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Developmental Biology

मानव मेलेनोमा के ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54375
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 3,6
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

Abstract

पूर्व vivo के दत्तक हस्तांतरण का विस्तार ऑटोलॉगस ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (TILs) मेटास्टेटिक मेलेनोमा के साथ रोगियों की महत्वपूर्ण सबसेट में टिकाऊ और पूर्ण प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता कर सकते हैं। इस दृष्टिकोण के प्रमुख बाधाओं का तबादला टी कोशिकाओं, टेलोमेर छोटा करने की वजह से कम व्यवहार्यता हैं, और TILs की सीमित संख्या के रोगियों से प्राप्त की। लंबे टेलोमेयर के साथ कम से विभेदित टी कोशिकाओं दत्तक टी सेल थेरेपी के लिए एक आदर्श टी सेल सबसेट हो सकता है, हालांकि, इन कम-भेदभाव टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या पैदा समस्याग्रस्त है। दत्तक टी सेल थेरेपी की इस सीमा सैद्धांतिक रूप से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग (IPSCs) द्वारा दूर किया जा सकता है कि स्वयं को नवीनीकृत, pluripotency, लम्बी है telomeres बनाए रखने, और प्रतिरक्षा के लिए ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत प्रदान करते हैं। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल TILs में reprogramming कारकों के पारगमन के लिए सेंडाइ वायरस वैक्टर का उपयोग IPSCs उत्पन्न करने के लिए उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल उत्पन्नपूरी तरह से reprogrammed, वेक्टर मुक्त क्लोन है। ये तिल व्युत्पन्न IPSCs दत्तक टी सेल थेरेपी के लिए कम से भेदभाव कर रोगी और ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने में सक्षम हो सकता है।

Introduction

सेलुलर reprogramming प्रौद्योगिकी है कि प्रतिलेखन कारकों में से एक परिभाषित सेट की overexpression के माध्यम से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है सेल आधारित चिकित्सा 1,2 के क्षेत्र में काफी संभावनाएं हैं। ये IPSCs ट्रांसक्रिप्शनल और epigenetic सुविधाओं प्रदर्शन और आत्म नवीकरण और pluripotency के लिए क्षमता, वैसे ही भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) 3-5 कर दिया है। उल्लेखनीय पिछले एक दशक में reprogramming प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हुई प्रगति हमें इस तरह के टी कोशिकाओं 6-8 के रूप में टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं से भी मानव IPSCs उत्पन्न करने के लिए अनुमति दी गई है। टी सेल व्युत्पन्न IPSCs (TiPSCs) मूल टी कोशिकाओं के रूप में टी सेल रिसेप्टर (TCR) श्रृंखला जीन की ही पुन: व्यवस्थित विन्यास, जो TiPSCs 9-11 से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के उत्थान के लिए अनुमति देता बरकरार रहती है।

मेलेनोमा-घुसपैठ लिम्फोसाइटों का लगभग 80% (TILs) प्राप्त एक मरीज की ट्यूमर से विशेष रूप से समझते हैं ट्यूमर जुड़े एंटीजन एकएन डी मूल कैंसर की कोशिकाओं को 12 के खिलाफ cytotoxicity बनाए रखें। विशेष रूप से, TILs पर प्रोग्राम कोशिका मृत्यु प्रोटीन -1 (पीडी -1) की अभिव्यक्ति ऑटोलॉगस ट्यूमर प्रतिक्रियाशील प्रदर्शनों की सूची की पहचान करने के लिए मिला था, उत्परिवर्तित neoantigen विशेष सीडी 8 + लिम्फोसाइटों 13 भी शामिल है। प्रारंभिक lymphodepleting परहेजों और इंटरल्यूकिन -2 (IL-2) के प्रणालीगत प्रशासन के साथ संयोजन में पूर्व vivo का विस्तार ऑटोलॉगस TILs के दत्तक हस्तांतरण रोगियों 14 के सबसेट में मेटास्टेटिक मेलेनोमा की पर्याप्त प्रतिगमन पैदा कर सकता है। preclinical मॉडल में और रोगियों में परिणाम उत्साहजनक के बावजूद, संचार टी कोशिकाओं की गरीब अस्तित्व और प्रतिरक्षा दमनकारी रास्ते के अस्तित्व को दत्तक टी सेल थेरेपी की पूरी क्षमता का समझौता करने के लिए दिखाई देते हैं। वर्तमान नैदानिक प्रोटोकॉल आदेश बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं की व्यापक पूर्व vivo में गड़बड़ी की आवश्यकता होती है। इस टर्मिनली विभेदित टी कोशिकाओं गरीब अस्तित्व है, कम prol की पीढ़ी में यह परिणामiferative क्षमता है, और पीडी -1 15 के उच्च स्तरों।

दत्तक टी सेल थेरेपी की इस सीमा सैद्धांतिक रूप से IPSCs कि प्रतिरक्षा के लिए ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत प्रदान कर सकते हैं का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। हमने हाल ही में सेंडाइ वायरस (सेव) चार प्रतिलेखन कारक की मध्यस्थता पारगमन, OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC 16 से पीडी -1 के उच्च स्तर व्यक्त मेलेनोमा TILs के reprogramming की सूचना है। जबकि रेट्रोवायरस वैक्टर मेजबान गुणसूत्रों में एकीकरण की आवश्यकता reprogramming जीन व्यक्त करने के लिए, सेव वैक्टर गैर एकीकृत कर रहे हैं और अंत में कोशिका द्रव्य से समाप्त हो जाते हैं। Reprogramming दक्षता ज्यादा lentivirus या रेट्रोवायरस वैक्टर 6-8 के साथ तुलना में एक सेव सिस्टम के साथ अधिक है। इसके अलावा, सेव विशेष रूप से, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) में टी कोशिकाओं reprogram कर सकते हैं कुछ IPSC lentivirus या रेट्रोवायरस वैक्टर द्वारा उत्पन्न क्लोन nonlymphoid प्रजातियों 6-8 से किया जा सकता है। यहाँ, हम विस्तारप्रक्रियाओं अलगाव और मानव मेलेनोमा TILs के सक्रियण के लिए और एक सेव reprogramming प्रणाली का उपयोग करते हुए तिल व्युत्पन्न IPSCs की पीढ़ी के लिए लागू किया है।

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Protocol

नोट: मरीजों को सूचित सहमति स्टेम सेल समिति अध्ययन अनुमोदित संस्थागत समीक्षा बोर्ड और मानव pluripotent में भाग लेने के लिए देना चाहिए।

1. अलगाव और TILs की संस्कृति

  1. ट्यूमर सामग्री है कि पैथोलॉजी सेवा / ऊतक खरीद कोर से histopathologic निदान के लिए आवश्यक नहीं है प्राप्त करते हैं। ट्यूमर नमूनों में से 20-100 ग्राम 30 मिलीग्राम ट्यूमर एकत्रित मीडिया (तालिका 1) के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें।
  2. काटना ठोस, फर्म, कैंची का उपयोग नाजुक और / या खूनी परिगलित क्षेत्रों से ट्यूमर नमूना के सामान्य ऊतकों। परिगलित ऊतक को हटाने के बाद, संभव के रूप में छोटे रूप में नमूना भरती करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  3. एक dissociator और ट्यूमर हदबंदी किट (मानव) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन में कीमा नमूना अलग कर देना। एक 70 माइक्रोन सेल झरनी कि एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर सेट किया जाता है के साथ निलंबन फिल्टर और छलनी के साथ 2 बार धोनेRPMI 1640 के 2 मिलीलीटर।
  4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और टी सेल मीडिया (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
  5. ऐसे Ficoll (ढाल समाधान) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, 100% ढाल समाधान के 10 मिलीलीटर की एक निचली कदम और 75% ढाल समाधान के 30 मिलीलीटर की एक मध्य कदम Dulbecco के phosphate- से पतला साथ के रूप में एक दो कदम ढाल समाधान तैयार बफर खारा, कोई कैल्शियम, मैग्नीशियम कोई (डी पीबीएस (-))।
  6. सेल निलंबन ढाल समाधान (1.5 कदम से) पर (1.4 कदम से) परत। 45 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. परत 100% ढाल समाधान और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 75% ढाल समाधान के बीच इंटरफेस में समृद्ध TILs युक्त लीजिए। डी-पीबीएस के 20-30 मिलीलीटर जोड़कर समृद्ध TILs के साथ समाधान की परत पतला (-)।
  8. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 मिलीलीटर में तिल-समृद्ध अंश resuspendटी सेल मीडिया की।
  9. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर अंश (चरण में 1.8 से) 6 अच्छी तरह से थाली में आईएल -2 टी सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर और 6,000 आइयू / एमएल पुनः संयोजक मानव (आरएच) के साथ, 5% सीओ 2।
  10. संस्कृति दीक्षा के बाद 5 दिन पर आधा मीडिया को बदलें और हर 2-3 दिनों उसके बाद।
  11. धीरे निलंबित, कुओं की संख्या दोगुनी जब 80-90% confluency तक पहुंचने के बाद trypsinization बिना 2: 1 के अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित। 6,000 आइयू / मिलीलीटर पर ताजा टी सेल मीडिया और rhIL-2 के एक आधी मात्रा (1 मिलीलीटर) जोड़ें।

2. Mitomycin-सी का इलाज एसएनएल फीडर सेल प्लेट की तैयारी

  1. जब तक 80-90% संगम (3-4 एक्स 10 6 कोशिकाओं) एक 0.1% जिलेटिन लेपित 10 सेमी पकवान पर एसएनएल फीडर सेल मीडिया (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर में संस्कृति एसएनएल फीडर कोशिकाओं तक पहुँच जाता है।
  2. सीधे एसएनएल फीडर सेल संस्कृति डिश में 0.4 मिलीग्राम / एमएल mitomycin सी समाधान के 310 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 घंटा और 15 मिनट के लिए सीओ 2 पर सेते हैं। महाप्राण मीडिया एकएन डी 5 मिलीलीटर डी पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो (-)।
  3. 0.5 0.25% की मिलीलीटर trypsin / 1 मिमी EDTA जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते कोशिकाओं को अलग कर देना। एसएनएल फीडर सेल मीडिया के 4.5 मिलीलीटर बेअसर करने के लिए जोड़ सकते हैं और एक भी निलंबन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  4. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्थानांतरण। मीडिया Aspirate और बाद एसएनएल फीडर सेल मीडिया के 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती।
  5. प्लेट एक 10 सेमी पकवान पर एसएनएल फीडर कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्रति 1.5 x 10 6 कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 5% सीओ 2। 3 दिन के भीतर एसएनएल फीडर कोशिकाओं का प्रयोग करें।

3. सेंडाइ वायरस का उपयोग IPSCs की पीढ़ी (सेव) वेक्टर

  1. फसल TILs और प्लेट बाध्य माउस विरोधी मानव CD3 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ TILs के 5 x 10 5 कोशिकाओं को सक्रिय करने और घुलनशील माउस विरोधी मानव CD28 (/ एमएल 5 माइक्रोग्राम) (चरण 1.11 से), rhIL-2 के साथ टी सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर में 6 अच्छी तरह से थाली में 3 पर (6,000 आइयू / एमएल)7 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 से 5 दिनों के लिए।
  2. TILs एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक पिपेट का उपयोग (3.1 चरण से) फसल और एक hemocytometer साथ सेल संख्या गिनती।
  3. 500 μl में 1 एक्स 10 5 TILs की थाली बाध्य माउस विरोधी मानव CD3 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ rhIL-2 के साथ कोशिकाओं और घुलनशील माउस विरोधी मानव CD28 (5 माइक्रोग्राम / एमएल), (60 आइयू / एमएल) को पुनः सक्रिय 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 24 अच्छी तरह से थाली में reprogramming मीडिया (तालिका 1) अच्छी तरह से प्रति 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के। सेव संक्रमण के लिए 3 कुओं तैयार: OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC (1 अच्छी तरह से); सेव संक्रमण (GFP: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) (1 अच्छी तरह से); और कोशिकाओं की संख्या (1 अच्छी तरह से)।
  4. 24 घंटा (3.3 कदम से) के बाद, एक hemocytometer साथ सेल संख्या गिनने और विभिन्न (3-20) संक्रमण की multiplicities (MOI) के लिए प्रत्येक वायरस की मात्रा का निर्धारण। -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेंडाइ वायरस वेक्टर नलियों के समूह निकालें। एक पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में जल्दी सेव वैक्टर गला लें और बर्फ पर उन्हें जगह है।
    वायरस की मात्रा (μl)= MOI (CIU / सेल) कोशिकाओं की संख्या एक्स वायरस का / अनुमापांक (CIU / एमएल) × 10-3 (μl / एमएल)
  5. चार सेंडाइ वायरस वेक्टर ट्यूबों कि व्यक्तिगत रूप से किया OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC में से प्रत्येक की गणना की मात्रा में सक्रिय TILs सहित मीडिया में 10-20 MOI में सेव वैक्टर का एक मिश्रण जोड़कर जोड़ें।
  6. पारगमन दक्षता का निर्धारण करने के लिए, सक्रिय TILs के एक कुएं में सेव-GFP की गणना की मात्रा में जोड़ें।
  7. डिश (3.5 कदम से कदम और 3.6) की जगह 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में। 24 घंटे के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत सेव-GFP के साथ संक्रमित TILs संक्रमण का उपयोग दक्षता का अनुमान है।
  8. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में (3.5 कदम से) कोशिकाओं को ले लीजिए। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्राइमेट ते सेल मध्यम और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF, 4 एनजी / एमएल) के साथ hESC मीडिया के 0.5 मिलीलीटर में गोली resuspend।
  10. एक 10 सेमी पकवान है कि conta में निलंबन स्थानांतरणhESC मीडिया के 10 मिलीलीटर में आईएनएस mitomycin-सी का इलाज एसएनएल फीडर कोशिकाओं। hESC मीडिया हर दूसरे दिन बदल जब तक कालोनियों बड़े हो रहे हैं।
  11. 21 करने के लिए 18 दिन के आसपास, साफ बेंच में एक 10 μl टिप का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे कालोनियों के आसपास एसएनएल फीडर कोशिकाओं को हटा दें।
  12. एक 10 μl टिप का उपयोग कर कालोनियों परिमार्जन और एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के प्रति अच्छी तरह से IPSCs मीडिया के 100 μl में एक 200 μl टिप का उपयोग कर उन्हें हस्तांतरण। Pipet और 2-3 बार में नीचे 50-100 माइक्रोन के एक औसत आकार के साथ छोटे गुच्छों में कालोनियों को तोड़ने।
  13. mitomycin-सी का इलाज एसएनएल फीडर कोशिकाओं बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF, 4 एनजी / एमएल) के साथ IPSCs मीडिया के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर में (चरण 2 से) के साथ 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में छोटे गुच्छों स्थानांतरण। IPSCs मीडिया बदलें हर दिन है।
  14. हर 5-6 दिन 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase चतुर्थ के साथ नए सिरे mitomycin-सी का इलाज एसएनएल फीडर कोशिकाओं के साथ 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट को IPSCs स्थानांतरण। Immun के लिए प्रत्येक क्लोन की प्लेटों प्रति 2 कुओं तैयारostaining।
  15. Pluripotency मार्कर (SSEA3, SSEA4, टीआरए-1-60, टीआरए-1-81, और OCT3 / 4) 1 के immunohistochemical धुंधला द्वारा प्रत्येक क्लोन से भरा reprogramming निर्धारित करते हैं।
    नोट: pluripotency क्षमता का आगे मूल्यांकन के लिए, इस बात की पुष्टि है कि पूरी तरह से reprogrammed IPSC लाइनों एक embryoid शरीर के गठन और भेदभाव परख या एक टेराटोमा गठन परख 16 से तीन रोगाणु परतों में अंतर कर सकते हैं।
  16. पुष्टि करें कि पूरी तरह से reprogrammed IPSC लाइनों cytogenetic विश्लेषण द्वारा एक सामान्य कुपोषण प्रदर्शित करता है।
  17. टेराटोमा गठन के लिए, एक undifferentiated तिल व्युत्पन्न IPSC (1 x 10 6) DMEM 6-8 सप्ताह पुराने महिला इशारा / SCID चूहों के चमड़े के नीचे ऊतक में से युक्त 10% एफसीएस के 100 μl में निलंबन इंजेक्षन। hematoxylin और eosin के साथ दाग टेराटोमा वर्गों।

4. SSEA3, SSEA4, TRA1-60 और TRA1-81 के लिए IPSCs के immunofluorescence धुंधला

  1. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ धो IPSCs और 4% वार्षिक की 1 मिलीलीटर के साथ IPSCs ठीक10 मिनट के लिए raformaldehyde समाधान। 4% paraformaldehyde समाधान निकालें और पीबीएस 3 बार के 1 मिलीलीटर के साथ IPSCs धो लें।
    नोट: जब paraformaldehyde का उपयोग कर, क्योंकि यह जहरीला है सावधान रहें।
  2. 30 मिनट के लिए बफर (तालिका 1) को रोकने के साथ IPSCs Pretreat। इस बीच, प्राथमिक एंटीबॉडी (चूहा विरोधी मानव SSEA3, माउस विरोधी मानव SSEA4, माउस विरोधी मानव TRA1-60, और माउस विरोधी मानव TRA1-81) 1:50 1.5% बकरी सीरम समाधान पीबीएस और TritonX से पतला पतला -100 (कुल मात्रा: 1 मिलीलीटर)।
  3. अवरुद्ध बफर (तालिका 1) निकालें। पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। इस बीच, माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी माउस आईजीजी और आईजीएम या विरोधी चूहा आईजीएम) 1:50 1.5% में बकरी सीरम समाधान पतला।
  4. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर पीबीएस 3 बार, प्रत्येक के साथ IPSCs धो लें। पतला एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और एक अंधेरे कमरे में कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए सेते हैं। पतला एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए पीबीएस 3 बार के 1 मिलीलीटर, प्रत्येक के साथ IPSCs धो लें। immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ IPSCs निरीक्षण करें।

Oct3 के लिए IPSCs 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला / 4

  1. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ धो IPSCs और 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ IPSCs तय कर लो। 4% paraformaldehyde समाधान निकालें और पीबीएस 3 बार के साथ IPSCs धो लें।
  2. Permeabilization बफर (तालिका 1) जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। Permeabilization बफर निकालें और अवरुद्ध बफर (तालिका 1) जोड़ें।
  3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। इस बीच, बफर अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस विरोधी मानव Oct3 / 4) 01:50 पतला।
  4. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 3 बार, हर पीबीएस के 1ml के साथ IPSCs धो लें। इस बीच, diवीणा माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी माउस आईजीजी / आईजीएम) 1: 100 अवरुद्ध बफर में।
  6. पतला एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और 45 मिनट के लिए एक अंधेरे कमरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  7. पतला माध्यमिक समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए पीबीएस 3 बार के 1 मिलीलीटर, प्रत्येक के साथ IPSCs धो लें। immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के तहत IPSCs निरीक्षण करें।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रक्रिया है कि rhIL-2 के साथ मेलेनोमा TILs है, जो और विरोधी CD3 / CD28 के साथ सक्रियण TILs को OCT3 / 4, KLF4, Sox2, और सी-MYC का जीन स्थानांतरण के बाद है की प्रारंभिक विस्तार शामिल है का अवलोकन से पता चलता है IPSCs की पीढ़ी के लिए। आमतौर पर, rhIL -2 शुरुआत के साथ संस्कृति पर TILs क्षेत्रों संस्कृति की दीक्षा के बाद 21-28 दिनों के रूप में। इस बिंदु पर, TILs विरोधी CD3 के साथ सक्रिय होने के लिए तैयार कर रहे हैं / CD28। चित्रा 2A TILs, संस्कृति पर rhIL-2 21 दिन पर, उस के साथ सक्रिय हो करने के लिए तैयार हैं के साथ चलता विरोधी CD3 / CD28। चित्रा 2 बी GFP परिचय से पता चलता है सेंडाइ वायरस (सेव) 20 पर ट्रांसफ़ेक्ट द्वारा MOI। चित्रा -2 एसएनएल फीडर कोशिकाओं है कि 18-21 दिनों सेव संक्रमण के बाद दिखाई देता है पर एक ठेठ pluripotent क्लोन से पता चलता है। चित्रा 2 डी से पता चलता है कि उत्पन्न तिल व्युत्पन्न IPSCs एक सामान्य कुपोषण है। 3 से पता चलता चित्रा immunofluorescent धुंधला पी पुष्टि करने के लिएIPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60, और OCT3 / 4) पर luripotency मार्कर अभिव्यक्ति। चित्रा 4 से पता चलता है कि IPSCs मेलेनोमा TILs से निकाली गई टेराटोमा कि तीन रोगाणु परतों से कोशिकाओं की एक किस्म के होते हैं बनाने में सक्षम हैं (तंत्रिका ऊतक, श्वसन उपकला, और उपास्थि)। 5 पता चलता है कि उत्पन्न तिल व्युत्पन्न IPSCs TCR rearrangements बनाए रखने चित्रा।

आकृति 1
चित्रा 1:। मेलेनोमा TILs से IPSCs की पीढ़ी के योजनाबद्ध सिंहावलोकन प्रोटोकॉल तीन चरणों में शामिल: IL-2 के साथ अलगाव और TILs की संस्कृति, विरोधी CD3 / CD28, और सेंडाइ वायरस के साथ सेल reprogramming के साथ टी सेल सक्रियण (सेव) वेक्टर एन्कोडिंग OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वर्ग = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> चित्र 2
चित्रा 2:। मेलेनोमा से IPSCs की पीढ़ी TILs (ए) एक छवि rhIL -2 में TILs की आकृति विज्ञान का प्रतिनिधित्व करने के लिए जब वे संस्कृति की दीक्षा के बाद 2-3 सप्ताह का विस्तार करने के लिए शुरू कर दिया। (बी) के संक्रमण के बाद सेव TILs एक दिन की आकृति विज्ञान और GFP अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व छवियाँ। (सी) एक ठेठ ईएससी-तरह IPSC सेव संक्रमण के बाद 21 दिन पर कॉलोनी। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। (डी) IPSCs मेलेनोमा TILs से प्राप्त एक से बीस जी बंधी metaphase कोशिकाओं पर Cytogenetic विश्लेषण। चित्रा (डी) उल्लेख किया गया था एट अल 16 से अनुकूलित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। Pluripotent स्टेम सेल मार्कर के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला immunofluorescence परख से पता चलता है कि दो रोगियों से तिल व्युत्पन्न IPSCs SSEA3, SSEA4, टीआरए-1-81, टीआरए-1-60, और OCT3 / 4 के लिए सकारात्मक रहे हैं। स्केल सलाखों = 100 μm.The आंकड़ा उल्लेख किया गया था एट अल 16 से अनुकूलित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। और टेराटोमा गठन Hematoxylin- साथ IPSCs eosin से सना हुआ प्रतिनिधि टेराटोमा वर्गों तिल व्युत्पन्न IPSCs क्लोन (इशारा / SCID चूहों में 6 सप्ताह के बाद इंजेक्शन) से व्युत्पन्न के लिए pluripotency की पुष्टि दिखाए जाते हैं। उल्लेख किया गया था एट अल 16 से अनुकूलित चित्रा।.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। तिल-तिल IPSCs में-IPSCs TCR-β जीन rearrangements में TCR-β जीन व्यवस्था पैटर्न की एक विस्तृत विविधता केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा पहचाने जाते हैं। हरे रंग की लाइन Jβ1 जीन के लिए बैंड से ली गई है, और ब्लू लाइन Jβ2 जीन के लिए बैंड से ली गई है। चित्रा उल्लेख किया गया था एट अल 16 से अनुकूलित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: टी सेल, reprogramming, टी के लिए संरचनाumor, एकत्रित एसएनएल फीडर सेल, और IPSC मीडिया, और permeabilization और अवरुद्ध बफ़र्स। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC कारकों चार प्रतिलेखन के सेव की मध्यस्थता पारगमन द्वारा IPSCs को मेलेनोमा TILs reprogramming के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। यह दृष्टिकोण, टी कोशिकाओं reprogram करने के लिए एक प्रणाली का उपयोग कर सेव, एक गैर समेकित करने के विधि 7 का लाभ प्रदान करता है।

पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि एक सेव reprogramming प्रणाली अत्यधिक कुशल और न केवल fibroblasts लेकिन यह भी परिधीय रक्त टी कोशिकाओं 7,17 reprogram करने के लिए विश्वसनीय था। इसके अलावा, हम हाल ही में पता चला है कि मेलेनोमा TILs है कि और अधिक अलग-अलग होते हैं और इस तरह के पीडी -1 परिधीय रक्त टी कोशिकाओं को भी सेव वैक्टर 16 का उपयोग reprogrammed किया जा सकता की तुलना में निरोधात्मक रिसेप्टर्स के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। और सेव वेक्टर के साथ विरोधी CD3 / CD28 के साथ उत्तेजना संक्रमण का समय reprogramming TILs में महत्वपूर्ण था। परिधीय रक्त टी कोशिकाओं विषय 7, whil से कटाई के तुरंत बाद reprogramming के लिए विरोधी CD3 और आईएल -2 के साथ प्रेरित किया जा सकताई TILs उत्तेजना से पहले आईएल -2 के साथ 3-4 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत होने की जरूरत है।

हालांकि TILs के 99% से अधिक आईएल -2 और विरोधी CD3 साथ सक्रियण के साथ थे संस्कृति के 3-4 सप्ताह के बाद CD8 टी कोशिकाओं / CD28 16, हम अनुशंसा करते पुष्टि करने के लिए IPSCs में TCR पुनर्व्यवस्था के विश्लेषण उत्पन्न कि IPSCs TILs से कर रहे हैं (चित्रा 5)। ध्यान से, हमारा सहित पिछले अध्ययनों में संकेत दिया है कि हर IPSCs परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear से सेव का उपयोग कर उत्पन्न या TILs TCR पुनर्व्यवस्था 7,16 था।

हालांकि मेलेनोमा TILs से IPSCs की पीढ़ी संभव था, हमने पाया कि मेलेनोमा TILs के reprogramming दक्षता कम थी (0.01-0.05%) 16 परिधीय रक्त टी कोशिकाओं (0.1%) 7 की तुलना में। इस का कारण यह स्पष्ट नहीं हुआ है, लेकिन यह निरोधात्मक रिसेप्टर्स की उच्च अभिव्यक्ति या TILs 13,16 में भेदभाव टी सेल सबसेट की अधिक से अधिक संख्या के साथ जुड़ा हो सकता है। हाल ही में महत्वपूर्ण प्रगतिreprogramming प्रौद्योगिकी के लिए तिल-IPSCs की पीढ़ी के लिए reprogramming दक्षता में सुधार कर सकते हैं। दूसरी पीढ़ी सेव वेक्टर, TS12KOS, पिछले अध्ययन 18,19 में इस्तेमाल पारंपरिक सेव वेक्टर से IPSC पीढ़ी के उच्च दक्षता है पाया गया था।

हालांकि एक सेव reprogramming प्रणाली के साथ मानव IPSCs की व्युत्पत्ति संभव है, वहाँ कई सीमाओं इस प्रोटोकॉल में विचार किया जाना है। हम इस प्रोटोकॉल में सेव संक्रमण के दौरान भ्रूण गोजातीय सीरम का उपयोग करें। हमने पाया है कि मेलेनोमा TILs के reprogramming दक्षता काफी कम थी, तो सेव संक्रमण के दौरान मानव सीरम के साथ मीडिया का उपयोग भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ एक की तुलना में, TILs के इसी तरह के प्रसार के बावजूद। हम यह भी IPSC पीढ़ी और रखरखाव के लिए एक माउस फीडर परत का उपयोग करें, लेकिन एक परिभाषित फीडर से मुक्त और Xeno मुक्त प्रणाली भविष्य के अध्ययनों में वैकल्पिक तरीकों हो सकता है।

यह ट्यूमर फसल के समय IPSCs उत्पन्न करने से दो महीने के आसपास लेता हैमेलेनोमा TILs से। इसके अलावा, यह एक अतिरिक्त 1-2 महीने का समय लग ट्रांस्जीन मुक्त IPSCs प्राप्त करने के लिए होगा। इस सेव वेक्टर, TS12KOS है, जो एक अधिक कुशल वायरस उन्मूलन दर 19 से पता चला है के नए प्रकार के उपयोग से छोटा किया जा सकता है।

अंत में, मेलेनोमा TILs से मानव IPSCs की पीढ़ी के लिए संभव है। वर्तमान प्रोटोकॉल दत्तक टी सेल थेरेपी के लिए ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं की एक अनंत संख्या पैदा करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentle MACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentle MACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929
RPMI 1640 Life technologies 11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer BD 352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes BD 352070
IMDM Life technologies 12440053
human AB serum Life technologies 34005100
L-glutamine (200mM) Life technologies 25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) Life technologies 21985-023
Penicillin-Streptomycin  Life technologies 15140-122
gentamicin Life technologies 15750-060
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-02
D-PBS (-) Life technologies 14040-133
recombinant human (rh) IL-2 Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 BD 555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 BD 555725
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
FBS Gibco 26140-079
HEPES Life technologies 15630-080
N-Acetylcysteine Cumberland Pharmaceuticals Inc. NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well) Corning 353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well) Corning 353047
Sendai virus vector DNAVEC
SNL feeder cells Cell Biolabs, Inc CBA-316
mitomycin C SIGMA M4287 soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin SIGMA G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF) Life technologies PHG0264

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 117 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल Reprogramming ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों टी कोशिकाओं मेलेनोमा सेंडाइ वायरस वेक्टर मानव CD3 CD28 आईएल -2
मानव मेलेनोमा के ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
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Saito, H., Iwabuchi, K., Fusaki, N., Ito, F. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54375, doi:10.3791/54375 (2016).

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