Abstract
Adoptiv överföring av ex vivo expanderade autologa tumörinfiltrerande lymfocyter (TIL) kan förmedla varaktiga och fullständiga svar i betydande delmängder av patienter med metastaserande melanom. Största hindren för detta tillvägagångssätt är reducerad livskraft överförda T-celler, som orsakas av telomerförkortning och det begränsade antalet TIL erhållits från patienter. Mindre differentierade T-celler med långa telomerer skulle vara en idealisk T-cellunderuppsättning för adoptiv T-cellsterapi, men generera stora antal av dessa mindre differentierade T-celler är problematiskt. Denna begränsning av adoptiv T-cellsterapi kan teoretiskt övervinnas genom användning av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) att själv förnya, underhålla pluripotens, har långsträckta telomerer, och ger en obegränsad källa av autologa T-celler för immunterapi. Här presenterar vi ett protokoll för att generera iPSCs använder Sendai virusvektorer för transduktion av omprogrammering faktorer TIL. Detta protokoll genererarär helt omprogrammerade, vektorfria kloner. Dessa TIL-härledda iPSCs skulle kunna generera mindre differentierade patient- och tumörspecifika T-celler för adoptiv T-cellterapi.
Introduction
Cellular omprogrammering teknik som möjliggör generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) via överuttryck av en definierad uppsättning av transkriptionsfaktorer är mycket lovande när det gäller cellbaserade terapier 1,2. Dessa iPSCs uppvisar transkriptions- och epigenetiska funktioner och har förmåga till självförnyelse och pluripotens, i likhet med embryonala stamceller (ESC) 3-5. Anmärkningsvärda framsteg gjorts i omprogrammering teknik under det senaste decenniet har gett oss möjlighet att skapa mänskliga iPSCs även från terminalt differentierade celler, såsom T-celler 6-8. T-cell-härledda iPSCs (TiPSCs) behåller samma rearrangerade konfiguration av T-cellreceptor (TCR) kedjegener som de ursprungliga T-celler, som tillåter regenerering av antigenspecifika T-celler från TiPSCs 9-11.
Nästan 80% av melanom-infiltrerande lymfocyter (TIL) erhållna från en patients tumör specifikt känna igen tumörassocierade antigener ennd behålla cytotoxicitet mot de ursprungliga cancerceller 12. Noterbart var ett uttryck för programmerad celldöd protein-1 (PD-1) på TIL fann att identifiera autologa tumörreaktiva repertoar, inklusive muterade neoantigen specifika CD8 + lymfocyter 13. Adoptiv överföring av ex vivo expanderade autologa TIL i kombination med förberedande lymphodepleting regimer och systemisk administrering av interleukin-2 (IL-2) kan orsaka avsevärd regression av metastaserande melanom i delmängder av patienter 14. Trots uppmuntrande resultat i prekliniska modeller och i patienter, dålig överlevnad infunderas T-celler och förekomsten av immunsuppressiva vägar tycks äventyra den fulla potentialen av adoptiv T-cellsterapi. Nuvarande kliniska protokoll kräver omfattande ex vivo manipulering av autologa T-celler i syfte att erhålla stora antal. Detta resulterar i generering av terminalt differentierade T-celler som har dålig överlevnad, minskad proliferative kapacitet och höga nivåer av PD-1 15.
Denna begränsning av adoptiv T-cellsterapi kan teoretiskt övervinnas genom att använda iPSCs som kan ge en obegränsad källa av autologa T-celler för immunterapi. Vi har nyligen rapporterat omprogrammeringen av melanom TIL som uttrycker höga nivåer av PD-1 by Sendai-virus (SeV) -medierad transduktion av de fyra transkriptionsfaktorer, OCT3 / 4, Sox2, Klf4, och c-MYC 16. Medan retrovirusvektorer kräver integration i värdkromosomer att uttrycka omprogrammering gener, SEV vektorer är icke-integrerande och så småningom elimineras från cytoplasman. Omprogrammering effektivitet är mycket högre med en SeV system jämfört med lentivirus eller retrovirusvektorer 6-8. Dessutom SeV kan specifikt programmera T-celler i perifera mononukleära blodceller (PBMC), medan vissa IPSC kloner som genereras av lentivirus eller retrovirusvektorer kan vara från nonlymphoid linjer 6-8. Här har vi detaljde förfaranden som genomförs för isolering och aktivering av humant melanom TIL och för generering av TIL-härledda iPSCs med användning av en SeV omprogrammering system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Patienterna bör ge sitt informerade samtycke att delta i Institutional Review Board och Human pluripotenta stamceller Utskottet godkände studien.
1. Isolering och odling av TIL
- Erhålla tumörmaterial som inte behövs för histopatologisk diagnos från kärnan patologi tjänsten / vävnads upphandling. Placera 20-100 g tumörprover i en 50-ml rör med 30 ml tumör samla media (tabell 1).
- Dissekera fast, fast, normal vävnad av tumörprov från ömtåliga och / eller blodiga nekrotiska områden med sax. Efter avlägsnande av nekrotisk vävnad, använd sax för att mala provet så små som möjligt.
- Dissociera det malda provet i en enkelcellsuspension med användning av en dissociator och tumör dissociation kit (human) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Filtrera suspensionen med en 70 ìm cell sil som ligger på en 50 ml rör och tvätta silen 2 gånger med2 ml RPMI 1640.
- Centrifugera vid 200 x g vid rumstemperatur under 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml T-cellmedium (tabell 1).
- Bered en två-steggradient lösning såsom Ficoll (gradient lösning) i en 50-ml rör, med en nedre steg av 10 ml 100% gradient lösning och ett mittsteg av 30 ml av 75% gradient utspäddes lösningen med Dulbeccos fosfat- buffrad saltlösning, inget kalcium, ingen magnesium (D-PBS (-)).
- Layer cellsuspensionen (från steg 1,4) på lutningen lösning (från steg 1,5). Centrifugera vid 400 xg vid 20 ° C under 45 min.
- Samla in det skikt som innehåller de anrikade TILs vid gränsytan mellan den 100% gradientlösningen och gradienten lösning 75% i ett 50 ml rör. Späd skikt av lösningen med de anrikade TILs genom tillsats av 20-30 ml av D-PBS (-).
- Centrifugera vid 200 x g vid rumstemperatur under 5 min. Kassera supernatanten och resuspendera TIL-anrikade fraktionen i 10 mlav T-cellmedia.
- Kultur fraktionen (från steg 1,8) med 2 ml av T-cell media och 6000 lU / ml rekombinant humant (rh) IL-2 i en 6-brunnars platta vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ändra halv media på dag 5 efter odling initiering och var 2-3 dagar därefter.
- Dela upp cellerna i ett förhållande av 1: 2 utan trypsinering efter mjukt suspendering, en fördubbling av antalet brunnar när den når 80-90% konfluens. Lägga till en halv volym (1 ml) av färska T-cellmedier och rhIL-2 vid 6000 lU / ml.
2. Framställning av Mitomycin-C-behandlade SNL Feeder Cell Plate
- Kultur SNL matarceller i 10 ml av SNL matarcellmedium (Tabell 1) på en 0,1% gelatin-belagda 10 cm skål tills 80-90% konfluens (3-4 x 10 6 celler) har uppnåtts.
- Lägg 310 pl av 0,4 mg / ml mitomycin C lösning direkt in i SNL matarcellkulturskål och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 2 h och 15 min. Aspirera media ennd tvätta cellerna två gånger med 5 ml D-PBS (-).
- Tillsätt 0,5 ml av 0,25% trypsin / 1 mM EDTA och inkubera vid rumstemperatur under 1 min för att dissociera cellerna. Lägg 4,5 ml SNL matarcell media för att neutralisera och återsuspendera cellerna i en enda suspension.
- Överföra celler till ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 xg under 5 min. Aspirera media och räkna cellerna med en hemocytometer efter återsuspendering i 10 ml SNL matarcellmedia.
- Platta 1,5 x 10 6 celler per brunn av SNL matarceller på en 10 cm skål och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Använd SNL matarceller inom 3 dagar.
3. Generering av iPSCs Använda Sendai virus (SeV) Vector
- Skörda TILs (från steg 1,11) och aktivera 5 x 10 5 celler av TIL med plattbundet mus-anti-human-CD3 (1 ug / ml) och lösligt mus-anti-human CD28 (5 pg / ml), med rhIL-2 (6000 lU / ml) i 2 ml T-cellmedia i en platta med 6 brunnar vid 37 ° C, 5% CO2 under 5 dagar.
- Skörda TILs (från steg 3,1) i ett 15 ml rör med hjälp av en pipett och räkna antalet celler med en hemocytometer.
- Reaktivera 1 x 10 5 celler av TIL med plattbundet mus-anti-human-CD3 (1 ug / ml) och lösligt mus-anti-human CD28 (5 pg / ml), med rhIL-2 (60 lU / ml) i 500 | j, l av omprogrammering media (tabell 1) per brunn i en 24-brunnars platta vid 37 ° C, 5% CO2 under 24 timmar. Förbered 3 brunnar för SeV infektion: OCT3 / 4, Sox2, Klf4, och c-MYC (en bra); SeV infektion (GFP: grönt fluorescerande protein) (1 brunn); och cellräkning (en brunn).
- Efter 24 timmar (från steg 3,3), räkna antalet celler med en hemocytometer och fastställa omfattningen av varje virus för olika (3-20) multipliciteter av infektion (MOI). Ta bort en uppsättning av Sendai-virusvektor rören från -80 ° C lagring. Tina SEV vektorerna snabbt i ett vattenbad (37 ° C) och placera dem på is.
Volym av virus (il)= MOI (CIU / cell) x antal celler / titer av virus (CIU / ml) x 10-3 (j, l / ml) - Lägga de beräknade volymerna av var och en av de fyra Sendai-virusvektor rör som individuellt utförda OCT3 / 4, Sox2, Klf4, och c-MYC genom tillsats av en blandning av SeV-vektorer vid 10-20 MOI i medierna, inklusive aktiverade TILs.
- För att bestämma omvandlingseffektiviteten, lägga de beräknade volymer av SeV-GFP i en brunn av aktiverade TIL.
- Placera skålen (från steg 3,5 och Steg 3,6) i inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 under 24 timmar. Efter 24 timmar, uppskatta infektionseffektivitet med hjälp av TIL infekterade med SeV-GFP i fluorescensmikroskopi.
- Samla upp cellerna (från steg 3,5) i ett 15 ml rör. Centrifugera vid 200 x g vid rumstemperatur under 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 0,5 ml hESC media med Primate ES Cell Medium och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
- Överför suspensionen i en 10 cm skål som contains mitomycin-C-behandlade SNL matarceller i 10 ml hESC medier. Ändra hESC media varannan dag tills kolonier odlas.
- Runt dag 18 till 21, ta bort SNL matarceller runt kolonierna under ett mikroskop med hjälp av en 10-il spets i den rena bänken.
- Skrapa kolonier med användning av en 10-pl spets och överföra dem med hjälp av en 200-ul spets i 100 pl iPSCs media per brunn i en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta. Pipettera upp och ned till 2-3 gånger för att bryta kolonierna i små klumpar med en genomsnittlig storlek av 50 till 100 ^ m.
- Överföra de små klumpar i 6-brunnars vävnadskulturplattor med mitomycin-C-behandlade SNL matarceller (från steg 2) i 2 ml per brunn av iPSCs media med basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Byt iPSCs media varje dag.
- Överför iPSCs till 6-brunnars vävnadskulturplattor med färska mitomycin-C-behandlade SNL matarceller med 1 mg / ml kollagenas IV var 5-6 dagar. Förbered 2 brunnar per plattor av varje klon för Immunostaining.
- Bestäm hela omprogrammering av varje klon genom immunhistokemisk färgning av pluripotens markörer (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, och OCT3 / 4) 1.
OBS: För ytterligare utvärdering av pluripotens potential, bekräftar att fullt omprogrammerade IPSC linjer kan differentiera till tre germinallager av en embryoid kropp bildning och differentiering analys eller en teratom bildningsanalys 16. - Bekräfta att fullt omprogrammerade IPSC linjer uppvisa en normal karyotyp genom cytogenetisk analys.
- För teratom bildning, injicera en odifferentierad TIL-derived iPSC (1 x 10 6) suspension i 100 pl DMEM innehållande 10% FCS i den subkutana vävnaden på 6-8 veckor gamla kvinnliga NOD / SCID-möss. Fläck teratoma sektioner med hematoxylin och eosin.
4. Immunofluorescens Färgning av iPSCs för SSEA3, SSEA4, TRA1-60 och TRA1-81
- Tvätta iPSCs med 1 ml PBS och fixa iPSCs med 1 ml 4% paraformaldehyde lösningen under 10 min. Avlägsna paraformaldehydlösning 4% och tvätta iPSCs med 1 ml PBS 3 gånger.
OBS: Var försiktig när du använder paraformaldehyd eftersom det är giftigt. - Förbehandla iPSCs med blockeringsbuffert (tabell 1) under 30 min. Under tiden, späd de primära antikropparna (rått-anti-human SSEA3, mus-anti-human SSEA4, mus-anti-human TRA1-60, och mus-anti-human TRA1-81) 1:50 i 1,5% getserum lösning utspädd med PBS och TritonX -100 (total volym: 1 ml).
- Avlägsna den blockerande buffert (Tabell 1). Lägga den utspädda primära antikroppen lösning och inkubera under en timme vid rumstemperatur. Under tiden, späd den sekundära antikroppen (anti-mus IgG och IgM eller anti-rått-IgM) 1:50 i 1,5% getserum lösning.
- Ta bort den utspädda primära antikroppen lösningen och tvätta iPSCs med 1 ml PBS 3 gånger, var och en under 5 min. Lägga den utspädda sekundär antikroppslösning och inkubera under 45 minuter vid rumstemperatur i ett mörkt rum. Ta bort den utspädda sekundära antikroppslösningen och tvätta iPSCs med 1 ml PBS 3 gånger, varje gång under 5 min. Beakta iPSCs med immunfluorescensmikroskopi.
5. Immunofluorescens Färgning av iPSCs för Oct3 / 4
- Tvätta iPSCs med 1 ml PBS och fixa iPSCs med 1 ml 4% paraformaldehydlösning under 10 minuter. Ta bort paraformaldehydlösning 4% och tvätta iPSCs med PBS 3 gånger.
- Lägg permeabilization buffert (Tabell 1) och inkubera vid rumstemperatur i 10 min. Avlägsna permeabilization buffert och till blockerande buffert (Tabell 1).
- Inkubera vid rumstemperatur i 30 min. Under tiden, späd den primära antikroppen (mus-anti-human Oct3 / 4) 1:50 i blockeringsbuffert.
- Lägga den utspädda primära antikroppen lösning och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Ta bort den utspädda primära antikroppen lösningen och tvätta iPSCs med 1 ml PBS 3 gånger, varje gång under 5 min. Under tiden, diluta den sekundära antikroppen (get-anti-mus-IgG / IgM) 1: 100 i blockeringsbuffert.
- Lägga den utspädda sekundär antikropplösning och inkubera vid rumstemperatur i ett mörkt rum i 45 min.
- Ta bort den utspädda sekundärlösningen och tvätta iPSCs med 1 ml PBS 3 gånger, varje gång under 5 min. Beakta iPSCs enligt immunfluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en översikt av förfarandet som involverar den initiala expansionen av melanom TIL med rhIL-2, som följs av aktivering med anti-CD3 / CD28 och genöverföring av OCT3 / 4, Klf4, Sox2, och c-MYC till TILs för genereringen av iPSCs. Vanligtvis till TIL på kultur med rhIL-2 start bilda sfärer 21-28 dagar efter initiering av kulturen. Vid denna punkt, TIL är redo att aktiveras med anti-CD3 / CD28. Figur 2A visar TIL, om kultur med rhIL-2 på dag 21, som är redo att aktiveras med anti-CD3 / CD28. Figur 2B visar GFP introduktion av Sendai-virus (SeV) transfekterades vid 20 MOI. Figur 2C visar en typisk pluripotent klon på SNL matarceller som visas 18-21 dagar efter SeV infektion. Figur 2D visar att de genererade TIL-härledda iPSCs har en normal karyotyp. Figur 3 visar immunofluorescerande färgning för att bekräfta pluripotency markör expression på iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 och OCT3 / 4). Figur 4 visar att iPSCs härrörande från melanom TILs kan bilda teratom som innehåller en mängd olika celler från tre germinallager (neurala vävnad, respiratoriska epitelet, och brosk). Figur 5 visar att genererade TIL-härledda iPSCs behålla TCR-omarrangemang.
Figur 1:. Schematisk översikt av generering av iPSCs från melanom TIL Protokollet involverar tre steg: isolering och odling av TIL med IL-2, T-cellsaktivering med anti-CD3 / CD28, och cell omprogrammering med Sendai-virus (SeV) vektor som kodar OCT3 / 4, Sox2, Klf4, och c-MYC. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Bildning av iPSCs från melanom TIL (A) En bild som representerar morfologi TIL i rhIL-2 när de började att expandera 2-3 veckor efter initiering av kulturen. (B) bilder som representerar morfologi och GFP uttryck för TIL en dag efter SeV infektion. (C) En typisk ESC-liknande iPSC koloni på dag 21 efter SeV-infektion. De Skalstrecken = 200 nm. (D) Cytogenetisk analys på tjugo G-bandad metafas-celler från en av de iPSCs härledda från melanom TILs. Figur (D) är anpassad från Saito et al 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ftp_upload / 54.375 / 54375fig3.jpg "/>
Figur 3:. Immunofluorescensfärgning med stamcells pluripotenta markörer Den immunofluorescensanalys visar att TIL-härledda iPSCs från två patienter är positiva för SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, och OCT3 / 4. Skalan barer = 100 μm.The siffra är anpassad från Saito et al 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Bekräftelse av pluripotens för iPSCs med teratom formation Hematoxylin- och eosin-färgade representativa teratom sektioner som härrör från TIL-härledda iPSCs klon (6 veckor efter injektion i NOD / SCID-möss) visas. Figur anpassad från Saito et al 16..com / filer / ftp_upload / 54.375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Ett stort antal olika TCR-p-gen arrangemang mönster i TIL-iPSCs TCR-p-genen omlagringar i TIL-iPSCs identifieras genom kapillärelektrofores. Den gröna linjen är härledd från bandet för Jβ1 genen, och den blå linjen är härledd från bandet för Jβ2 genen. Figuren är anpassad från Saito et al 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Sammansättning för T-cellen, omprogrammering, tumor insamling, SNL matarcell, och IPSC media och permeabilisering och blockering buffertar. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visade vi ett protokoll för omprogrammering melanom TIL till iPSCs av SeV-förmedlad transduktion av de fyra transkriptionsfaktorer OCT3 / 4, Sox2, Klf4, och c-MYC. Detta tillvägagångssätt med användning av en SeV system för att programmera om T-celler, erbjuder fördelen av en icke-integrerande metod 7.
En tidigare studie visade att en SeV omprogrammering systemet var effektiv och tillförlitlig för att programmera inte bara fibroblaster utan även perifert blod T-celler 7,17. Dessutom har vi nyligen visat att melanom TIL som är mer differentierat och uttrycker högre nivåer av hämmande receptorer såsom PD-1 än perifert blod T-celler kan också programmeras med hjälp av SeV vektorer 16. Tidpunkt för stimulering med anti-CD3 / CD28 och infektion med SeV vektor var kritisk i omprogrammering TIL. Perifert blod-T-celler kan stimuleras med anti-CD3 och IL-2 för omprogrammering omedelbart efter skörden från ämnet 7, while TIL måste odlas i 3-4 veckor med IL-2 före stimulering.
Trots att mer än 99% av TIL var CD8 T-celler efter 3-4 veckors odling med IL-2 och aktivering med anti-CD3 / CD28 16, rekommenderar vi analys av TCR ombildning i iPSCs att bekräfta att genererade iPSCs är från TIL (Figur 5). Notera tidigare studier inklusive vårt indikerade att varje iPSCs genereras med hjälp av SeV från perifera mononukleära blodceller eller TIL hade TCR ombildning 7,16.
Även generation iPSCs från melanom TIL var möjligt, fann vi att omprogrammering effektivitet melanom TIL var lägre (0,01-0,05%) 16 än av perifera blod-T-celler (0,1%) 7. Anledningen till detta är oklart, men det kan vara förknippade med högre uttryck av hämmande receptorer eller större antal differentierade T-cellundergrupper i TIL 13,16. Senaste betydande framstegför omprogrammering teknik kan förbättra omprogrammering effektiviteten för generering av TIL-iPSCs. Den andra generationen SeV vektor, TS12KOS, befanns ha högre effektivitet iPSC generation än den konventionella SeV vektor som används i den tidigare studien 18,19.
Även utvinning av mänskliga iPSCs med en SeV omprogrammering systemet är möjligt, finns det flera begränsningar som måste beaktas i detta protokoll. Vi använder fetalt bovint serum under SeV infektion i detta protokoll. Vi fann att omprogrammering effektivitet melanom TIL var betydligt lägre om du använder media med humant serum under SeV infektion jämfört med en med fetalt bovinserum, trots liknande spridning av TIL. Vi använder också en mus matarskikt för iPSC generation och underhåll, men en definierad feeder-fria och xeno-fritt system kan vara alternativa metoder i framtida studier.
Det tar cirka två månader från tiden för tumör skörd för att generera iPSCsfrån melanom TILs. Dessutom skulle det ta ytterligare 1-2 månader att få transgen fria iPSCs. Detta kan förkortas genom användning av den nya typen av SeV vektor, TS12KOS, som har visat en mer effektiv viruselimineringshastigheten 19.
Sammanfattningsvis är den generation av mänskliga iPSCs från melanom TIL möjligt. Det nuvarande protokollet kan vara ett viktigt steg för att generera ett oändligt antal tumörspecifika T-celler för adoptiv T-cellterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
