Abstract
Ex vivo Evlatlık transferi metastatik melanom hastalarında önemli alt gruplarında dayanıklı ve tam yanıtlara aracılık edebilir otolog tümör infiltre lenfositleri (TILS) genişletti. Bu yaklaşımın en önemli engeller telomerik kaynaklanan transfer T hücrelerinin, azalmış canlılığı, ve TILS sınırlı sayıda hastadan elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu daha az farklılaşmış T hücrelerinin çok sayıda üretilmesi problemlidir, uzun telomerlerin ile daha az farklılaşmış T hücreleri adoptif T hücresi terapisi için ideal bir T hücresi alt kümesi olabilir. adoptif T hücresi tedavisinin bu sınırlama teorik kullanılarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) aşılabilir, kendi kendini yenileme pluripotense, uzamış telomer korumak ve immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız bir kaynak sağlar. Burada, TILS içine yeniden programlama faktörleri iletimi için Sendai virüsü vektörleri kullanılarak iPSCs üretmek için bir protokol mevcut. Bu protokol oluşturmakTamamen yeniden programlanması, vektör ücretsiz klonlar s. Bu TIL türetilmiş iPSCs adoptif T hücre tedavisi için daha az farklılaşmış hastaya ve tümör-spesifik T hücrelerini elde etmek mümkün olabilir.
Introduction
Transkripsiyon faktörleri, tanımlanmış bir dizi aşırı ekspresyonu ile uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretilmesini sağlar Hücresel yeniden programlama teknolojisi hücre bazlı terapiler 1,2 alanında büyük ümit vaat etmektedir. Bu iPSCs transkripsiyonel ve epigenetik özelliklerini sergilemek ve benzer embriyonik kök hücreleri (EKH) 3-5 kendini yenileme ve pluripotensin kapasitesine sahip. Geçtiğimiz on yıl içinde yeniden programlama teknolojisi yapılan kayda değer ilerleme bize bile böyle T hücreleri 6-8 olarak terminal olarak farklılaşmış hücreler, insan iPSCs oluşturmak için izin verdi. T hücresi-kaynaklı iPSCs (TiPSCs) TiPSCs 9-11 antijen-spesifik T hücrelerinin yenilenmesini sağlayan özgün T hücreleri gibi T hücresi reseptörü (TCR) zincir genlerinin aynı yeniden düzenlenmiş konfigürasyonunu muhafaza eder.
melanom süzücü limfositlerin yaklaşık% 80 (TILS), bir hastanın tümör spesifik tümör bağlantılı antijenleri tanıyan eldeND, orijinal Kanser hücreleri 12 karşı sitotoksisite korumak. Özellikle, TILS ile programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) ifadesi mutasyona uğramış neoantijen özgü CD8 + 13 lenfositlerin dahil olmak üzere, otolog tümör reaktif repertuarı tespit bulunmuştur. Hazırlayıcı lymphodepleting rejimleri ve interlökin-2 (IL-2), sistemik tatbikat ile kombinasyon halinde, ex-vivo genişletilmiş otolog TILS adoptif nakli hastalarında 14 alt-metastatik melanom büyük gerilemesine neden olabilir. klinik öncesi modellerde ve hastalarda cesaret verici sonuçlar rağmen, yoksul infüzyon T hücrelerinin hayatta kalma ve bağışıklık baskılayıcı yolların varlığı evlatlık T hücre tedavisi tam potansiyelini tehlikeye görünmektedir. Mevcut klinik protokoller sayıda elde edilmesi için otolog T hücrelerinin geniş bir ex vivo işleme gerektirir. Bu sonuç, zayıf yaşam süresine sahiptir terminal olarak farklılaşmış T hücreleri, indirgenmiş Proteinlerin üretimi ile sonuçlanıriferative kapasitesi ve PD-1 15 yüksek düzeyde.
adoptif T hücresi tedavisinin Bu sınırlama teorik immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız kaynağı sağlayabilir iPSCs kullanılarak aşılabilir. Son zamanlarda Sendai virüsü (sev) dört transkripsiyon faktörlerinin aracılı transdüksiyonu, OKT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc 16 PD-1 yüksek seviyede ifade eden melanoma TILS yeniden programlamayı bildirmiştir. retrovirüs vektörleri yeniden programlama genleri ifade etmek konak kromozom entegrasyonu gerektiren ederken, SeV vektörleri olmayan entegre ve sonunda sitoplazmaya çıkarılmıştır. Verimliliği yeniden programlanması lentivirüs veya retrovirüs vektörleri 6-8 ile karşılaştırıldığında SeV sistemi ile çok daha yüksektir. Lentivirüs veya retrovirüs vektörleri tarafından üretilen bazı iPSC klonlar nonlymphoid soy 6-8 arasında olabilir iken Ayrıca, SeV özel olarak ise, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) T hücreleri yeniden programlamak için. Burada, detayprosedürler insan melanoma TILS izolasyonu ve aktivasyonu için bir SeV yeniden programlama sistemi kullanılarak TIL türetilmiş iPSCs üretimi için uyguladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hastalar Hücre Komitesi çalışmayı onayladı Kök Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve insan pluripotent katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir.
1. İzolasyon ve Kültürü TILS
- patoloji servisi / doku tedarik çekirdekten histopatolojik tanı için gerekli değildir tümör materyal elde. 30 mi, tümör toplama ortamı (Tablo 1) 50 ml bir tüp içinde tümör numunelerinin 20-100 g yerleştirin.
- Katı, sert, makas kullanarak kırılgan ve / veya kanlı nekrotik alanlar tümör örneğinin normal doku teşrih. nekrotik doku çıkarıldıktan sonra, mümkün olduğu kadar küçük örnek kıymaya makas kullanın.
- üreticinin talimatlarına göre bir ayıracı ve tümör ayrılma kiti (insan) ile tek bir hücre süspansiyonu içine kıyılmış örnek ayrıştırmaları. 50 ml'lik bir tüp ayarlanır 70 mikron hücre süzgecinden ile süspansiyonu Filtre ve süzgeç 2 kez yıkayınRPMI 1640 2 mi.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve T hücre ortamı (Tablo 1), 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
- Bu Ficoll% 100 gradyan çözeltisi, 10 ml daha düşük bir adımı ve Dulbecco fosfat- ile seyreltildi% 75 gradyan çözeltisi 30 ml'lik bir orta aşama ile 50 ml bir tüp içinde (gradyan çözeltisi) gibi bir iki-aşamalı gradyan çözeltisi hazırlayın tamponlu tuzlu su, herhangi bir kalsiyum, Resim magnezyum (D-PBS (-)).
- (Adım 1.5 dan itibaren) gradyan çözümü (Adım 1.4) hücre süspansiyonu Katman. 45 dakika boyunca 20 ° C'de 400 x g'de santrifüjleyin.
- % 100 gradyan çözeltisi ve 50 ml'lik bir tüp içinde% 75 gradyan çözeltisi arasında arayüzde zenginleştirilmiş TILS içeren tabakayı toplayın. D-PBS 20-30 ml ekleyerek zenginleştirilmiş TILS çözelti tabakası seyreltilmiş (-).
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atın ve 10 ml TIL zenginleştirilmiş fraksiyonu tekrar süspansiyonT hücre ortamı.
- Kültür, 37 ° C 'de 6-çukurlu plaka içindeki 2 T hücre ortamı ml ve 6.000 lU / ml rekombinant insan (rh), IL-2 ile (Aşama 1.8) fraksiyonu,% 5 CO2.
- Kültür başlangıcından 5 gün sonra yarım medya değiştirin ve daha sonra her 2-3 günde bir.
- 1 oranında hücreleri bölme: 2 trypsinization olmadan usulca% 80-90 confluency ulaştığında kuyu sayısını iki katına, askıya sonra. 6000 lU / ml taze T hücresi ortam ve rhlL-2 yarım hacmi (1 mi) eklenir.
Mitomisin-C ile tedavi edilen SNL Besleyici Hücre Plate 2. Hazırlık
- % 80-90 (3-4 x 10 6 hücre) kadar% 0.1 jelatin kaplı 10 cm tabak üzerine SNL besleme hücre ortamı (Tablo 1) 10 ml kültür SNL besleme hücreleri ulaşılır.
- Şirketinden SNL besleyici hücre kültürü çanağı içinde 0.4 mg / ml mitomisin C çözeltisi 310 ul ilave edin ve 37 ° C'de 2 saat ve 15 dakika için,% 5 CO2 inkübe edilir. medya a aspireND, 5 ml D-PBS ile iki kez yıkama hücreleri (-).
- 0.5 mi% 0.25 tripsin / 1 mM EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. nötralize etmek SNL besleyici hücre medya 4,5 ml ekleyin ve bir tek süspansiyon içine hücreleri yeniden askıya.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri aktarın. ortamı aspire ve SNL besleyici hücre ortamının 10 ml'si içinde tekrar süspansiyon haline sonra hemasitometre ile hücre sayımı.
- Plaka 1.5 x 10 6, 10 cm tabak üzerine SNL besleyici hücreler göz başına hücre ve 37 ° C'de inkübe,% 5 CO2. 3 gün içinde SNL besleyici hücreler kullanın.
Sendai Virüs kullanılması iPSCs 3. Nesil (SeV) Vektör
- Hasat TILS ve plaka bağlı fare anti-insan CD3 (1 ug / ml) ile TILS 5 x 10 5 hücre aktive ve çözünebilir fare anti-insan CD28 (ug / ml 5 ug) (Kademe 1.11 arasında), rhlL-2 3 'ucunda bir 6-yuvalı plaka içinde, T hücre ortamı 2 ml (6.000 lU / ml)7 ° C, 5 gün süreyle% 5 CO 2.
- bir pipet kullanılarak 15 ml bir tüp içinde (Kademe 3.1) TILS hasat ve bir hemositometrede hücre sayısını.
- 500 ul rhlL-2 ile 1 tabak bağlı fare anti-insan CD3 (1 ug / ml) ile TILS x 10 5 hücre ve çözünebilir fare anti-insan CD28 (5 ug / ml), (60 lU / ml) Yeniden 37 ° C'de 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına yeniden programlama ortamı (Tablo 1), 24 saat boyunca% 5 CO2. SeV enfeksiyonu 3 kuyu hazırlayın: OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc (1 de); SeV enfeksiyonu (GFP: yeşil floresan protein) (1 kuyu); ve hücre sayımı (1 kuyu).
- (Kademe 3,3) 24 saat sonra, bir hemasitometre hücre sayısını ve enfeksiyonun çeşitli (3-20) çokluklar (İB) için her virüsün hacmini belirler. -80 ° C depolama Sendai virüsü vektörü tüpler bir set çıkarın. su banyosunda (37 ° C) hızla SeV vektörleri çözülme ve buz üzerine koyun.
Virüsün hacmi (ul)= İçişleri Bakanlığı (UKÜ / hücre) virüsünün / titre hücrelerinin sayısı x (UKÜ / ml) x 10-3 (ul / ml) - aktif TILS de dahil olmak üzere ortam içine 10-20 MOI'da SeV vektörlerinin bir karışımın ilave edilmesiyle tek tek OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc taşıyan dört Sendai virüsü vektörü tüplerinin her hesaplanan miktarlar ekleyin.
- transdüksiyon etkinliğini belirlemek için, aktive edilmiş TILS bir kuyuya SeV-GFP hesaplanan miktarlar ekleyin.
- (Kademe 3.5 ila 3.6 adım) tabağına yerleştirin, 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübatörde. 24 saat sonra, floresan mikroskobu altında sev-GFP ile enfekte edilmiş TILS kullanılarak enfeksiyonun etkinliğini tahmin ediyoruz.
- 15 ml'lik bir tüp içinde (Kademe 3.5 ila) hücreler toplanır. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatant atılır ve primat ES hücre ortamı ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile HESC ortamın 0.5 ml pelletini.
- Conta 10 cm çanak içine süspansiyon aktarınINS HESC ortam, 10 ml SNL besleyici hücreler mitomisin C ile muamele edilmiş. koloniler yetiştirilen kadar her gün HESC ortamı değiştirmek.
- 21 gün 18 civarında, temiz tezgah 10 ul ucu kullanarak bir mikroskop altında koloniler etrafında SNL besleyici hücreleri çıkarmak.
- 10 ul ucu ile koloniler kazıyın ve 96 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna iPSCs ortam 100 ul bir 200 ul ucu kullanarak transfer edin. Pipet yukarı ve 2-3 kez aşağı 50-100 mikron ortalama boyutu küçük kümeleri içine koloniler kırmak için.
- Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile iPSCs ortam oyuk başına 2 ml (Kademe 2 de) mitomisin C ile muamele edilmiş SNL besleyici hücreler 6 oyuklu doku kültürü plakaları halinde küçük öbekler aktarın. Her gün iPSCs ortamı değiştirmek.
- 5-6 gün 1 mg / ml kollajenaz IV, taze, mitomisin-C ile tedavi edilen SNL besleyici hücreler 6 oyuklu doku kültür plakalarına iPSCs aktarın. Immun her klon plakaları başına 2 kuyu hazırlayınostaining.
- Pluripotency belirteçlerinin (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 ve Zeiss OCT3 / 4) 1 immünohistokimyasal boyama ile her klon tam yeniden programlanması belirleyin.
NOT: Pluripotency potansiyelinin daha fazla değerlendirilmesi için, tam yeniden programlanması iPSC hatları bir embriyoid vücut oluşumu ve farklılaşma tahlil ya da bir teratom oluşum deneyi 16 tarafından üç germ içine ayırt edebilirsiniz onaylayın. - Tam yeniden programlanması iPSC hatları sitogenetik analizi ile normal karyotipe göstermek onaylayın.
- Teratom oluşumu için, farklılaşmamış bir TIL türetilmiş IPSC DMEM 6-8 haftalık dişi NOD / SCID farelerinin deri altı doku içine% 10 FCS içeren 100 ul (1 x 10 6) süspansiyonu enjekte edilir. hematoksilen ve eozin ile leke teratom bölümleri.
SSEA3, SSEA4, TRA1-60 ve TRA1-81 için iPSCs 4. immünofloresan boyama
- Yıkama 1 ml PBS ile iPSCs ve% 4 pa 1 ml iPSCs gidermek10 dakika boyunca raformaldehyde çözeltisi. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve PBS 3 kez 1 ml iPSCs yıkayın.
NOT: toksik olduğu için paraformaldehid kullanırken dikkatli olun. - 30 dakika süre ile tampon (Tablo 1) engelleme iPSCs ön muamele. Bu arada, PBS ve Triton® X ile seyreltildi primer antikor (fare anti-insan SSEA3, fare anti-insan SSEA4, fare anti-insan TRA1-60 ve fare anti-insan TRA1-81) 01:50 1.5% keçi serumu çözeltisi seyreltilmiş -100 (toplam hacim: 1 ml).
- Engelleme tampon (Tablo 1) sökün. seyreltilmiş birincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Diğer taraftan, ikincil antikor (anti-fare IgG ve IgM veya anti-sıçan IgM) 01:50% 1.5 keçi serumu çözeltisi seyreltilir.
- seyreltilmiş primer antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika için 1 ml PBS 3 kez, her biri iPSCs yıkayın. seyreltilmiş sekonder antikor solüsyonu eklenir ve karanlık bir odada, oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. seyreltilmiş sekonder antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS 3 kez 1 ml, her biri iPSCs yıkayın. mikroskobik inceleme ile iPSCs gözlemleyin.
Oct3 için iPSCs 5. İmmünofloresan Boyama / 4
- Yıkama 1 ml PBS ile iPSCs ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 ml iPSCs düzeltin. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve PBS ile 3 kez iPSCs yıkayın.
- Permeabilizasyon tamponu (Tablo 1) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Permeabilizasyon tamponu çıkarın ve tampon (Tablo 1) bloke ekleyin.
- 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu arada bloklama tamponunu birincil antikor (fare anti-insan Oct3 / 4) 1:50 seyreltin.
- seyreltilmiş birincil antikor solüsyonu eklenir ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- seyreltilmiş primer antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS ile 1 ml 3 kez, her biri iPSCs yıkayın. Bu arada, di(Anti-fare IgG / IgM keçi) Ud ikincil antikor 1: 100 blokaj tamponunda.
- seyreltilmiş sekonder antikor solüsyonu ilave edin ve 45 dakika için karanlık bir odada, oda sıcaklığında inkübe edin.
- seyreltilmiş ikincil çözelti çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS 3 kez 1 ml, her biri iPSCs yıkayın. mikroskobik inceleme altında iPSCs uyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, anti-CD3 / CD28 ile aktivasyon ve TILS için OKT3 / 4, Klf4 Sox2 ve c-myc gen transferi takip etmektedir rhlL-2 melanom TILS, ilk genişleme içerir prosedür genel görünüşünü göstermektedir iPSCs üretimi için. Genellikle, rhIL-2 başlaması ile birlikte kültür üzerine TILS küreler kültür başlandıktan sonra 21-28 gün oluşturmak için. Bu noktada, TILS anti-CD3 ile aktif hale hazırız / CD28. Şekil 2A kültürü TILS, rhIL-2 günde 21 ile aktive edilecek hazır gösterileri, anti-CD3 / CD28. Şekil 2B GFP giriş gösterir 20 transfekte Sendai virüsü (SeV) tarafından İçişleri Bakanlığı. Şekil 2C 18-21 gün SeV enfeksiyondan sonra görüntülenen SNL besleyici hücreler üzerinde tipik bir pluripotent klon gösterir. Şekil 2B oluşturulan TIL türetilmiş iPSCs normal karyotipe sahip olduğunu göstermektedir. 3 gösterileri Şekil immunofluorescent boyama p onaylamak içiniPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 ve OCT3 / 4) ile ilgili luripotency markör ifade. Şekil 4, melanom TILS türetilen iPSCs üç germ hücreleri, çeşitli içeren teratom oluşturabildiği gösterir (nöral doku, solunum epiteli ve kıkırdak). Til türetilmiş iPSCs TCR düzenlenmeleri korumak oluşturulan 5 gösterileri Şekil.
Şekil 1:. Melanom TILS gelen iPSCs nesil şematik genel protokolü üç aşamadan oluşur: IL-2 ile izolasyon ve TILS kültür, anti-CD3 / CD28 ve Sendai virüsü ile bir hücrenin yeniden programlanması ile T-hücresi aktivasyonu (sev) vektör kodlama Zeiss OCT3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-MYC. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Melanomadan iPSCs oluşturulması TILS (A) rhlL-2 TILS morfolojisi gösteren bir görüntü de kültür başlangıcından 2-3 hafta sonra genişlemeye başladığı zaman. (B) SeV enfeksiyondan sonra TILS bir gün morfolojisi ve GFP temsil Görüntüler. (C) SeV enfeksiyonundan sonra 21. günde tipik ESC benzeri iPSC koloni. Ölçek çubukları 200 mikron =. (D) melanom TILS türetilen iPSCs birinden yirmi G-bantlı metafaz hücrelerinde sitogenetik analizi. Şekil (D) Saito ve ark 16 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg "/>
Şekil 3:., Kök hücre pluripotent belirteçleri ile imuno lekeleme immünoflüoresans tahlili iki hastadan alınan TIL türetilmiş iPSCs SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 ve OCT3 / 4 pozitif olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm.The rakam Saito ve ark 16 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. (NOD / SCID farelerine 6 hafta enjeksiyon sonrası) TIL türetilmiş iPSCs klondan türetilen teratom oluşumu Hematoksilen ile iPSCs ve eozin lekeli Örnek teratom bölümleri için pluripotensin teyit gösterilmiştir. Saito ve diğ 16 uyarlanmıştır Şekil..com / files / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. TIL-iPSCs til-iPSCs TCR-β gen düzenlemesi TCR-β gen düzenlemesi desen çok çeşitli kapiler elektroforez ile tanımlanır. yeşil çizgi Jβ1 geni için bant elde edilir ve mavi çizgi Jβ2 geni için bant elde edilir. Şekil Saito ve ark 16 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: T hücresi, yeniden programlama, t için bileşimumor SNL besleyici hücre ve iPSC medya ve permeabilization ve engelleme tamponlar, toplama. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc, dört transkripsiyon SeV aracılı transdüksiyonu ile iPSCs için melanom TILS yeniden programlanması için bir protokol faktörleri gösterdi. Bu yaklaşım, T hücrelerini yeniden programlamak için SeV sistemi kullanılarak olmayan bir entegre yöntem 7 olanaklar sunar.
Bir önceki çalışma SeV yeniden programlama sistemi fibroblastlar değil, aynı zamanda periferik kan T hücrelerini 7,17 sadece yeniden programlamak yüksek verimli ve güvenilir olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, son zamanlarda daha farklılaşmış ve Pd-1, SeV 16 vektörleri kullanılarak yeniden olabilir periferal kan T-hücreleri daha inhibitör reseptörleri yüksek seviyelerde ifade eden bu melanom TILS göstermiştir. SeV vektörü ile, anti-CD3 / CD28 ile uyarım ve sepsis yeniden programlama TILS kritik olmuştur. Periferal kan T-hücreleri, konu 7 whil gelen hasat hemen sonra yeniden programlanması için anti-CD3 ve IL-2 ile uyarılan edilebilire TILS uyarılmadan önce, IL-2, 3-4 hafta içinde kültüre edilmesi gerekebilir.
TILS fazla% 99 CD8 T hücreleri, IL-2 ve anti-CD3 ile aktivasyon kültür 3-4 hafta sonra rağmen / CD28 16 biz iPSCs TCR düzenlenmesi analizi iPSCs TILS vardır oluşturulan onaylamak için önerilmiştir (Şekil 5). Unutmayın ki, bizimki de dahil olmak üzere önceki çalışmalarda her iPSCs periferik kan mononükleer hücrelerinden sev kullanılarak oluşturulan belirtti veya TILS TCR yeniden düzenlenmesi 7,16 vardı.
Melanom TILS gelen iPSCs üretimi mümkün olmasına rağmen, periferik kan T-hücrelerinin (% 0.1) 7 daha 16 melanom TILS yeniden programlanması verimi düşük (0.01-0.05%) olduğu bulunmuştur. Bunun nedeni belirsizliğini koruyor, ancak inhibitör reseptörlerin yüksek ifadesi veya TILS 13,16 farklılaşan T-hücre alt daha fazla sayıda ile ilişkili olabilir. Son önemli bir ilerlemeyeniden programlama tekniği TIL-iPSCs üretimi için yeniden programlama verimini arttırabilir. İkinci nesil SeV vektörü TS12KOS, önceki çalışmada 18,19 kullanılan geleneksel SeV vektörü daha iPSC nesil daha yüksek verimine sahip olduğu görülmüştür.
Bir SeV yeniden programlama sistemi ile insan iPSCs türetilmesi mümkün olmasına rağmen, bu protokolde dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. Biz bu protokolü SeV enfeksiyonu sırasında fetal sığır serumu kullanın. Biz TILS benzer proliferasyonu rağmen fetal bovin serumu ile bir oranla SeV enfeksiyonu sırasında insan serumu ile ortam kullanılıyorsa, melanom TILS yeniden programlanması etkinliği önemli ölçüde daha düşük olduğu bulunmuştur. Biz de iPSC üretimi ve bakımı için bir fare besleyici tabaka kullanabilirsiniz, ancak tanımlanmış bir besleyici içermeyen ve xeno-free sistemi gelecekteki çalışmalarda alternatif yöntemler olabilir.
Bu iPSCs üretmek için tümör hasat zamanından itibaren iki ay sürermelanom TILS dan. Buna ek olarak, bu transgen içermeyen iPSCs elde etmek için ek 1-2 ay sürer. Bu daha verimli bir virüs eliminasyon hızını 19 göstermiştir SeV vektörü, TS12KOS, yeni tip kullanımı ile kısaltılabilir.
Sonuç olarak, melanom TILS insan iPSCs üretilmesi mümkündür. Geçerli protokol adoptif T hücresi terapisi için tümöre özel T hücrelerinin sonsuz sayıda üretilmesi için önemli bir adım olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
