Summary
Las respuestas alérgicas, caracterizados por la activación de los mastocitos y basófilos, están impulsados por la reticulación de IgE y liberación de mediadores proinflamatorios. Una evaluación cuantitativa de las respuestas alérgicas se puede lograr mediante el uso de colorante azul de Evans para monitorear los cambios en la permeabilidad vascular después de la provocación con alergeno.
Abstract
Las respuestas alérgicas son el resultado de la activación de los mastocitos y basófilos y la posterior liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios. La exposición a un alérgeno en un individuo sensibilizado puede dar lugar a síntomas clínicos que varían desde leves hasta anafilaxia eritema que amenazan la vida. En el laboratorio, se han desarrollado diversos modelos animales para comprender los mecanismos que impulsan respuestas alérgicas. En este documento, se describe un método detallado para medir los cambios en la permeabilidad vascular para cuantificar las respuestas alérgicas localizadas. El ensayo de la anafilaxia local fue reportado por primera vez en la década de 1920, y ha sido adaptada de la técnica publicada por Kojima et al. en 2007 1. En este ensayo, los ratones sensibilizados a OVA son desafiados en el oído izquierdo con vehículo y en la oreja derecha con OVA. Esto es seguido por una inyección intravenosa de colorante azul de Evans. Diez minutos después de la inyección de azul de Evans, el animal es sacrificado y el tinte que se ha extravasado enpara los oídos se extrae durante la noche en formamida. La absorbancia del colorante extraído se cuantificó luego con un espectrofotómetro. Este método da con fiabilidad una manifestación visual y cuantificable de una respuesta alérgica local.
Introduction
Hipersensibilidad de tipo I está mediada por reticulación inducida por el antígeno de la IgE en la superficie de mastocitos y basófilos. Esto da como resultado la desgranulación celular y la liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios tales como histamina, triptasa, y factor activador de plaquetas 2. Después de la liberación de mediadores preformados durante la degranulación de los mastocitos sintetizan y liberan prostaglandinas y leucotrienos, que aumentan aún más la permeabilidad vascular 3. La respuesta clínica inicial se produce rápidamente y se conoce como una "reacción inmediata". En la piel, una respuesta de roncha y eritema es fácilmente visible a pocos minutos de la exposición al antígeno. Dependiendo de la dosis del desafío, es posible observar una "respuesta de fase tardía" unos pocos horas más tarde. Hinchazón de fase tardía se debe a edema localizado y el reclutamiento de leucocitos en los tejidos 2. La histamina, generalmente considerado como el principal mediador de participar enrespuestas alérgicas inmediatas, actúa sobre los receptores de histamina 1 (HR1) expresó en los buques y los receptores de histamina 2 (HR2) expresado en el músculo liso. El efecto combinado aumenta el flujo sanguíneo y la permeabilidad vascular en el sitio de la inflamación 4.
Una variedad de modelos animales de la alergia se han desarrollado con el fin de estudiar los mecanismos implicados en la inflamación alérgica, incluyendo modelos de asma alérgica, anafilaxis sistémica y anafilaxia locales. La administración del colorante por vía intravenosa se ha utilizado para medir las respuestas alérgicas localizadas en modelos animales durante casi un siglo, con publicaciones que describe esta técnica que se remonta a la década de 1920 5. Los conejos y conejillos de Indias fueron los primeros modelos animales utilizados para probar las reacciones de hipersensibilidad inmediatas, y las respuestas más sensibles se encuentran generalmente en el oído 5,6. El ensayo fue posteriormente validada para su uso en ratas y ratones 7 8.
Históricamente, losuna variedad de métodos experimentales se han utilizado, incluyendo la inyección del antígeno antes de la inyección de colorante, la inyección de colorante antes de la inyección del antígeno, y la inyección simultánea de tinte y antígeno. La administración del colorante por vía intravenosa como un medio para la medición de las respuestas alérgicas es un ensayo versátil ya que puede ser utilizado para medir activo, pasivo, y revertir reacciones pasivas 5,9. Numerosos colorantes se han utilizado para evaluar las respuestas alérgicas, incluyendo azul de tripano, pontamina cielo azul, azul de Evans, Geigy Azul 536, y tinta de la India 5,6,9. Una solución de 0,5% azul de Evans es actualmente el colorante estándar utilizado para medir las respuestas alérgicas en la piel.
La respuesta anafiláctica a desafío es transitoria; intensidad máxima se alcanza de 10 - 15 min de la inyección de colorante, y no hay reacción es visible si tinte se administra más de 30 min después de la exposición, independientemente de las especies animales utilizadas 9. La cuantificación de la extravasación de colorante era originalLY obtiene midiendo el tamaño de la roncha como se indica por el colorante azul 7-9. Además, los recuentos de mastocitos desgranulados se pueden cuantificar mediante la escisión de tejido de la piel en el sitio de la reacción y la tinción con azul de toluidina 7. Degranulación de los mastocitos se utiliza a menudo como un marcador para cutánea, las respuestas alérgicas mediadas por IgE, como mastocitos son la principal población celular local que expresa el receptor de IgE de alta afinidad Fc RI. Se desarrollaron técnicas espectrofotométricas para la medición de la extravasación de colorante en el tejido de la anafilaxia cutánea pasiva (PCA) en la rata y el ratón 10 11 en los años 1990.
El siguiente protocolo de ensayo de la anafilaxia local fue adaptado de Kojima et al. 1, y utiliza la ovoalbúmina de huevo de pollo (OVA) como antígeno para provocar respuestas alérgicas. Sin embargo, los antígenos distintos de OVA se pueden usar si se desea. El ensayo se utiliza colorante azul de Evans para monitorear cambios en permeabilit vasculary que se producen debido a mastocitos IgE entrecruzamiento y la liberación de histamina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ratones Sensibilizar
- Preparar una solución madre de OVA mediante la dilución de OVA en PBS 1X a una concentración final de 20 mg / ml. Congele por alícuotas en crioviales y almacenar a -80 ° C para su uso futuro.
- Traiga una o más alícuotas de 20 mg / ml OVA de stock a temperatura ambiente. Diluir OVA en PBS 1X a una concentración final de 1 mg / ml en un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo con una tapa. Vortex brevemente para mezclar.
- Mientras sostiene el tubo de poliestireno que contiene el 1 mg / ml de OVA en un vórtice a velocidad media, añadir un volumen igual de bien homogeneizada Imject alumbre (40 mg / ml) gota a gota mientras se continúa vórtice del tubo para producir una proporción de 1: 1 de alumbre para inmunógeno.
- Coloque el tapón de tubo de tubo y cinta para vórtice. Gire vórtice en posición más baja y deje OVA para adsorber al alumbre durante 30 min.
- No permita que una gran cantidad de tiempo que pase entre la preparación de OVA / Alum y sensibilizar a los ratones. Si sensibilización no se puede completar directamente después de OVA / Alum preparation, almacenar OVA / Alum a temperatura ambiente. Vortex durante 1 min antes de usar.
- Cargue una jeringa de insulina de 1 ml con mezcla de OVA / Alum. Tape la jeringa con aguja de calibre 27.
- Inyectar 100 l de OVA / Alum en el peritoneo de ratones BALB / c para una dosis por ratón de 50 g de OVA y 2 mg de Alum.
- Para un control negativo, sensibilizar a otro grupo de ratones a PBS. Preparar una mezcla 1: 1 de alumbre y PBS de la misma manera como se indica anteriormente, la omisión de OVA.
- Sensibilizar a todos los ratones de control (OVA y PBS) una vez por semana durante 3 semanas para un total de 3 inyecciones. Después de la inyección final, espere por lo menos 2 semanas antes de realizar el ensayo de anafilaxis local.
2. Ensayo anafilaxia local
- Traiga OVA solución madre a temperatura ambiente. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, diluir 20 mg / ml de OVA de stock a una concentración final de 5 mg / ml con PBS (dilución 1: 4 de OVA en PBS 1X). Vortex brevemente para mezclar.
- Anestesiar a los ratones utilizando RC 2 </ Sup> Roedores Sistema de Anestesia (o sistema de entrega vaporizado comparable). Llene el depósito con isoflurano, y encienda el O 2 del flujo de aire. Coloque los ratones en cámara de inducción y ajustar dial de control de isoflurano al 5% para iniciar la anestesia. Una vez que los ratones se anestesiaron completamente, se indica por la falta de movilidad, ajuste dial de control de isoflurano al 3% para mantener la anestesia profunda. El propósito de la anestesia en este procedimiento es para inmovilizar el animal. Las inyecciones de la oreja y la cola de la vena no causan dolor significativo o trastornos a los animales.
NOTA: El isoflurano puede tener efectos negativos sobre el sistema reproductivo humano. Asegúrese de utilizar en una habitación bien ventilada y adjuntar un bote de barrido a la cámara de inducción para neutralizar los gases residuales. Si usted está embarazada mientras está usando isoflurano, use una máscara de filtro de carbono para minimizar la exposición. - Cargar 10 l de 5 mg / ml de OVA en una jeringa de insulina 3/10 cc tapado con una aguja 31 G. Cargar otra jeringa de insulina 3/10 cc con 10 lPBS 1x.
- Usando un microscopio de disección, inyectar 10 l de OVA en el oído derecho de un ratón anestesiado para una dosis de prueba de 50 g de OVA. Otros dosis, como 20 mg, también son aceptables.
- Para estabilizar el oído para inyección, envuélvalo con cinta scotch (parte adhesiva hacia arriba) en torno a un tubo cónico de 15 ml. Asegure el lado dorsal de la oreja derecha a la cinta. Inserte el lado bisel de la aguja entre las dos hojas de la oreja. Inyecte lentamente OVA en el centro del tejido de la oreja, con cuidado de no golpear a cualquier vaso sanguíneo.
- Usando el mismo método descrito anteriormente, se inyectan 10 l de PBS en la oreja izquierda como control negativo.
- Espere 3 min.
- Durante este tiempo, coloque el ratón en un retenedor y sostenga la cola bajo una lámpara de calor o en un baño de agua tibia durante 1 min para dilatar los vasos sanguíneos.
- Usando una jeringa de 1 ml de insulina tapado con una aguja de 27 G, inyectar lentamente 200 l de 0,5% de colorante azul de Evans en la cola vein del ratón. Se administra por inyección rápida puede destruir la estructura de los vasos antes de la totalidad de los 200 l. Si esto ocurre, intente inyectar el volumen restante del medio de contraste en la vena en el lado opuesto de la cola.
- Espere 10 min.
- La eutanasia el ratón y quite los dos oídos utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas.
- Agarrar los bordes de la oreja con fórceps, asegurándose de que no se aplica presión al sitio de inyección en el centro de la oreja. Quite la mayor cantidad de tejido del oído como sea posible mediante la reducción de cerca, pero no a través de la cordillera de cartílago presentes en la base de la oreja. Pequeñas cantidades de la piel pueden estar presentes en el oído extirpado; esto no afectará el ensayo.
- Alícuota de 700 l de formamida en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Preparar un tubo por el oído (dos tubos por ratón).
NOTA: La formamida es teratogénico, mutagénico, y un irritante. Usar guantes, protección para los ojos y la cara. Las mujeres embarazadas deben tener cuidado al manipular unas formamida puede ser fetotóxica. - Añadir oídos para formamida, tapar los tubos, y se incuba durante la noche en un baño de calor seco ajustado a 63 ° C. Orejas todavía pueden aparecer ligeramente azul después de la incubación; sin embargo la mayoría del colorante se extrajo en la formamida.
- Añadir 300 l de cada muestra, por duplicado, a una placa de 96 pocillos. Evitar la transferencia de la piel, si está presente en la muestra. Asegúrese de que no hay burbujas presentes en los pozos, ya que afectarán a la lectura de absorbencia.
- Añadir 300 l de formamida, por duplicado, a la placa de 96 pocillos. Estos pozos se utilizarán como espacios en blanco.
- Utilice un espectrofotómetro para medir la absorbancia a 620 nm. Pozos de formamida Restar de cada lectura de la muestra.
NOTA: Todos los experimentos se realizaron bajo los protocolos aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo de los Servicios Uniformados Universidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los animales que han sido sometidos a la prueba con éxito tendrán la piel y los ojos que aparecen de color azul. PBS animales sensibilizados no deben reaccionar a PBS o desafío OVA, por lo tanto ambos oídos deben permanecer blanco (Figura 1A). En los animales sensibilizados OVA, el oído recibir el desafío PBS (izquierda) debe ser completamente blanco o ligeramente azul en forma localizada en el sitio de inyección. El oído recibir el desafío OVA (derecha) debe convertirse en progresivamente más oscuro azul durante 10 min después de la administración del colorante (Figura 1B).
PBS animales sensibilizados tendrán lecturas de absorbancia insignificantes, tanto para el PBS y el desafío OVA (Figura 2A). Para los animales sensibilizados OVA, inyección de PBS generalmente resulta en una lectura de la absorbancia media de 0,13 y una desviación estándar de 0,04. Por el contrario, unos 50 mg OVA resultados de desafío en una lectura de la absorbancia media de 0,58 y una desviación estándar de 0,18 (Figura 2B). La cantidad de OVA utilizado para el desafío se puede ajustar para los experimentos individuales si es necesario. Por ejemplo, un reto OVA 20 mg resulta en una absorbancia media de 0,30 y una desviación estándar de 0,10 (Figura 2C), sin embargo, un reto menos de 20 g pueden no dar resultados fiables. Los cambios en la concentración de OVA deben ser optimizados y validados antes de su uso.
Los resultados pueden ser emparejados gráficamente, con PBS absorbancia en comparación con OVA absorbancia. Alternativamente, los resultados pueden ser graficados como un valor único, con la absorbancia PBS resta de la absorbancia OVA para cada animal individual.
Figura 1: pigmentación del oído en los animales PBS y OVA sensibilizado. (A). La pigmentación del oído en PBS sensibilizado animales. La oreja izquierda (desafiado con PBS) y la oreja derecha (desafiados con 50 g OVA) muestran poca o ninguna extravasación de colorante. (B). Pigmentación de la oreja en los animales sensibilizados OVA. No hay respuesta alérgica en el oído izquierdo (desafiado con PBS), como se indica por la ausencia de colorante azul de extravasación. La oreja derecha (desafiados con 50 g OVA) muestra una coloración azul brillante indicativo de aumento de la permeabilidad vascular, un resultado directo de la activación de células en el tejido de la oreja.
Figura 2: valores de DO representativos para animales sensibilizados OVA valores de DO obtenidos de mediciones espectrofotométricas tomadas a 620 nm (A)... 50 g desafío OVA en PBS animales sensibilizados. Valores de DO para tanto desafío PBS y OVA son insignificantes. (B). 50 mg OVA desafío en los animales sensibilizados OVA. Resultados de desafío de PBS en los valores de DO <0,2 y OVA desafío results en valores de DO> 0,3. (C). 20 mg OVA desafío. Resultados de desafío de PBS en los valores de DO <0,2. Las orejas derechas han reducido ligeramente los valores de DO debido a una menor dosis de desafío de OVA utilizado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numerosos marcadores de la enfermedad alérgica se utilizan para evaluar la solidez de las respuestas alérgicas tras la exposición de alérgenos, incluyendo cambios en los niveles de histamina circulantes, la producción de citocinas Th2, y el reclutamiento de células en el líquido broncoalveolar en el ajuste de la impugnación de las vías respiratorias. Mientras seguimiento de los cambios en estos parámetros es importante para el estudio de las reacciones alérgicas, marcadores biológicos no siempre se correlacionan con la enfermedad alérgica clínica. El ensayo de anafilaxis locales descrito en este protocolo proporciona una medición reproducible de la permeabilidad vascular localizada como un correlato de la enfermedad alérgica localizada. Mediante el uso de colorante azul de extravasación, este protocolo permite tanto la visualización y cuantificación relativa de una reacción alérgica localizada. En contraste con los ensayos de alergia que se basan en la puntuación clínica, el resultado primario de este ensayo (tinte extravasación azul medido por absorbancia espectrofotométrica) no está fácilmente sujeto a sesgo del observador. Otra Advantage es que los animales son sacrificados poco después de la exposición, lo que limita las molestias potencialmente causada por la exposición al alérgeno y la administración del colorante. El uso alternativo de un espectrofotómetro de mano descrito por Akiyama et al. 10 permite la medición continua de cambios en la permeabilidad vascular. Sin embargo, colorante azul de Evans es tóxico, y la inyección en última instancia conducir a los animales que necesitan ser sacrificados.
Mientras que este ensayo tiene una serie de fortalezas, tiene la limitación de ser un poco un desafío técnico. Fiabilidad de los resultados depende de inyecciones consistentes y exitosos del oído y de la vena de la cola. Si la dosis entera reto no se administra en el oído, si los resultados de inyección de oído en la punción obvia de un vaso sanguíneo, o si la inyección intravenosa azul de Evans no está completo, el animal deben excluirse del análisis. En nuestro laboratorio, los investigadores han tenido que practicar las inyecciones intradérmicas de oído para several semanas antes de desarrollar la competencia. Además, es importante para ejecutar controles apropiados para el ensayo. Específicamente, la inyección de PBS rutinariamente se debe utilizar como un control interno, como animales parecen responder de forma ligeramente diferente a los daños causados por la inserción de la aguja. La lectura PBS da una medida de línea de base para los cambios en la permeabilidad vascular inducida por la propia inyección. En lugar de utilizar inyecciones intradérmicas de oído, el ensayo también se puede aplicar a la piel de la espalda de los ratones. Los investigadores pueden encontrar esta ruta sea menos difícil técnicamente, y, además, permite la prueba de antígenos múltiples simultáneamente.
El ensayo de la anafilaxia local es extremadamente versátil, ya que la dosis de desafío se puede manipular dependiendo del experimento. Si es necesario observar los cambios en las respuestas alérgicas, puede ser beneficioso usar una dosis más baja OVA desafío, tal como 20 g. Esto permite un aumento de la sensibilidad en el monitoreo de los cambios en la absorción, comoque será menos probable que se alcance el punto de saturación para la activación de las células.
Además, este ensayo puede ser usado para estudiar la anafilaxis cutánea pasiva (PCA). En esta configuración, la IgE específica de antígeno se inyecta en una oreja y vehículo a la otra. 24 horas más tarde, el animal se da una exposición intravenosa de antígeno y colorante azul de Evans. El modelo PCA puede reducir el tiempo que se necesita para completar el experimento, el número de animales utilizados, y permitir a los investigadores a examinar los efectos específicos de IgE entrecruzamiento.
A pesar de tomar más tiempo para llevar a cabo, hay algunas ventajas de utilizar el modelo activo anafilaxia cutánea (ACA) se describe en este documento. Sensibilización a través de la exposición semanal al antígeno imita el proceso por el cual los individuos desarrollan la enfermedad alérgica, como la sensibilización suele ser sistémica y la gente en general tienen tanto alérgeno-específicas de IgE e IgG en la circulación. Mientras IgE reticulación es el principal medio de mala desgranulación de células st, los mastocitos también responden a IgG reticulación. Por lo tanto, el modelo ACA permite a los investigadores estudiar los mecanismos de respuestas alérgicas, además de la enfermedad sólo mediada por IgE. En conclusión, mientras que el método de la sensibilización utilizado es a discreción del investigador, el ensayo de la anafilaxia local es versátil y se puede utilizar con una variedad de metodologías de sensibilización.
Hinchazón del oído, un marcador comúnmente utilizado para evaluar las respuestas alérgicas, también se puede medir después del desafío OVA. Hemos encontrado que los oídos desafiados con OVA tienen significativamente más hinchazón de los oídos desafiados con PBS a 1 hr después de la inyección. En contraste con la prueba de azul de Evans, hemos observado que las mediciones de grosor de la oreja son menos sensibles que la extravasación de colorante y muestran una mayor variabilidad entre los investigadores como grosor de la oreja puede ser alterado por la compresión de la oreja cuando se utilizan dispositivos de medición.
Ratón cepas que no seaBALB / c se puede utilizar para el ensayo de la anafilaxia local; Sin embargo las lecturas de absorbancia variarán ligeramente en función de la cepa utilizada. Debido a su propensión a desarrollar fuertes respuestas de Th2, los ratones BALB / c generalmente producen lecturas fiables, reproducibles con este ensayo.
Este ensayo permite la cuantificación de las respuestas alérgicas localizadas en los animales sensibilizados a una variedad de antígenos. La selección de antígeno es flexible, ya que el ensayo se ha realizado con éxito con los alergenos comunes, tales como OVA y hemocianina de lapa californiana (KLH). Además, en lugar de la sensibilización, una reacción alérgica local se puede provocar en un animal mediante la inyección de anticuerpos ingenua de que los receptores de reticulación de IgE o de IgE sobre basófilos y mastocitos, o por ligación de receptores de activación no IgE en estas células, tales como CD200R3 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z.
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
