnås ved hjelp av Evans Blue fargestoff for å overvåke forandringer i vaskulær permeabilitet etter allergen-angrepet.
Abstract
Allergiske responser er et resultat av aktiveringen av mastceller og basofiler, og den etterfølgende frigjøring av vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer. Eksponering for et allergen i et lysfølsomt individ kan føre til kliniske symptomer som varierer fra mindre erytem til livstruende anafylaksi. I laboratoriet har forskjellige dyremodeller blitt utviklet for å forstå mekanismene ikke allergiske reaksjoner. Heri beskrives en detaljert fremgangsmåte for å måle forandringer i vaskulær permeabilitet for å kvantifisere lokaliserte allergiske responser. Den lokale anafylaksi analysen ble først rapportert i 1920, og har blitt tilpasset fra teknikken utgitt av Kojima et al. i 2007 1. I denne analysen, er mus sensibilisert for OVA utfordret i venstre øre med kjøretøy og i høyre øre med OVA. Dette er etterfulgt av en intravenøs injeksjon av Evans Blue fargestoff. Ti minutter etter injeksjon av Evans blått, er dyret avlivet og fargestoff som har ekstravasert itil ørene er hentet over natten i formamide. Absorbansen av det ekstraherte fargestoff ble deretter kvantifisert med et spektrofotometer. Denne fremgangsmåte resulterer i en pålitelig visuell og kvantifiserbar manifestasjon av en lokal allergisk reaksjon.
Introduction
Type I hypersensitivitet er mediert av antigen-indusert tverrbinding av IgE på overflaten av mastceller og basofiler. Dette resulterer i cellulær degranulering og frigjøring av vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer slik som histamin, tryptase, og blodplate-aktiverende faktor 2. Etter utgivelsen av preformede mediatorer under degranulering, mastceller syntetisere og frigjøre prostaglandiner og leukotriener, noe som ytterligere øker vaskulær permeabilitet 3. Den innledende kliniske respons skjer raskt og er referert til som en "umiddelbar reaksjon". I huden, er en wheal-og-bluss respons lett synlig bare minutter etter antigen utfordring. Avhengig av dosen av utfordringen, er det mulig å observere en "sen fase respons" noen få timer senere. Senfase hevelse skyldes lokalisert ødem og leukocytt rekruttering inn i vev to. Histamin, generelt ansett for å være den viktigste megler å ta del iumiddelbare allergiske reaksjoner, virker på histamin reseptor 1 (HR1) uttrykt på skip og histamin reseptor 2 (HR2) uttrykt på glatt muskulatur. Den kombinerte effekten øker blodgjennomstrømningen og vaskulær permeabilitet på stedet av betennelse fire.
En rekke dyremodeller av allergi har blitt utviklet for å studere mekanismene som er involvert i allergisk inflammasjon, inkludert modeller av allergisk astma, systemisk anafylaksi, og lokale anafylaksi. Intravenøs dye-administrasjonen har blitt brukt til å måle lokaliserte allergiske reaksjoner i dyremodeller for nesten et århundre, med publikasjoner som beskriver denne teknikken kan dateres tilbake til 1920-tallet fem. Kaniner og marsvin var de første dyremodeller brukes til å teste umiddelbare overfølsomhetsreaksjoner, og de mest sensitive responser ble generelt funnet i øret 5,6. Analysen ble senere godkjent til bruk i rotter og mus 7 8.
Historisken rekke eksperimentelle metoder har vært brukt, inklusive injeksjon av antigen før injeksjon av fargestoff, injeksjon av fargestoff før injeksjon av antigen, og samtidig injeksjon av fargestoff og antigen. Intravenøs administrering fargestoff som et middel for måling av allergiske reaksjoner er en allsidig assay som kan brukes for måling av aktiv og passiv, og omvendt passive reaksjoner 5,9. Mange fargestoffer har blitt benyttet for å vurdere allergiske reaksjoner, inkludert Trypan Blå, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blå 536, og India Ink 5,6,9. En oppløsning av 0,5% Evans Blue er for tiden standard fargestoff som brukes for måling av allergiske reaksjoner i huden.
Den anafylaktisk reaksjon på utfordringen er forbigående; maksimal intensitet er nådd i løpet av 10 - 15 min for fargestoff-injeksjon, og ingen reaksjon er synlig hvis fargestoffet blir administrert mer enn 30 minutter etter utfordring, uavhengig av de dyrearter som brukes ni. Kvantifisering av fargestoff bloduttredelse var opprinneligly erholdt ved å måle hevelses størrelse som angis av det blå fargestoff 7-9. I tillegg kan tellinger av degranulated mastceller kvantifiseres ved excising huden vev fra stedet til reaksjonen og farging med toluidinblått 7. Degranulering av mastceller blir ofte brukt som en markør for kutan, IgE-medierte allergiske reaksjoner, som mastceller er den viktigste lokale cellepopulasjon som uttrykker høyaffinitets IgE reseptor FcεRI. Spektrofotometriske teknikker for måling fargestoff bloduttredelse i vevet ble utviklet for passive kutane anafylaksi (PCA) hos rotter 10 og mus 11 på 1990-tallet.
Den følgende lokale anafylaksi analyseprotokollen ble tilpasset fra Kojima et al. 1, og utnytter kyllingegg ovalbumin (OVA) som antigenet for å fremkalle allergiske reaksjoner. Imidlertid kan andre enn OVA-antigenene kan brukes om ønsket. Analysen bruker deretter Evans Blue fargestoff å overvåke endringer i vaskulær permeability som oppstår på grunn av mastcelle IgE kryssbinding og histaminfrigjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bevisst Mus
- Tilbered en OVA stamløsningen ved å fortynne OVA i 1x PBS til en sluttkonsentrasjon på 20 mg / ml. Fryse ned porsjoner i cryovials og oppbevar ved -80 ° C for senere bruk.
- Ta en eller flere aliquoter av 20 mg / ml lager OVA til romtemperatur. Fortynn OVA i 1x PBS til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml i en 5 ml rundbunnet polystyren røret med et lokk. Vortex kort for å blande.
- Ved å holde i polystyren røret som inneholder 1 mg / ml OVA på en vortex innstilt på middels hastighet, tilsett et likt volum grundig homogenisert Imject Alum (40 mg / ml) dråpevis mens de fortsetter å vortex-røret for å produsere en 1: 1-forhold av alum til immunogen.
- Sett lokket på røret og tape røret til vortex. Slå vortex på laveste innstilling og la OVA å adsorbere til Alum i 30 min.
- Ikke la en stor mengde tid til å passere mellom forbereder OVA / Alum og allergifremkallende mus. Hvis allergi ikke kan fullføres direkte etter OVA / Alum forberedelseion, lagre OVA / alun ved romtemperatur. Vortex i 1 min før bruk.
- Legg i en 1 ml insulinsprøyte med OVA / Alum blanding. Cap sprøyte med 27 gauge nål.
- Injiser 100 mL av OVA / alun i peritoneum til BALB / c-mus i en dose per mus av 50 ug OVA og 2 mg alun.
- For en negativ kontroll, sensibilisere en annen gruppe mus i PBS. Forbered en 1: 1 blanding av Alum og PBS på samme måte som nevnt ovenfor, utelat OVA.
- Sensibilisere alle mus (OVA og PBS kontroll) en gang hver uke i tre uker i totalt tre injeksjoner. Etter siste injeksjonen, må du vente minst to uker før du utfører den lokale anafylaksi analysen.
2. Lokal Anafylaksi analysen
- Bring OVA stamløsning til romtemperatur. I et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør, fortynnet 20 mg / ml OVA lager til en sluttkonsentrasjon på 5 mg / ml med PBS (1: 4 fortynning av OVA i 1X PBS). Vortex kort for å blande.
- Anesthetize mus ved hjelp av RC 2 </ Sup> Gnagere Anesthesia System (eller tilsvar fordampet leveringssystem). Fyll reservoaret med isofluran, og slå på O 2 luftstrøm. Plasser mus i induksjon kammer og justere isofluran kontrollhjulet til 5% for å initiere bedøvelsen. Når musene er fullt bedøvet, angitt med mangel på mobilitet, justere isofluran kontrollhjulet til 3% for å opprettholde dyp bedøvelsen. Hensikten med anestesi i denne fremgangsmåten er å immobilisere dyret. Øret og halen vein injeksjoner ikke forårsake betydelig smerte eller lidelse for dyret.
MERK: Isofluran kan ha negative effekter på den menneskelige reproduktive system. Pass på å bruke i et godt ventilert rom og feste et skylle canister til induksjonskammeret for å nøytralisere avgassen. Hvis du er gravid mens du bruker isofluran, bære en kullfilter maske for å minimere eksponering. - Laste 10 ul av 5 mg / ml i en OVA 3/10 cc insulinsprøyte avkortet med en 31 G nål. Legg i en ny 3/10 cc insulinsprøyte med 10 mLav 1x PBS.
- Ved hjelp av et dissekerende mikroskop, injisere 10 pl av OVA inn i det høyre øret til en bedøvet mus etter en utfordring dose på 50 ug OVA. Andre doser, slik som 20 mikrogram, er også akseptabelt.
- For å stabilisere øret til injeksjon, vikle teip (klebrig side opp) rundt en 15 ml konisk tube. Fest ryggsiden av høyre øre til tape. Sett nålen skråsiden opp mellom de to bladene av øret. Sakte injisere OVA inn til sentrum av øret vev, tar seg ikke å treffe noen blodkar.
- Ved anvendelse av samme fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, injisere 10 pl av PBS inn i det venstre øret som en negativ kontroll.
- Vent 3 min.
- I løpet av denne tiden, plasserer du muse i en rainer og hold halen under en varmelampe eller i et varmt vannbad i en min for å utvide blodårene.
- Ved hjelp av en 1 ml insulinsprøyte avkortet med en 27 G nål, langsomt injisere 200 ul av 0,5% Evans Blue fargestoff i halen vEin av musen. Rapid injeksjon kan ødelegge fartøyets struktur før hele 200fil administreres. Hvis dette oppstår, søke å injisere den gjenværende volum av væske i venen på den motsatte siden av halen.
- Vent 10 min.
- Avlive musa og fjerne begge ørene ved hjelp av pinsett og kirurgisk saks.
- Grab kantene av øret med pinsett, å sørge for at ikke noe press påføres på innsprøytingsstedet på midten av øret. Fjerne så mye øret vev som mulig ved å skjære nær, men ikke gjennom, ryggen av brusk til stede ved bunnen av øret. Små mengder av pels kan være til stede på det utskårede øret; dette vil ikke påvirke analysen.
- Delmengde 700 mL av formamide i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Forbered ett rør per øre (to rør per mus).
MERK: Formamide er teratogent, mutagene, og et irritasjonsmoment. Bruk hansker, vernebriller og ansiktsskjerm. Gravide kvinner bør utvise forsiktighet ved håndtering av ens formamide kan være fostertoksisk. - Legg ører formamid, sett lokk på rørene og inkuber over natten i en tørr varme-bad satt til 63 ° C. Ørene kan fortsatt dukke opp litt blå etter inkubasjon; men majoriteten av fargestoffet vil bli ekstrahert inn i formamid.
- Tilsett 300 ul av hver prøve, in duplo, til en 96 brønn plate. Unngå å overføre pels hvis det er til stede i prøven. Sørge for at det ikke er noen bobler som er tilstede i brønnene, som de vil påvirke absorbans lesing.
- Tilsett 300 ul av formamid, i to eksemplarer, til den 96 brønners plate. Disse brønnene vil bli brukt som blanks.
- Bruk et spektrofotometer for å måle absorbans ved 620 nm. Trekk fra formamid brønner fra hver prøve lesing.
MERK: Alle forsøkene ble utført under protokoller godkjent av uniformerte tjenester Universitetet Institutional Animal Care og bruk komité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr som har gjennomgått analysen vellykket vil ha hud og øyne som vises blå. PBS sensibiliserte dyr bør ikke reagere på enten PBS eller OVA utfordring, derfor begge ørene bør være i hvit (figur 1A). I OVA sensibiliserte dyr, øret mottar PBS utfordring (venstre) bør være enten helt hvitt eller svakt blå i et lokalisert måte på injeksjonsstedet. Øret mottar OVA utfordring (til høyre) skal bli gradvis mørkere blå i løpet av 10 min etter fargestoff administrasjon (figur 1B).
PBS sensibiliserte dyr vil ha ubetydelig avlesninger for både PBS og OVA utfordring (figur 2A). For OVA sensibiliserte dyr, vanligvis resulterer PBS injeksjon i en gjennomsnittlig absorbans lesning av 0,13 og et standardavvik på 0,04. Motsatt vil en 50 mikrogram OVA utfordring resulterer i en gjennomsnittlig absorbans lesning av 0,58 og et standardavvik på 0,18 (FIfigur 2B). Mengden av OVA benyttes til felling kan bli justert for individuelle eksperimenter om nødvendig. For eksempel vil en 20 mikrogram OVA utfordringsresultater i en gjennomsnittlig absorbans på 0,30 og et standardavvik på 0,10 (figur 2C), men en utfordring mindre enn 20 mikrogram, kan ikke gi pålitelige resultater. Endringer i OVA konsentrasjonen må være optimalisert og validert før bruk.
Resultatene kan bli grafisk paret, med PBS absorbans forhold til OVA absorbans. Alternativt kan resultatene bli plottet som en enkelt verdi, med PBS absorbansen subtrahert fra OVA absorbans for hvert enkelt dyr.
Figur 1: Ear pigmentering i PBS og OVA sensibiliserte dyr. (A). Ear pigmentering i PBS lysfølsomt dyr. Det venstre øre (utfordret med PBS) og høyre øre (utfordret med 50 ug OVA) viser liten eller ingen fargestoff ekstravasasjon. (B). Ear pigmentering i OVA sensibiliserte dyr. Det er ingen allergisk reaksjon i venstre øre (utfordret med PBS), som indikert ved et fravær av blå farge ekstravasasjon. Høyre øre (utfordret med 50 mikrogram OVA) viser en lys blå farge som indikerer økt vaskulær permeabilitet, et direkte resultat av celleaktivering i øret vev.
Figur 2: Representative OD verdier for OVA sensibiliserte dyr OD-verdier avledet fra spektrofotometriske målinger tatt ved 620 nm (A)... 50 mikrogram OVA utfordring i PBS sensibiliserte dyr. OD-verdier for både PBS og OVA utfordring er ubetydelig. (B). 50 mikrogram OVA utfordring i OVA sensibiliserte dyr. PBS utfordring resultater i OD verdier <0,2 og OVA utfordring results i OD verdier> 0,3. (C). 20 mikrogram OVA utfordring. PBS utfordring resultater i OD verdier <0,2. De riktige ører har noe redusert OD verdier på grunn av en mindre utfordring dose av OVA brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange markører for allergisk sykdom brukes til å vurdere styrken av allergiske reaksjoner etter allergen utfordring, herunder endringer i nivåer av sirkulerende histamin, Th2 cytokin produksjon, og celle rekruttering til bronchoalveolar væske i innstillingen av luftveis utfordring. Mens overvåking endringer i disse parametrene er viktig for å studere allergiske reaksjoner, ikke biologiske markører ikke alltid korrelerer med klinisk allergisk sykdom. Den lokale anafylaksi analysen beskrevet i denne protokollen gir reproduserbar måling av lokaliserte vaskulær permeabilitet som et korrelat for lokaliserte allergiske sykdommer. Ved å bruke blått fargestoff bloduttredelse, gjør at denne protokollen både visualisering og relativ kvantifisering av en lokalisert allergisk reaksjon. I motsetning til allergi assays som er avhengige av klinisk score, er det primære resultatet av denne analysen (blått fargestoff ekstravasasjon som målt ved spektrofotometrisk absorbans) ikke er lett utsatt for observatøren skjevhet. En annen Advantage er at dyrene er avlivet kort etter utfordring, som begrenser ubehag potensielt forårsaket av allergen-angrepet og fargestoff administrering. Den alternative anvendelse av en hånd-holdt spektrofotometer beskrevet av Akiyama et al. 10. tillater kontinuerlig måling av forandringer i vaskulær permeabilitet. Imidlertid er Evans Blue fargestoff giftig, og injeksjon vil til slutt føre til dyret som trenger å avlives.
Mens denne analysen har en rekke sterke sider, det har begrensning av å være noe teknisk utfordrende. Pålitelige resultater er avhengig av konsistente og vellykkede øre og hale vein injeksjoner. Hvis hele utfordring dosen ikke administreres inn i øret, hvis øret injeksjon resulterer i innlysende punktering av et blodkar, eller hvis Evans Blue intravenøs injeksjon ikke er fullstendig, dyret bør utelukkes fra analyse. I vårt laboratorium, har etterforskerne måtte øve intradermal øret injeksjoner for Several uker før utvikle ferdigheter. I tillegg er det viktig å kjøre forsvarlig kontroll for analysen. Nærmere bestemt skal PBS injeksjonsrutinemessig brukes som en intern kontroll, og dyr synes å reagere litt annerledes til skade forårsaket av nålestikk. Den PBS lesing gir et referanse mål for forandringer i vaskulær permeabilitet som induseres ved injeksjonen selv. I stedet for ved hjelp av intradermale injeksjoner øret, kan analysen også anvendes på baksiden huden hos mus. Undersøkere kan finne denne ruten for å være mindre teknisk krevende, og, i tillegg, gir det mulighet for testing av multiple antigener samtidig.
Den lokale anafylaksi analysen er svært allsidig, slik at den ekstra dosen kan manipuleres, avhengig av forsøket. Dersom det er nødvendig å se på endringer i allergiske reaksjoner, kan det være fordelaktig å benytte en lavere OVA utfordring dose, slik som 20 mikrogram. Dette sørger for økt følsomhet for overvåkning av forandringer i absorbans, somdet vil være mindre sannsynlig at metningspunktet for celleaktivering vil bli nådd.
I tillegg kan denne analysen kan brukes til å studere passiv kutan anafylaksi (PCA). I denne innstillingen, er antigen-spesifikk IgE injiseres i det ene øret og kjøretøyet inn i den andre. 24 timer senere blir dyret gis en intravenøs utfordring av antigen og Evans Blue fargestoff. PCA-modellen kan redusere tiden det tar å fullføre forsøket, antall dyr som brukes, og la etterforskerne å se på de konkrete effektene av IgE kryssbinding.
Til tross for å ta lengre tid å utføre, er det noen fordeler med å bruke den aktive kutan anafylaksi (ACA) modellen beskrevet i denne artikkelen. Sensibilisering gjennom ukentlig eksponering for antigen ligner prosessen der individer utvikler allergisk sykdom, som allergi er vanligvis systemisk og folk generelt har både allergen-spesifikke IgE og IgG i omløp. Mens IgE kryssbinding er det primære middel for mast celle degranulation, mastceller også svare på IgG kryssbinding. Derfor, tillater ACA modell for forskere å undersøke mekanismer for allergiske reaksjoner, i tillegg til kun IgE-mediert sykdom. Som konklusjon, mens metoden som brukes for sensibilisering er på skjønn av undersøkeren, er den lokale anafylaksi assay allsidig og kan anvendes med en rekke allergiske metoder.
Ear hevelse, en vanlig brukt markør for vurdering av allergiske reaksjoner, kan også måles etter OVA utfordring. Vi har funnet ut at ørene utfordret med OVA har betydelig mer hevelse enn ørene utfordret med PBS ved 1 hr innlegg injeksjon. I motsetning til Evans Blue test, har vi observert at øret tykkelse målingene er mindre sensitiv enn fargestoff ekstravasasjon og viser større variabilitet mellom undersøkere som øre tykkelse kan forandres ved kompresjon av øret ved hjelp av måleutstyr som.
Musestammer annet ennBALB / c kan anvendes for den lokale anafylaksi assay; men avlesninger vil variere noe avhengig av belastningen brukes. På grunn av deres tilbøyelighet til å utvikle sterke Th2-responser, BALB / c-mus produserer generelt pålitelige, reproduserbare målinger med dette assay.
Denne analysen tillater kvantifisering av lokaliserte allergiske responser i dyr sensibilisert for en rekke forskjellige antigener. Antigen-valget er fleksibel, slik analyse er blitt vellykket utført med vanlige allergener, slik som OVA og albuskjell hemocyanin (KLH). Videre, i stedet for sensibilisering, en lokal allergisk reaksjon kan oppnås hos et naivt dyr ved injisering av antistoffer som kryss-kobling av IgE-eller IgE-reseptorer på basofiler og mastceller, eller ved ligering av ikke-IgE-aktivering reseptorer på disse cellene, som CD200R3 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z.
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
