Abstract
Trasferimento adottivo di ex vivo ampliato linfociti tumore-infiltranti autologhe (TIL) possono mediare le risposte durature e completi in sottogruppi significativi di pazienti con melanoma metastatico. I principali ostacoli di questo approccio sono la ridotta vitalità delle cellule T trasferiti, causate da accorciamento dei telomeri, e il numero limitato di TIL ottenuti da pazienti. Le cellule T Meno dissociati con telomeri lunghi sarebbe un sottoinsieme di cellule T ideale per la terapia delle cellule T adottiva, tuttavia, generando un gran numero di queste cellule T meno dissociati è problematico. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superata dalle cellule utilizzando indotte pluripotenti staminali (iPSCs) che l'auto-rinnovarsi, mantenere i telomeri pluripotenza, si sono allungati, e di fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Qui, vi presentiamo un protocollo per generare iPSCs utilizzando vettori di virus Sendai per la trasduzione di fattori di riprogrammazione in TIL. Questo protocollo generas completamente riprogrammati, cloni libero da vettori. Questi iPSCs TIL-derivati potrebbero essere in grado di generare cellule T-paziente e tumore-specifici meno dissociati per la terapia delle cellule T adottiva.
Introduction
La tecnologia di riprogrammazione cellulare che permette la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante la sovraespressione di un insieme definito di fattori di trascrizione promette grandi sviluppi nel campo delle terapie a base di cellule 1,2. Queste iPSCs presentano caratteristiche trascrizionali ed epigenetici e hanno la capacità di auto-rinnovamento e pluripotenza, analogamente alle cellule staminali embrionali (ESC) 3-5. Notevoli progressi realizzati nella tecnologia di riprogrammazione negli ultimi dieci anni ci ha permesso di generare iPSCs umani anche da cellule terminalmente differenziate, come le cellule T 6-8. IPSCs derivati dalle cellule T (TiPSCs) mantengono la stessa configurazione riarrangiato di recettore delle cellule T (TCR) geni catena come le celle originali T, che permette la rigenerazione delle cellule T antigene-specifiche da TiPSCs 9-11.
Quasi l'80% dei linfociti melanoma infiltranti (TIL) ottenuto da tumore di un paziente specificamente riconoscere tumore-antigeni associati aND mantenere la citotossicità contro le cellule tumorali originali 12. In particolare, l'espressione della morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) sul TIL è stato trovato per identificare il repertorio tumore-reattiva autologo, compresi mutato specifico neoantigene CD8 + linfociti 13. Trasferimento adottivo di ex-vivo TIL autologhe espanse in combinazione con regimi lymphodepleting di preparazione e somministrazione sistemica di Interleuchina-2 (IL-2) può causare sostanziale regressione del melanoma metastatico in sottogruppi di pazienti 14. Nonostante gli incoraggianti risultati in modelli preclinici e nei pazienti, scarsa sopravvivenza delle cellule T infuse e l'esistenza di percorsi immunosoppressivi sembrano compromettere il pieno potenziale della terapia con cellule T adottiva. Protocolli clinici attuali richiedono ampie ex vivo manipolazione di cellule T autologhe per ottenere grandi numeri. Il risultato è la generazione di cellule terminalmente differenziate T che hanno scarsa sopravvivenza, ridotto Prolla capacità iferative, e alti livelli di PD-1 15.
Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superato utilizzando iPSCs che possono fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Abbiamo recentemente riportato la riprogrammazione del melanoma TIL esprimere alti livelli di PD-1 dal virus di Sendai (SeV) trasduzione mediata dei quattro fattori di trascrizione, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc 16. Mentre vettori retrovirali richiedono l'integrazione in cromosomi di accoglienza per esprimere geni riprogrammazione, vettori Sev sono non-integrazione e sono poi eliminati dal citoplasma. La riprogrammazione efficienza è molto più alto con un sistema SeV rispetto lentivirus o retrovirus vettori 6-8. Inoltre, SeV possono specificatamente riprogrammare le cellule T nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), mentre alcuni cloni IPSC generati da lentivirus o vettori retrovirali possono essere da lignaggi nonlymphoid 6-8. Qui, abbiamo dettagliole procedure implementate per l'isolamento e l'attivazione di melanoma umano TIL e per la generazione di iPSCs TIL derivati utilizzando un sistema di riprogrammazione SeV.
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Protocol
NOTA: I pazienti devono dare il consenso informato a partecipare al Institutional Review Board e pluripotenti umane staminali Comitato cellulare ha approvato lo studio.
1. Isolamento e la coltura di TIL
- Ottenere materiale tumorale che non è necessario per la diagnosi istopatologica dal nucleo di appalto del servizio di patologia / tessuto. Posizionare 20-100 g di campioni tumorali in una provetta da 50 ml con 30 ml supporti tumorali raccolta (Tabella 1).
- Sezionare solido, fermo, tessuto normale del campione di tumore da aree necrotiche fragili e / o con sangue con le forbici. Dopo aver rimosso il tessuto necrotico, utilizzare le forbici per sminuzzare il campione più piccolo possibile.
- Dissociare il campione tritato in una cella singola sospensione usando un dissociatore e tumore kit di dissociazione (umana) secondo le istruzioni del produttore. Filtrare la sospensione con un colino cella di 70 micron che è impostato su un tubo da 50 ml e lavare il filtro 2 volte con2 ml di RPMI 1640.
- Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di cellule T (Tabella 1).
- Preparare una soluzione sfumatura a due fasi come Ficoll (soluzione gradiente) in una provetta da 50 ml, con un gradino più basso di 10 ml di soluzione di pendenza 100% ed una fase di mezzo di 30 ml di soluzione di pendenza 75% diluito con fosfati di Dulbecco salina tamponata, senza calcio, senza magnesio (D-PBS (-)).
- Strato di sospensione cellulare (dal punto 1.4) sulla soluzione gradiente (dal punto 1.5). Centrifugare a 400 xg a 20 ° C per 45 min.
- Raccogliere il livello contenente le TIL arricchite all'interfaccia tra la soluzione di pendenza 100% e la soluzione pendenza 75% in una provetta da 50 ml. Diluire il livello della soluzione con i TIL arricchiti aggiungendo 20-30 ml di D-PBS (-).
- Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere la frazione TIL arricchita in 10 mldei mezzi di comunicazione delle cellule T.
- Culture la frazione (dal punto 1.8) con 2 ml di mezzi di cellule T e 6.000 UI / ml ricombinante umana (rh) IL-2 in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2.
- Modificare la metà della media su giorno 5 dopo la cultura iniziazione e ogni 2-3 giorni successivi.
- Dividere le celle con un rapporto di 1: 2 senza tripsinizzazione dopo dolcemente sospensione, raddoppiando il numero di pozzetti quando raggiunge 80-90% di confluenza. Aggiungere un volume metà (1 ml) di supporto delle cellule T freschi e rhIL-2 a 6.000 UI / ml.
2. Preparazione di Mitomicina-C-trattati SNL Feeder zolla delle cellule
- Culture cellule feeder BN in 10 ml di SNL supporti cella alimentatore (Tabella 1) su una gelatina rivestita 10 centimetri piatto 0,1% fino al 80-90% di confluenza (3-4 x 10 6 cellule) viene raggiunto.
- Aggiungere 310 ml di 0,4 mg / ml soluzione mitomicina C direttamente nel piatto di coltura cellulare alimentatore BN e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore e 15 min. Aspirare il supporto di unnd lavare le cellule due volte con 5 ml di D-PBS (-).
- Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina / 1 mM EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 min per dissociare le cellule. Aggiungere 4,5 ml di mezzi di cellule di alimentazione SNL per neutralizzare e risospendere le cellule in una sospensione singola.
- Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare media e contare le cellule con un emocitometro dopo la ri-sospensione in 10 ml di SNL mezzi cellule alimentatore.
- Piatto 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto di cellule feeder SNL su un piatto 10 cm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Utilizzare le cellule di alimentazione SNL entro 3 giorni.
3. Generazione di iPSCs Uso del virus di Sendai (SeV) Vector
- Raccogliere il TIL (dal punto 1.11) e attivare 5 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastriforme vincolato CD3 anti-umano (1 ug / ml) e mouse solubile CD28 anti-umano (5 mg / ml), con rhIL-2 (6.000 UI / ml) in 2 ml di mezzi di cellule T in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 giorni.
- Raccogliere il TIL (dal punto 3.1) in un tubo da 15 ml con una pipetta e contare il numero di cellule con un emocitometro.
- Riattivare 1 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastra-bound CD3 anti-umano (1 ug / ml) e topo solubile anti-human CD28 (5 mg / ml), con rhIL-2 (60 UI / ml) in 500 microlitri di mezzi di riprogrammazione (Tabella 1) per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Preparare 3 pozzi per l'infezione SeV: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc (1 bene); infezione SeV (GFP: proteina fluorescente verde) (1 bene); e conta delle cellule (1 bene).
- Dopo 24 ore (dal punto 3.3), contare il numero di cellule con un emocitometro e determinare il volume di ogni virus per diversi (3-20) molteplicità di infezione (MOI). Rimuovere una serie di tubi vettore virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare i vettori Sev rapidamente in un bagno d'acqua (37 ° C) e disporli sul ghiaccio.
Volume del virus (ml)= MOI (CIU / cella) x numero di cellule / titolo del virus (CIU / ml) × 10-3 (ml / ml) - Aggiungere i volumi calcolati di ciascuno dei quattro tubi vettore virus Sendai che portavano singolarmente Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC aggiungendo una miscela di vettori SEV al 10-20 MOI in media, compresa attivato TIL.
- Per determinare l'efficienza di trasduzione, aggiungere i volumi calcolati di SEV-GFP in un pozzo di TIL attivati.
- Collocare la capsula (dal punto 3.5 e punto 3.6) in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Dopo 24 ore, valutare l'efficienza di infezione con TIL infettati con SEV-GFP in microscopia a fluorescenza.
- Raccogliere le cellule (dal punto 3.5) in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min.
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzi hESC con Primate ES cellulare medio e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml).
- Trasferire la sospensione in un 10 centimetri piatto che CONTAins mitomicina-C-trattata cellule di alimentazione SNL in 10 ml di hESC supporti. Modificare i media hESC a giorni alterni fino a quando le colonie sono cresciuti.
- Intorno al giorno 18 al 21, rimuovere le cellule di alimentazione SNL intorno alle colonie sotto un microscopio con una punta di 10-microlitri nel banco pulito.
- Raschiare le colonie con una punta di 10-microlitri e trasferirli con una punta di 200 microlitri in 100 ml di iPSCs mezzi per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Pipettare su e giù a 2-3 volte di rompere le colonie in piccoli grumi con una dimensione media di 50-100 micron.
- Trasferire i piccoli ciuffi in 6 pozzetti piastre di coltura dei tessuti con cellule di alimentazione SNL mitomicina-C-trattati (dal passaggio 2) in 2 ml per pozzetto di iPSCs supporti con il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Cambiare i media iPSCs ogni giorno.
- Trasferire le iPSCs a 6 pozzetti di coltura tissutale con cellule feeder BN mitomicina-C-trattati fresche con 1 mg / ml di collagenasi IV ogni 5-6 giorni. Preparare 2 pozzi per piatti di ogni clone per immunostaining.
- Determinare la completa riprogrammazione di ogni clone dalla colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, TRA-1-81, e Oct3 / 4) 1.
NOTA: Per ulteriori valutazione del potenziale pluripotenza, confermano che le linee IPSC completamente riprogrammate possono differenziarsi in tre foglietti embrionali da una formazione del corpo embrioide e saggio di differenziazione o di un saggio di formazione teratoma 16. - Verificare che le linee IPSC completamente riprogrammati dimostrano un cariotipo normale analisi citogenetica.
- Per la formazione teratoma, iniettare una indifferenziata TIL derivato COPSI (1 x 10 6) sospensione in 100 ml di DMEM contenente 10% FCS nel tessuto sottocutaneo di 6-8 settimane topi NOD / SCID vecchi femminili. sezioni teratoma macchia con ematossilina ed eosina.
4. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per SSEA3, SSEA4, TRA1-60 e TRA1-81
- Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di 4% annuosoluzione raformaldehyde per 10 minuti. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte.
NOTA: Fare attenzione quando si utilizza paraformaldeide perché è tossico. - Pretrattare le iPSCs con tampone di bloccaggio (Tabella 1) per 30 minuti. Nel frattempo, diluire gli anticorpi primari (ratto anti-umano SSEA3, topo anti-umana SSEA4, topo anti-umano TRA1-60 e mouse TRA1-81 anti-umano) soluzione di capra siero 1:50 in 1,5% diluiti con PBS e TritonX -100 (volume totale: 1 ml).
- Rimuovere il tampone di bloccaggio (Tabella 1). Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, diluire l'anticorpo secondario (IgG anti-topo e IgM o anti-topo IgM) 1:50 in 1,5% soluzione di capra siero.
- Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ciascuno per 5 min. Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito e incubare per 45 min a temperatura ambiente in una stanza buia. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario diluito e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs con microscopia a immunofluorescenza.
5. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per Oct3 / 4
- Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% per 10 min. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con PBS 3 volte.
- Aggiungere tampone di permeabilizzazione (Tabella 1) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione e aggiungere tampone di bloccaggio (Tabella 1).
- Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Nel frattempo, diluire l'anticorpo primario (del mouse Oct3 / 4 anti-umano) 1:50 in tampone di bloccaggio.
- Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare a 4 ° C durante la notte.
- Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Nel frattempo, dilute l'anticorpo secondario (capra anti-topo IgG / IgM) 1: 100 in tampone di bloccaggio.
- Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito ed incubare a temperatura ambiente in una stanza buia per 45 min.
- Rimuovere la soluzione secondaria diluita e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs al microscopio immunofluorescenza.
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Representative Results
La Figura 1 mostra la descrizione della procedura che coinvolge l'espansione iniziale del melanoma TIL con rhIL-2, che è seguita da attivazione con anti-CD3 / CD28 e trasferimento genico Oct3 / 4, Klf4, SOX2, e c-MYC per TIL per la generazione di iPSCs. Di solito, TIL sulla cultura con rhIL-2 cominciano a formarsi le sfere 21-28 giorni dopo l'inizio della cultura. A questo punto, TIL sono pronti per essere attivato con anti-CD3 / CD28. La figura 2A mostra TIL, sulla cultura con rhIL-2 il giorno 21, che sono pronti per essere attivato con anti-CD3 / CD28. La figura 2B mostra introduzione GFP da Sendai virus (SeV) trasfettate a 20 MOI. Figura 2C mostra un tipico clone pluripotenti su cellule di alimentazione SNL che appare 18-21 giorni dopo l'infezione SeV. la figura 2D mostra che i iPSCs TIL-derivati generati hanno un cariotipo normale. la figura 3 mostra immunofluorescenza colorazione per confermare pmarcatore luripotency espressione sul iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60, e Oct3 / 4). Figura 4 mostra che iPSCs derivato da TIL melanoma sono in grado di formare teratoma che contengono una varietà di cellule da tre foglietti embrionali (neurale tessuto, epitelio respiratorio, e della cartilagine). La Figura 5 mostra che hanno generato iPSCs TIL-derivati mantengono riarrangiamenti TCR.
Figura 1:. Schema della generazione di iPSCs da melanoma TIL Il protocollo prevede tre fasi: isolamento e la coltura di TIL con IL-2, l'attivazione delle cellule T con anti-CD3 / CD28, e la riprogrammazione delle cellule con il virus di Sendai (SeV) vettore di codifica Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Generazione di iPSCs da melanoma TIL (A) Un'immagine che rappresenta la morfologia della TIL in rhIL-2 quando ha iniziato ad espandersi 2-3 settimane dopo l'inizio della coltura. (B) che rappresentano la morfologia e la GFP espressione di TIL un giorno dopo l'infezione SeV. (C) Un tipico ESC-come colonia iPSC il giorno 21 dopo l'infezione SeV. Le barre scale = 200 micron. (D) L'analisi citogenetica su una ventina di cellule in metafase G-fasciato da una delle iPSCs derivanti da melanoma TIL. Figura (D) è adattato da Saito et al 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3:. Colorazione immunofluorescenza con i marcatori di cellule staminali pluripotenti Il test di immunofluorescenza dimostra che i iPSCs TIL-derivati da due pazienti sono positivi per SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, e Oct3 / 4. La figura Barre di scala = 100 μm.The è adattato da Saito et al 16. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. La conferma della pluripotenza per iPSCs con teratoma formazione Hematoxylin- e sezioni teratoma rappresentativi eosina macchiato derivati dal iPSCs clone TIL-derivato (6 settimane dopo l'iniezione in topi NOD / SCID) sono mostrati. Figura adattato da Saito et al 16..com / files / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Una vasta gamma di TCR-beta modelli disposizione gene in gene riarrangiamenti TIL-iPSCs TCR-beta in TIL-iPSCs sono identificati da elettroforesi capillare. La linea verde è derivato dalla banda per il gene Jβ1, e la linea blu è derivato dalla banda per il gene Jβ2. La figura è adattato da Saito et al 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Composizione per la cellula T, riprogrammazione, tumor raccolta, SNL cellule di alimentazione, e mezzi IPSC, e la permeabilizzazione e buffer di blocco. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
Qui, abbiamo dimostrato un protocollo per la riprogrammazione TIL melanoma a iPSCs da trasduzione SEV-mediata dei quattro fattori di trascrizione Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questo approccio, utilizzando un sistema SeV per riprogrammare cellule T, offre il vantaggio di un metodo non integrare 7.
Uno studio precedente ha mostrato che un sistema riprogrammazione SeV era altamente efficiente e affidabile per riprogrammare fibroblasti non solo, ma anche le cellule T del sangue periferico 7,17. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che i TIL melanoma che sono più differenziati ed esprimono alti livelli di recettori inibitori, come PD-1 di cellule periferiche del sangue T può anche essere riprogrammato utilizzando SeV vettori 16. Tempi di stimolazione con anti-CD3 / CD28 e l'infezione con SeV vettore è stato fondamentale nella riprogrammazione TIL. Cellule periferiche del sangue T possono essere stimolati con anti-CD3 e IL-2 per la riprogrammazione immediatamente dopo la raccolta dal soggetto 7, while TIL devono essere coltivate per 3-4 settimane con IL-2 prima della stimolazione.
Anche se oltre il 99% dei TIL erano cellule T CD8 dopo 3-4 settimane di coltura con IL-2 e l'attivazione con anti-CD3 / CD28 16, si consiglia l'analisi di TCR riarrangiamento in iPSCs per confermare che hanno generato iPSCs sono da TIL (Figura 5). Da segnalare, studi precedenti compreso il nostro indicato che ogni iPSCs generati utilizzando SeV da cellule mononucleate del sangue periferico o TIL avuto TCR riarrangiamento 7,16.
Anche se la generazione di iPSCs da melanoma TIL era fattibile, abbiamo scoperto che l'efficienza riprogrammazione del melanoma TIL era inferiore (0,01-0,05%), 16 a quella delle cellule T del sangue periferico (0,1%) 7. La ragione di ciò non è chiara, ma potrebbe essere associato con l'alta espressione di recettori inibitori o la maggior numero di sottoinsiemi di cellule T differenziate in TIL 13,16. Recenti progressi significativiper la tecnologia di riprogrammazione può migliorare l'efficienza di riprogrammazione per la generazione di TIL-iPSCs. Il secondo vettore SeV generazione, TS12KOS, è stato trovato per avere una maggiore efficienza di generazione iPSC rispetto al vettore SeV convenzionale utilizzato nel precedente 18,19 studio.
Anche se la derivazione di iPSCs umani con un sistema di SeV riprogrammazione è fattibile, ci sono diverse limitazioni da considerare in questo protocollo. Usiamo siero fetale bovino durante l'infezione SeV in questo protocollo. Abbiamo scoperto che l'efficienza riprogrammazione del melanoma TIL era significativamente inferiore se si utilizzano supporti con siero umano durante l'infezione SeV rispetto a uno con siero fetale bovino, nonostante simile proliferazione di TIL. Usiamo anche uno strato di alimentazione del mouse per la generazione e la manutenzione IPSC, ma un sistema di alimentazione e la connessione-xeno definiti possono essere metodi alternativi in studi futuri.
Ci vogliono circa due mesi dal momento della raccolta del tumore di generare iPSCsda melanoma TIL. Inoltre, ci vorrebbe un ulteriore 1-2 mesi per ottenere iPSCs senza transgene. Questo potrebbe essere ridotto mediante l'uso del nuovo tipo di SeV vettore, TS12KOS, che ha mostrato una più efficiente velocità di eliminazione del virus 19.
In conclusione, la generazione di iPSCs umani di melanoma TIL è fattibile. Il protocollo attuale potrebbe essere un passo importante per la generazione di un numero infinito di cellule T tumore-specifiche per la terapia delle cellule T adottiva.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
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