Abstract
نقل بالتبني من خارج الحي توسيع الخلايا الليمفاوية التسلل الورم ذاتي (TILs) يمكن التوسط الردود دائمة وكاملة في مجموعات فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. العقبات الرئيسية لهذا النهج هي انخفاض قابلية خلايا T نقل، والناجمة عن تقصير التيلومير، وحصل على عدد محدود من TILs من المرضى. فإن خلايا T أقل متباينة مع التيلومير طويلة أن يكون فرعية الخلايا التائية مثالية لبالتبني علاج الخلايا T، ولكن توليد أعداد كبيرة من هذه الخلايا T أقل متباينة-إشكالية. هذا القيد من بالتبني علاج الخلايا التائية يمكن التغلب عليها نظريا باستخدام الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) أن تجديد الذات، والحفاظ على التيلوميرات تعدد القدرات، وممدود، وتوفير مصدر غير محدود من خلايا تي ذاتي لالمناعي. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد iPSCs باستخدام ناقلات فيروس سينداي لتنبيغ من العوامل برمجة في TILs. يولد هذا البروتوكولق برمجتها بشكل كامل، استنساخ خالية من ناقلات. قد تكون هذه iPSCs المستمدة سمسم-قادرة على توليد أقل متباينة-patient- وورم محددة الخلايا التائية لبالتبني علاج الخلايا التائية.
Introduction
تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا التي تسمح جيل من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) عن طريق overexpression من مجموعة محددة من عوامل النسخ واعدة للغاية في مجال العلاجات المستندة إلى الخلايا 1،2. هذه iPSCs يحمل ملامح النسخي وجينية ولها القدرة على تجديد الذات وتعدد القدرات، على غرار الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) 3-5. وقد سمح التقدم الملحوظ المحرز في تكنولوجيا إعادة برمجة خلال العقد الماضي لنا لتوليد iPSCs الإنسان حتى من خلايا متباينة عضال، مثل خلايا T 6-8. تي iPSCs المشتقة من خلية (TiPSCs) الإبقاء على نفس التكوين ترتيبها من الخلايا التائية مستقبلات (TCR) الجينات سلسلة مثل خلايا T الأصلي، والذي يسمح تجديد خلايا T مستضد معين من TiPSCs 9-11.
ما يقرب من 80٪ من الخلايا الليمفاوية التسلل سرطان الجلد (TILs) التي تم الحصول عليها من ورم المريض التعرف على وجه التحديد المرتبطة الورم المستضدات لالثانية الحفاظ على سمية الخلايا ضد الخلايا السرطانية الأصلية 12. والجدير بالذكر، انه تم العثور على التعبير عن موت الخلايا المبرمج البروتين 1 (PD-1) على TILs لتحديد ذاتي ذخيرة للورم رد الفعل، بما في ذلك تحور-مستضد مستحدث محددة CD8 + الخلايا اللمفية (13). نقل بالتبني من الجسم الحي السابقين TILs ذاتي موسع في تركيبة مع نظم lymphodepleting التحضيرية والإدارة الشاملة للانترلوكين 2 (IL-2) يمكن أن يسبب تراجعا كبيرا من سرطان الجلد المنتشر في مجموعات فرعية من المرضى 14. وعلى الرغم من النتائج المشجعة في النماذج قبل السريرية والمرضى، وبقاء الفقراء من الخلايا التائية التي غرست وجود مسارات القمعية المناعي تظهر لتقديم تنازلات الإمكانات الكاملة للبالتبني علاج الخلايا التائية. تتطلب البروتوكولات السريرية الحالية فيفو تلاعب واسعة من خلايا تي ذاتي من أجل الحصول على أعداد كبيرة. وهذا يؤدي إلى توليد خلايا T متباينة عضال التي لديها نسبة النفوق، وانخفاض prolالقدرة iferative، ومستويات عالية من PD-1 15.
هذا القيد من بالتبني علاج الخلايا التائية يمكن التغلب عليها نظريا باستخدام iPSCs التي يمكن أن توفر مصدرا غير محدود من خلايا تي ذاتي لالمناعي. لقد ذكرت مؤخرا إعادة برمجة سرطان الجلد TILs معربا عن مستويات عالية من PD-1 فيروس سينداي (SEV) ترنسدوكأيشن بوساطة من عوامل النسخ الأربع، OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC 16. في حين ناقلات الارتجاعي تتطلب الاندماج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة، ناقلات SEV غير قابلة للدمج ويتم التخلص في نهاية المطاف من السيتوبلازم. إعادة برمجة الكفاءة هو أعلى من ذلك بكثير مع نظام SEV مقارنة مع الفيروسة البطيئة أو الارتجاعي ناقلات 6-8. وعلاوة على ذلك، يمكن SEV إعادة برمجة خلايا تي تحديدا في الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs)، في حين أن بعض الحيوانات المستنسخة التوجيهية التي تم إنشاؤها بواسطة الفيروسة البطيئة أو ناقلات الارتجاعي يمكن أن يكون من الأنساب nonlymphoid 6-8. هنا، فإننا التفاصيلإجراءات تنفيذها للعزلة وتفعيل سرطان الجلد البشري TILs ولتوليد iPSCs المستمدة سمسم باستخدام نظام برمجة SEV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب أن المرضى إعطاء الموافقة المسبقة للمشاركة في مجلس المراجعة المؤسسية ومتعددة القدرات البشرية الجذعية وافقت لجنة خلية الدراسة.
1. العزلة والثقافة من TILs
- الحصول على المواد السرطانية التي لم يتم اللازمة لتشخيص الإمراضية من صميم المشتريات خدمة علم الأمراض / الأنسجة. ضع 20-100 غرام من العينات ورم في أنبوب 50 مل مع 30 مل سائل الإعلام الورم جمع (الجدول 1).
- تشريح الصلبة، شركة، الأنسجة الطبيعية للعينة ورم من المناطق الميتة الهشة و / أو دموية باستخدام المقص. بعد إزالة الأنسجة الميتة، واستخدام المقص لتخطر على عينة صغيرة بقدر الإمكان.
- فصل العينة المفروم في تعليق وحيد الخلية باستخدام dissociator وورم عدة التفكك (الإنسان) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تصفية تعليق مع مصفاة الخلية 70 ميكرومتر التي تم تعيينها على أنبوب 50 مل وغسل مصفاة 2 مرات مع2 مل من RPMI 1640.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام الخلايا التائية (الجدول 1).
- يعد حل التدرج من خطوتين مثل Ficoll (حل التدرج) في أنبوب 50 مل، مع خطوة أقل من 10 مل من 100٪ حل التدرج والخطوة المتوسطة من 30 مل من 75٪ محلول التدرج المخفف مع الفوسفات Dulbecco ل مخزنة المالحة، لا الكالسيوم، المغنيسيوم أي (D-برنامج تلفزيوني (-)).
- طبقة تعليق خلية (من الخطوة 1.4) على حل التدرج (من الخطوة 1.5). أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج عند 20 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- جمع الطبقة التي تحتوي على TILs المخصب في واجهة بين الحل التدرج 100٪ والحل التدرج 75٪ في أنبوب 50 مل. تمييع طبقة من الحل مع TILs المخصب بإضافة 20-30 مل من مد برنامج تلفزيوني (-).
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الجزء المخصب سمسم في 10 ملوسائل الإعلام الخلايا التائية.
- الثقافة جزء (من الخطوة 1.8) مع 2 مل من وسائل الاعلام الخلايا التائية و 6،000 وحدة دولية / مل المؤتلف الإنسان (RH) IL-2 في لوحة 6 جيدا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- تغيير نصف وسائل الإعلام في يوم 5 بعد بدء الثقافة وكل 2-3 أيام بعد ذلك.
- انقسام الخلايا في نسبة 1: 2 دون trypsinization بعد وقف بهدوء، ومضاعفة عدد الآبار عند الوصول إلى 80-90٪ confluency. إضافة حجم نصف (1 مل) من وسائل الاعلام الخلايا التائية الطازجة وrhIL-2 في 6000 وحدة دولية / مل.
2. إعداد تعامل ميتوميسين-C-لوحة خلية SNL الطاعم
- يتم التوصل إلى ثقافة SNL الخلايا المغذية في 10 مل من SNL وسائل الاعلام الخلايا المغذية (الجدول 1) على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة صحن 10 سم حتى 80-90٪ التقاء (3-4 × 10 6 خلايا).
- إضافة 310 ميكرولتر من 0.4 ملغ / مل حل C ميتوميسين مباشرة في طبق زراعة الخلايا SNL المغذية واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة و 15 دقيقة. نضح وسائل الإعلامالثانية غسل الخلايا مرتين مع 5 مل مد برنامج تلفزيوني (-).
- إضافة 0.5 مل من 0.25٪ التربسين / 1 ملم EDTA ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا. إضافة 4.5 مل من وسائل الاعلام الخلايا المغذية SNL لتحييد واعادة تعليق الخلايا في تعليق واحد.
- نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وسائل الإعلام وعدد الخلايا مع عدادة الكريات بعد إعادة تعليق في 10 مل من SNL وسائل الاعلام الخلايا المغذية.
- لوحة 1.5 × 10 6 خلايا لكل بئر من الخلايا المغذية SNL على طبق 10 سم واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. استخدام الخلايا المغذية SNL خلال 3 أيام.
3. الجيل من iPSCs عن طريق فيروس سينداي (SEV) المتجهات
- حصاد TILs (من الخطوة 1.11) وتفعيل 5 × 10 5 خلايا TILs مع ملزمة لوحة الماوس CD3 مكافحة الإنسان (1 ميكروغرام / مل)، والماوس للذوبان CD28 مكافحة الإنسان (5 ميكروغرام / مل)، مع rhIL-2 (6000 وحدة دولية / مل) في 2 مل من وسائل الاعلام الخلايا التائية في لوحة 6 جيدا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 5 أيام.
- حصاد TILs (من الخطوة 3.1) في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة وحساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات.
- تنشيط 1 × 10 5 خلايا TILs مع ملزمة لوحة الماوس CD3 مكافحة الإنسان (1 ميكروغرام / مل)، والماوس للذوبان مكافحة الإنسان CD28 (5 ميكروغرام / مل)، مع rhIL-2 (60 وحدة دولية / مل) في 500 ميكرولتر وسائل الإعلام برمجة (الجدول 1) لكل بئر في 24 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. إعداد 3 آبار للعدوى SEV: OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC (1 جيد). عدوى SEV (GFP: الأخضر بروتين فلوري) (1 جيد). وعدد خلايا (1 جيد).
- بعد 24 ساعة (من الخطوة 3.3)، حساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات وتحديد حجم كل فيروس لمختلف (3-20) مولتيبليكيتييس من العدوى (وزارة الداخلية). إزالة مجموعة واحدة من سينداي أنابيب ناقل الفيروس من -80 ° C التخزين. ذوبان الجليد ناقلات SEV بسرعة في حمام مائي (37 درجة مئوية) ووضعها على الجليد.
حجم فيروس (ميكرولتر)= وزارة الداخلية (CIU / خلية) س عدد الخلايا / عيار من فيروس (CIU / مل) × 10-3 (ميكرولتر / مل) - إضافة كميات محسوبة من كل من أربعة أنابيب ناقل فيروس سينداي التي حملت بشكل فردي OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC بإضافة خليط من ناقلات SEV في 10-20 وزارة الداخلية في وسائل الإعلام، بما في ذلك TILs تفعيلها.
- لتحديد كفاءة ترنسدوكأيشن، إضافة الكميات المحسوبة SEV-GFP في بئر من TILs تفعيلها.
- وضع الطبق (من الخطوة 3.5 و 3.6 خطوة) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، وتقدير كفاءة العدوى باستخدام TILs المصابين SEV-GFP تحت المجهر مضان.
- جمع الخلايا (من الخطوة 3.5) في أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه في 0.5 مل من وسائل الاعلام HESC مع الرئيسيات ES المتوسطة الخلية وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF، 4 نانوغرام / مل).
- نقل تعليق في صحن 10 سم أن كونتاالإضافية ميتوميسين-C-تعامل الخلايا المغذية SNL في 10 مل من وسائل الاعلام HESC. تغيير وسائل الإعلام HESC كل يوم حتى تنمو المستعمرات.
- اليوم حوالي 18 إلى 21، وإزالة الخلايا المغذية SNL حول المستعمرات تحت المجهر باستخدام طرف 10 ميكرولتر في مقاعد البدلاء النظيفة.
- تتخلص من المستعمرات باستخدام طرف 10 ميكرولتر ونقلها باستخدام تلميح 200 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام iPSCs لكل بئر من 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. الماصة صعودا وهبوطا بمعدل 2-3 مرات لكسر المستعمرات إلى كتل صغيرة مع متوسط حجم 50-100 ميكرون.
- نقل كتل صغيرة في لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا مع الخلايا المغذية SNL تعامل ميتوميسين-C (من الخطوة 2) في 2 مل لكل بئر من وسائل الإعلام iPSCs مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF، 4 نانوغرام / مل). تغيير وسائل الإعلام iPSCs كل يوم.
- نقل iPSCs لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا مع الخلايا المغذية SNL تعامل ميتوميسين-C-جديدة مع 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع كل 5-6 أيام. إعداد 2 بئر في لوحات كل لاستنساخ إمانostaining.
- تحديد برمجة الكاملة لكل نسخة من تلطيخ المناعى من علامات تعدد القدرات (SSEA3، SSEA4، هيئة تنظيم الاتصالات، 1-60، 1-81 هيئة تنظيم الاتصالات، وOCT3 / 4) 1.
ملاحظة: لمزيد من تقييم إمكانيات تعدد القدرات، تأكد من أن خطوط التوجيهية برمجتها بشكل كامل يمكن أن تفرق في ثلاث طبقات جرثومية قبل تشكيل هيئة مضغي وفحص التمايز أو مقايسة تشكيل مسخي 16. - تأكد من أن خطوط التوجيهية برمجتها بالكامل يبرهن على وجود النمط النووي العادي عن طريق تحليل وراثي خلوي.
- لتشكيل مسخي، وضخ على غير متمايز المستمدة سمسم-IPSC (1 × 10 6) معلق في 100 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FCS في الأنسجة تحت الجلد من 6-8 الاسبوع القديمة الإناث الفئران NOD / SCID. أقسام مسخي وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين.
4. المناعي تلون iPSCs لSSEA3، SSEA4، TRA1-60 وTRA1-81
- غسل iPSCs مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإصلاح iPSCs مع 1 مل من 4٪ سنوياحل raformaldehyde لمدة 10 دقيقة. إزالة حل لامتصاص العرق 4٪، ويغسل iPSCs مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات.
ملاحظة: كن حذرا عند استخدام امتصاص العرق لأنها سامة. - يمهد للمعالجة وiPSCs مع عازلة تمنع (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، يخفف من الأجسام المضادة الأولية (الفئران مكافحة الإنسان SSEA3، والماوس مكافحة الإنسان SSEA4، والماوس مكافحة الإنسان TRA1-60، والماوس المضادة للبشرية TRA1-81) 01:50 في 1.5٪ محلول مصل الماعز تضعف مع برنامج تلفزيوني وTritonX -100 (الحجم الكلي: 1 مل).
- إزالة عازلة تمنع (الجدول 1). إضافة محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه، يخفف من الأجسام المضادة الثانوية (مفتش مكافحة فأر والغلوبولين المناعي أو مكافحة الفئران الغلوبولين المناعي) 01:50 في 1.5٪ محلول مصل الماعز.
- إزالة حل الأجسام المضادة الأولية المخفف وغسل iPSCs مع 1 مل PBS 3 مرات، في كل لمدة 5 دقائق. إضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف واحتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية المخفف وغسل iPSCs مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات، في كل لمدة 5 دقائق. مراقبة iPSCs مع المجهر المناعي.
5. المناعي تلون iPSCs لOct3 / 4
- غسل iPSCs مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإصلاح iPSCs مع 1 مل من 4٪ حل لامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة. إزالة حل لامتصاص العرق 4٪، ويغسل iPSCs مع برنامج تلفزيوني 3 مرات.
- إضافة العازلة permeabilization (الجدول 1)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إزالة المنطقة العازلة permeabilization وإضافة عازلة تمنع (الجدول 1).
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، يخفف من الأجسام المضادة الأولية (الماوس مكافحة الإنسان Oct3 / 4) 01:50 في عرقلة العازلة.
- إضافة محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- إزالة حل الأجسام المضادة الأولية المخفف وغسل iPSCs مع 1ml من PBS 3 مرات، في كل لمدة 5 دقائق. وفي الوقت نفسه، ديالعود الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي) 1: 100 في عرقلة العازلة.
- إضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف واحتضان في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة لمدة 45 دقيقة.
- إزالة حل الثانوي المخفف وغسل iPSCs مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات، في كل لمدة 5 دقائق. مراقبة iPSCs تحت المجهر المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 نظرة عامة على الإجراء الذي ينطوي على توسيع الأولي من سرطان الجلد TILs مع rhIL-2، والتي تبعتها تفعيل مع مكافحة CD3 / CD28 ونقل الجينات من OCT3 / 4، KLF4، SOX2، وج-MYC إلى TILs لتوليد iPSCs. عادة، TILs على الثقافة مع rhIL-2 بداية لتشكيل المجالات 21-28 أيام بعد الشروع في الثقافة. عند هذه النقطة، TILs هم على استعداد لتفعيلها مع anti-CD3 / CD28. الشكل 2A يظهر TILs، على الثقافة مع rhIL-2 في يوم 21، التي هي على استعداد لتفعيلها مع anti-CD3 / CD28. الشكل 2B يظهر GFP مقدمة من سينداي فيروس (SEV) transfected في 20 وزارة الداخلية. ويبين الشكل 2C استنساخ المحفزة نموذجي على الخلايا المغذية SNL الذي يظهر بعد 18-21 يوما العدوى SEV. الشكل 2D يدل على أن ولدت iPSCs المستمدة سمسم بوجود النمط النووي العادي. ويوضح الشكل 3 مناعي تلطيخ لتأكيد ع يظهر luripotency التعبير علامة على iPSCs (SSEA3، SSEA4، TRA1-81، TRA1-60، وOCT3 / 4). الشكل 4 أن iPSCs المستمدة من سرطان الجلد TILs قادرة على تشكيل مسخي التي تحتوي على مجموعة متنوعة من الخلايا من ثلاثة طبقات جرثومية (العصبية الأنسجة، ظهارة في الجهاز التنفسي، والغضاريف). ويبين الشكل (5) التي ولدت iPSCs المستمدة سمسم-تحتفظ إعادة ترتيب TCR.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي من جيل iPSCs من سرطان الجلد TILs يتضمن البروتوكول ثلاثة مراحل: العزلة وثقافة TILs مع IL-2، تي تنشيط الخلايا مع مكافحة CD3 / CD28، وإعادة برمجة الخلايا مع فيروس سينداي (SEV) ناقلات ترميز OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: جيل من iPSCs من سرطان الجلد TILs (A) صورة تمثل مورفولوجية TILs في rhIL-2 عندما بدأت في توسيع 2-3 أسابيع بعد الشروع في الثقافة. (ب) الصور التي تمثل مورفولوجيا وGFP التعبير عن TILs يوم واحد بعد الإصابة SEV. (ج) ومستعمرة IPSC ESC تشبه نموذجية في يوم 21 بعد الإصابة SEV. قضبان مقياس = 200 ميكرون. (د) تحليل وراثي خلوي على عشرين الخلايا الطورية G النطاقات من أحد من iPSCs المستمدة من سرطان الجلد TILs. ويتم تكييف الرقم (D) من سايتو وآخرون (16). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg "/>
الشكل (3): المناعي تلطيخ مع علامات الخلايا الجذعية المحفزة ويبين الفحص المناعي أن iPSCs المستمدة سمسم-من اثنين من المرضى إيجابية لSSEA3، SSEA4، هيئة تنظيم الاتصالات، 1-81، 1-60 هيئة تنظيم الاتصالات، وOCT3 / 4. ويتم تكييف هذا الرقم μm.The الحانات مقياس = 100 من سايتو وآخرون (16). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وترد تأكيد من تعدد القدرات لiPSCs مع مسخي تشكيل Hematoxylin- والمقاطع مسخي تمثيلية الملطخة يوزين المستمدة من استنساخ iPSCs المستمدة سمسم (6 أسابيع بعد الحقن إلى NOD / الفئران SCID): الشكل 4. شخصية مقتبسة من سايتو وآخرون (16).كوم / ملفات / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويتم تحديد مجموعة واسعة من TCR-β أنماط الترتيب الجيني في إعادة ترتيب الجينات سمسم-iPSCs TCR بيتا في TIL-iPSCs من قبل الكهربائي الشعرية: الرقم 5. مشتق من الخط الأخضر من الفرقة لجين Jβ1، ومشتق من الخط الأزرق من الفرقة لجين Jβ2. ويتم تكييف هذا الرقم من سايتو وآخرون (16). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول رقم 1: تشكيل لالخلايا التائية، برمجة، رumor جمع، SNL الخلايا المغذية، وسائل الاعلام التوجيهية، وpermeabilization ومخازن الحجب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، أثبتنا بروتوكول للبرمجة TILs سرطان الجلد لiPSCs التي كتبها التنبيغ بوساطة SEV للالنسخ أربعة عوامل OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC. هذا النهج، وذلك باستخدام نظام SEV لإعادة برمجة خلايا T، ويقدم ميزة أسلوب غير دمج-7.
وأظهرت دراسة سابقة أن نظام إعادة برمجة SEV كان ذات كفاءة عالية وموثوق بها لإعادة برمجة الخلايا الليفية ليس فقط ولكن أيضا خلايا T الدم المحيطي 7،17. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا مؤخرا أن TILs سرطان الجلد التي هي أكثر تمايزا والتعبير عن مستويات أعلى من المستقبلات المثبطة مثل PD-1 من يمكن أيضا برمجتها باستخدام SEV ناقلات 16 خلايا الدم تي الطرفية. كان توقيت التحفيز مع مكافحة CD3 / CD28 وعدوى ناقلات SEV حاسما في إعادة برمجة TILs. خلايا الدم المحيطي تي يمكن حفز مع anti-CD3 و IL-2 لإعادة برمجة مباشرة بعد الحصاد من هذا الموضوع 7، whilTILs الإلكترونية تحتاج إلى أن تكون تربيتها لمدة 3-4 أسابيع مع IL-2 قبل التحفيز.
على الرغم من أن أكثر من 99٪ من TILs أن الخلايا التائية CD8 بعد 3-4 أسابيع من الثقافة مع IL-2 وتفعيل مع مكافحة CD3 / CD28 16، نوصي تحليل TCR إعادة ترتيب في iPSCs للتأكد من أن ولدت iPSCs هي من TILs (الشكل 5). من المذكرة، أشارت دراسات سابقة بما في ذلك لنا أن كل iPSCs الموضوعة باستخدام SEV من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية أو كان TILs TCR إعادة ترتيب 7،16.
على الرغم من أن الجيل من iPSCs من سرطان الجلد TILs كان ممكنا، وجدنا أن كفاءة إعادة برمجة سرطان الجلد TILs كان أقل (0،01-0،05٪) 16 من أن خلايا الدم تي الطرفية (0.1٪) 7. والسبب في ذلك غير واضح، ولكن قد تترافق مع تعبير أعلى من المستقبلات المثبطة أو عدد أكبر من مجموعات فرعية تي خلية متمايزة في TILs 13،16. تقدم كبير في الآونة الأخيرةلتقنية إعادة البرمجة قد تؤدي إلى تحسين كفاءة إعادة برمجة لتوليد سمسم-iPSCs. ناقلات الجيل SEV الثاني، TS12KOS، وقد وجد أن لديها كفاءة أعلى من الجيل IPSC من ناقلات SEV التقليدية المستخدمة في الدراسة 18،19 السابق.
على الرغم من أن اشتقاق iPSCs الإنسان مع نظام SEV إعادة برمجة ممكنا، وهناك العديد من القيود التي يتعين النظر فيها في هذا البروتوكول. نحن نستخدم الجنين المصل البقري خلال العدوى SEV في هذا البروتوكول. لقد وجدنا أن كفاءة إعادة برمجة سرطان الجلد TILs كانت أقل من ذلك بكثير في حالة استخدام وسائل الإعلام مع المصل البشري خلال العدوى SEV مقابل واحد مع مصل بقري جنيني، على الرغم من انتشار مماثل من TILs. ونحن أيضا استخدام طبقة المغذية الماوس لتوليد التوجيهية والصيانة، ولكن نظام خالية من تغذية وخالية من XENO محددة قد تكون طرق بديلة في الدراسات المستقبلية.
يستغرق حوالي شهرين من وقت الحصاد ورم لتوليد iPSCsمن سرطان الجلد TILs. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يأخذ 1-2 أشهر إضافية للحصول iPSCs خالية من التحوير. يمكن تقصير هذه عن طريق استخدام نوع جديد من ناقلات SEV، TS12KOS، الذي أبدى أكثر كفاءة معدل إزالة الفيروس 19.
وفي الختام، وتوليد iPSCs الإنسان من سرطان الجلد TILs ممكنا. قد يكون البروتوكول الحالي خطوة مهمة لتوليد عدد لا حصر له من الخلايا T ورم محددة لبالتبني علاج الخلايا التائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
