Introduction
O objetivo desse método é criar um modelo reproduzível para a hipertensão arterial pulmonar grave, induzida por fluxo em ratos e medir o seu princípio hemodinâmica e pontos finais histopatológicos.
A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma síndrome clínica que engloba um aumento progressivo na resistência vascular pulmonar, levando à falência ventricular direita e morte. Dentro do espectro da doença subordinador de doenças de hipertensão pulmonar (PH), HAP é a forma mais grave e uma que permanece sem cura 1. A arteriopatia subjacente na HAP é caracterizada por uma forma típica de remodelação vascular que provoca a oclusão do lúmen do vaso. Muscularização de navios não muscularização normais e hipertrofia da camada navio medial são considerados fenômenos precoce da doença em HAP, também são vistos em outras formas de PH 2, e são pensados para ser reversível 3. Conforme a HAP umdvances, a camada íntima começa a remodelar, eventualmente formando lesões neointimais característicos 2. -Type neointimal remodelamento vascular pulmonar é exclusivo para PAH e está actualmente a ser considerada irreversível 4.
Conforme a HAP é uma doença rara, os avanços na sua compreensão pathobiological e desenvolvimento de novas terapias têm se baseou fortemente em modelos animais. O modelo monocrotalin (MCT) em ratos é um simples modelo de hit single que tem sido, e ainda é, frequentemente utilizado. MCT é uma toxina que causa lesão aos arteríolas pulmonares e inflamação regionais 5. 60 mg / kg de MCT leva a um aumento da pressão arterial pulmonar média (PAP), a resistência vascular pulmonar (RVP), e a hipertrofia ventricular direita (HVD) depois de 3 - 4 semanas 6. O histomorfologia é caracterizada por hipertrofia medial isolada, sem lesões neointimais 5. o MCTmodelo de rato representa, assim, uma forma moderada de PH, e não HAP, embora seja normalmente apresentado como o último.
Em crianças com HAP associada a um shunt congênita da esquerda para a direita (HAP-CHD), aumento do fluxo sanguíneo pulmonar é considerado como o gatilho essencial para o desenvolvimento de lesões neointimais 7, 8, 9. Em ratos, o aumento do fluxo sanguíneo pulmonar pode ser induzida através da criação de uma derivação entre a aorta abdominal e a veia cava, uma técnica descrita pela primeira vez em 1990 10. Alternativas para criar aumento do fluxo pulmonar são por pneumonectomia unilateral ou subclávia à anastomose da artéria pulmonar 11. desvantagens conceituais desses modelos consistem em potencial de crescimento compensatório do pulmão remanescente e ativação da via de adaptação induzida pela pneumonectomia, ou de lesão iatrogênica da vasculatura pulmonar devidoa anastomose da artéria pulmonar, tanto confundindo os efeitos do aumento do fluxo sanguíneo pulmonar.
Quando um shunt aorto-cava é criado e aumento do fluxo sanguíneo pulmonar é induzida como um segundo hit em ratos tratados com MCT, lesões neointimais característicos ocorrem, e uma forma grave de HAP e falência do ventrículo direito associada (RVF) Desenvolver 3 semanas após o aumento fluir 12. A progressão hemodinâmica da HAP neste modelo pode ser avaliada in vivo pelo ecocardiograma e cateterismo cardíaco direito. O histomorfologia vascular, espessura da parede do vaso, o grau de oclusão arteriolar, e os parâmetros para a falência do ventrículo direito formam os pilares da caracterização ex vivo da HAP.
Este método descreve protocolos detalhados para a cirurgia de derivação aorto-cava (AC-shunt), cateterismo cardíaco direito e avaliação qualitativa e quantitativa de histomorfologia vascular.
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Protocol
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comité Central Holandês para Experimentação Animal e do Comité de Cuidados com Animais da Universidade Medical Center Groningen (NL). foram usados tanto em ratos Wistar e Lewis com pesos entre 180 e 300 g.
1. Habitação e aclimatação
- Depois da chegada ao biotério central, ratos de casas em grupos de 5 por gaiola. Durante um período de aclimatação de 7 dias, acostumar os ratos a manipulação humana, mas não realizar quaisquer procedimentos experimentais.
2. Preparação e Injecção de estéril Monocrotalin
- Para 1 mL de 60 mg / mL monocrotalin (MCT) solução, pesar 60 mg de monocrotalin num tubo de 2 mL. Adicionar 700 ul de NaCl a 0,9%. Adicionar 200 mL de HCl 1M. Aquecer a solução no tubo sob água corrente da torneira quente e vortex-lo. Use N NaOH 6 para levar o pH no sentido 7.0. Use técnica estéril para a preparação do MCT para injeção em roedores. Injectar 1 mL de ml de solução estéril de 60 mg / MCT por kg por via subcutânea no pescoço (0,3 mL de 60 mg / ml para uma MCT-300 g de rato). NOTA: Nós não preferem usar volumes menores devido à maior chance de que a dose injectada não será apropriado.
Cirurgia Shunt 3. Aorta-cava
- Anestesia.
- Encher a câmara de indução com 5% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min) e colocar o rato na câmara. Verifique para a profundidade adequada da anestesia através da realização de uma pitada dedo do pé traseiro. Pesa-se o rato.
- Raspar e limpar o abdômen por uma área que é de aproximadamente 8 cm de comprimento e 3 cm de largura. Coloque o rato em sua parte traseira em uma esteira de calor (37 ° C) coberto por um tapete estéril.
- Colocar o focinho num ventilação máscara / capa com 2-3% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min). Verifique a profundidade da anestesia através da realização de uma pitada dedo da pata traseira. Aplicar pomada para evitar a secura e sob anestesia.
- shunt Surgery.
- Esfregar a pele com cloreto de-hexidine para a desinfecção. Injectar 0,01 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória.
- Utilize instrumentos estéreis para a cirurgia. Faça uma incisão com uma lâmina de bisturi nº 10 no abdômen na linha média, a partir de 1 cm abaixo do diafragma uma estendendo-se para baixo a apenas acima da genitália.
- Levanta o intestino com um cotonete de algodão, cobrir os intestinos em, uma gaze molhada estéril (NaCl a 0,9%), e colocá-los para o lado esquerdo do animal.
- Use cotonetes para separar as membranas que se ligam a aorta abdominal e veia cava inferior para os tecidos circundantes.
NOTA: Não dissecar as membranas entre a aorta ea veia cava. - Usando fórceps lasca, remover a gordura da aorta perivascular acima da bifurcação, apenas no lado direito da aorta e apenas no local onde a agulha será inserida.
- Use cotonetes para separar a aorta ea veia cava a partir mm supe 2rior ao local onde a agulha será inserida, de modo a criar espaço para uma braçadeira Biemer.
- Nesta área, em primeiro lugar colocar uma ligadura solta (5-0 sutura) em torno da aorta. Criar tensão na ligadura, colocando um grampo Kocher sobre ele, e, em seguida, colocar o Kocher superior ao da incisão (Figura 1A). Coloque a braçadeira Biemer apenas superior à ligadura (Figur e 1A).
- Com um cotonete de algodão, comprimir a veia cava como distalmente possível para obstruir o fluxo (Figura 1A). Dobrar uma agulha (18 L neste protocolo) num ângulo de 45 graus, com o orifício de apontador para o exterior (Figura 1A).
- Em um ângulo de 90 graus, inserir a agulha na aorta, acima da bifurcação, com o orifício da agulha que aponta para a esquerda (Figura 1A). Manipular a ponta da agulha para a esquerda e inseri-lo na veia cava.
NOTA: A ponta da agulha deve ser agora visible na veia cava (Figura 1B). - Usar um segundo cotonete para empurrar o restante sangue na aorta para fora do local de inserção para prevenir a trombose. Seca-se a área em torno da derivação com uma gaze estéril a fim de que a cola para colar de forma adequada.
- Retire a agulha toda para fora da aorta e aplicar imediatamente uma gota de cola de tecido para o local da punção na aorta. Certifique-se não cola o cotonete para o tecido. Soltar a aorta.
- Verifique se o shunt manualmente puxando e soltando a ligadura na proximal aorta para o shunt. Afrouxamento deve colorir a distal da veia cava para a derivação no vermelho brilhante e criar turbulência no local shunt.
NOTA: O aperto vai virar o sangue na veia cava volta ao vermelho escuro. - Colocar os intestinos de volta no animal. Feche a camada de músculo e pele com reabsorvíveis 4-0. Ventilar o animal com 100% de O2 para se recuperar da anestesia.
NOTA: Não deixe um animal autônoma até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Cirurgia Sham.
- Executar todos os procedimentos anteriores excepto para a inserção da agulha no interior da aorta.
- cuidados pós-cirúrgicos.
- Colocar o rato em uma gaiola única e em uma incubadora a 37 ° C até à manhã seguinte.
- Cerca de 6 horas após a cirurgia, injetar de 0,01 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória. Repita na manhã seguinte se o rato mostra sinais de desconforto.
NOTA: Os primeiros 3 dias após a cirurgia, os ratos tendem a comer e beber menos (isto é particularmente importante quando ração ou água potável são misturados com drogas). A maioria dos ratos mostram um comportamento normal de 3 dias após a cirurgia. Se não, acompanhar de perto. A perda de peso superior a 15% em uma semana é considerada anormal, e esses ratos deve ser sacrificados por a extracção do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia.
NOTA: Neste protocolo, o animal é sacrificado pela extração do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia.
- Sacrificar um dia após a cirurgia (MF8) para as primeiras respostas celulares e funcionais ao aumento do fluxo sanguíneo pulmonar (por exemplo, gene-regulação ou fatores de transcrição precoce).
- Sacrificar uma semana após a cirurgia (MF14) para um fenótipo PAH vascular em estágio inicial (hipertrofia medial sem lesões neointimais).
- Sacrifício 2 semanas após a cirurgia (MF21) para um fenótipo PAH vascular em estágio avançado (marcada hipertrofia medial ea formação neointimal) com elevação ligeira na RVP e PAP.
- Sacrificar 3 semanas após a cirurgia (MF28) para um fenótipo PAH vascular em fase terminal (oclusão neointimal marcada) e elevação forte na RVP e PAP. Os sinais clínicos de falência ventricular direita são comuns nesta fase.
- Sacrifício após o dia 28 (MF-RVF) Para a falência do ventrículo direito associada à HAP (RVF), clinicamente definida como dispneia, letargia grave, e perda de peso (<10% em 1 semana). Terminar ratos quando um desses sinais está presente. Frequentemente, os ratos desenvolvem estes sintomas entre os dias 28 e 35 e, se deixada sem vigilância, morrer espontaneamente durante este intervalo de tempo.
5. Direito cateterismo cardíaco
- Anestesia.
- Encher a câmara de indução com 5% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min) e colocar o rato na caixa. Verifique para a profundidade adequada da anestesia através da realização de uma pitada dedo do pé traseiro. Pesa-se o rato.
- Raspar e limpar o pescoço no lado direito-ventral do rato e, para o protocolo de ecocardiografia, o tórax e abdômen superior.
- Colocar o rato de costas sobre um tapete de calor (37 ° C) e colocar o focinho num ventilação máscara / capa com 2-3% de isoflurano / O2 a 100% (fluxo: 1 L / min). O focinho deve ser enfrentado para o pesquisador.
- protocolo de ecocardiografia.
- Realizar a ecocardiografia de acordo com o protocolo descrito por Brittain et ai. em JoVE 13.
- protocolo de cateterismo.
NOTA: Este protocolo utiliza uma cânula rígida pré-formada com uma ponta dobrada a 20 graus para guiar o cateter de silicone de 15 cm com uma esfera de 2 mm da ponta. Uma agulha 20-G com seu orifício ligeiramente dobrados para o interior é usado para inserir a cânula na veia jugular direita (veja a lista de materiais). Os ratos em qualquer fase de progressão e controlo HAP podem ser utilizados no presente protocolo.- Desinfectar o pescoço com cloreto de-hexidine. Faça um 1,5 cm incisão com uma lâmina de bisturi # 10 no lado direito-ventraldo pescoço, da clavícula direita ao osso mandibular.
- Espalhe o tecido com uma tesoura. Com uma pinça, puxe o tecido separados até a veia jugular aparece. Dissecar as membranas em torno da veia jugular com a pinça dissidentes.
- Coloque a tensão na veia jugular, colocando uma ligadura soltas (5-0 sutura) em torno do vaso. Aumentar a tensão e fita a ligadura sobre a máscara de ventilação (Figura 2A).
- A jusante do local de inserção, colocar uma ligadura solta em torno do vaso para apertar depois de a cânula in situ, de modo a evitar fugas e perdas de pressão.
- Utilizando as alças de uma pinça, dobrar ligeiramente a ponta de uma agulha de 20-L com o orifício para o interior para realizar a cânula com o cateter.
- Introduzir a ponta da agulha 20-G para dentro da veia e rapidamente colocar a cânula que contém o cateter no interior do vaso. Retire a agulha e, em seguida, feche a ligaduraque foi preparado no passo 5.3.4.
- Conduzir a cânula que contém o cateter na veia jugular. A ponta da cânula é uma curva de 20 graus (ver o passo 5.3.5). Manobra da cânula sob a clavícula e avançar um pouco para entrar no átrio direito (Figura 2C).
- Para entrar no ventrículo direito, momento a ponta da cânula para a esquerda, para o coração (Figura 2D). No monitor de cabeceira, uma curva de pressão RV deve aparecer, combinando Figura 2D.
- Quando a curva de pressão VD é constante, anote a pressão do ventrículo direito sistólica e diastólica 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipular a ponta da cânula para a esquerda e para cima. Avançar o cateter no interior da cânula (Figura 2E).
- Avance o cateter na artéria pulmonar principal (PA). Nenhuma resistência deve ser sentida quando se passa da válvula pulmonar.
NOTA: Quando o cateter entra na artéria pulmonar principal, o dpressão iastolic vai subir. No monitor de cabeceira, uma curva de pressão PA deve aparecer, combinando Figura 2E. - Quando a curva de pressão PA é constante, anote as pressões sistólica, diastólica e média pressão PA 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Além disso avançar o cateter no interior da cânula até que a bola na ponta do cateter fica entalado numa artéria pulmonar. Observar a curva de pressão sobre a queda monitor de cabeceira e combinar a curva de pressão em cunha na Figura 2F.
- Quando a curva de pressão em cunha é constante, anote as pressões sistólica, diastólica e média pressão em cunha.
- Puxe o cateter lentamente e, posteriormente, medir e anotar os valores para sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 e dRVP2, como exibido no monitor de cabeceira.
- Quando no RV, ligeiramente puxar a cânula e cateter para medir a pressão média do átrio direito (PAD). A curva deve coincidir com a curva RAP na Figura 2A.
NÃOTE: Neste protocolo, os ratos são sacrificados após o protocolo de cateterismo por a extracção do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia.
6. Morfologia Avaliação e morfometria
NOTA: Neste protocolo, o animal é sacrificado pela extração do volume de sangue circulante, enquanto sob anestesia. Os ratos em qualquer fase de progressão e controlo HAP podem ser utilizados no presente protocolo.
- Após o sacrifício, tirar os pulmões, cortando a traqueia cerca de 5 mm acima da bifurcação brônquica e os navios que ligam os pulmões ao coração. Coloque os pulmões em soro fisiológico frio. Dissecar o pulmão esquerdo. Corte o brônquio principal esquerdo na bifurcação.
- Encha uma seringa de 50 ml com paraformaldeído a 4%, anexar um tubo com uma cânula para a seringa, e pendurar a seringa cerca de um metro acima da tabela de trabalho. Encaixar a cânula no brônquio principal esquerdo para passivamente encher o pulmão com paraformaldeído.Lidar com paraformaldeído com cautela.
- Incubar o pulmão esquerdo em paraformaldeído durante 48 h.
- Desidratar o pulmão esquerdo por incubação consecutivamente em 70% de etanol (1 hora), 80% de etanol (1 hora), 90% de etanol (1 hora), etanol a 100% (3 h), xilol (2 h), e parafina ( 2 h).
- Incorporar o pulmão esquerdo em parafina, com o hilo do pulmão de frente para a cassete.
- Corar as secções de pulmão, 4 mícrons embebidos em parafina usando uma coloração Verhoeff ou Elastica-van Gieson, de acordo com as instruções do fabricante 29. Certifique-se as lâminas elásticas são bem diferenciados (como na Figura 3). Digitalizar os cortes corados em 40X.
- Divida o pulmão em 4 quadrantes. Em cada quadrante, encontrar 10 navios, com um diâmetro exterior <50 mm (intra-acinares) e 10 navios, com um diâmetro exterior> 50 mm (pré-acinares). Tire uma foto (2 x 40 imagens por pulmão). Zoom aleatoriamente até 20x e fotografar todos os naviosneste campo de visão para minimizar o viés de seleção.
- Excluir embarcações que têm uma proporção mais longo / curto de diâmetro> 2, uma forma circular incompleto, ou um colapso de mais do que um quarto da parede do vaso.
NOTA: Um exemplo de um vaso excluída é mostrada na Figura 3b Faça cada foto na mesma ampliação (40x) e incluem uma barra de escala. - Abrir ImageJ e a primeira imagem. Desenhar uma linha reta na barra de escala na imagem para definir a escala através de "Analyse" e "escala Set." Por "distância conhecida," utilizar o valor na barra de escala da imagem. Use micrómetros (um) como a unidade de comprimento. Defina a escala para global.
- Usando "seleções à mão livre", desenhar uma linha sobre o bordo interior da área luminal (Figura 3), e usar "medir" (Crtl m) para medir nesta área. Em seguida, desenhe uma linha ao redor do exterior elástica lIC lâmina (Figura 3) para medir a área total do vaso.
- Calcular luminal e o diâmetro exterior (
) usando 
. - Calcular a espessura de parede utilizando
. - Calcula-se a razão de parede / lúmen usando
. - Calcular a pontuação oclusão usando
. - Pontuação do navio em muscularização (sem, muscularização parcial, ou total) (Figura 3B).
Nota: Os recipientes com uma lâmina elástica dupla para mais de metade da circunferência são definidos como totalmente muscularização. As embarcações com uma lâmina elástica dupla menos de metade da circunferência são definidos como parcialmente muscularização. - Marcar o recipiente na presença de um NeoiNtima (sim ou não) (Figura 3C).
Nota: Os recipientes sem uma lâmina elástica interna claramente definido combinado com oclusão (muitas vezes excêntrico) luminal são definidas como lesões neointimal.
) usando 
. 
. 
. 
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Representative Results
Os resultados representativos são apresentados na Figura 4. Os resultados apresentados mostram características do MCT + FLUXO em ratos Lewis nos seguintes grupos: Controle (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5) e MF-RVF ( n = 10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o one-way ANOVA com correção de Bonferroni.
60 mg / kg MCT e aumentou a vantagem fluxo sanguíneo pulmonar a um aumento significativo na pressão do ventrículo direito sistólica (SRVP) (23 ± 6 para 56 ± 11 mmHg), pressão sistólica da artéria pulmonar (PSAP) (20 ± 4 para 54,0 ± 10 mmHg ) e pressão média da artéria pulmonar (PAP) (16 ± 3 a 36 ± 4 mmHg) a 28 dias (MF28). Eles permanecem igualmente elevado até ao estádio quando falência ventricular direita se desenvolve (MF-RVF) (Figura 4). Nas fases iniciais de HAP (MF8 e MF14), sem aumento da SRVP, SPAP e PAP é observado. PAP diastólica e um direitoaumento da pressão julgamento em fases tardias, mas não de forma significativa. pressões de cunha não mudam significativamente durante a progressão da doença.
O ventrículo direito do ventrículo para a esquerda e do septo relação de peso aumenta significativamente a partir de MF14 para MF-RVF, indicando hipertrofia ventricular direita. relação peso líquido-a-seco do fígado é significativamente maior na fase MF-RVF, indicando edema fígado e insuficiência ventricular direita congestiva.
Muscularização dos vasos intra-acinar <50 mm aumenta progressivamente durante a progressão da HAP. Navios deste tamanho normalmente não têm uma camada medial muscular em ratos controle. No MF14, quase metade destes navios (43 ± 17%) tem uma media muscular total (como na Figura 3B). No MF28 e MF-RVF, quase todas as arteríolas é muscularização (98,7 ± 2,5% e 100 ± 0%). lesões neointimal ocorrer primeiroem MF21, enquanto ao MF28 e MF-RVF, cerca de 65% de todas as arteríolas tem uma camada de neo-íntima (como na Figura 3C). Os arteriolares parede a luz de razão e de oclusão pontuações tanto aumentar significativamente a partir MF14 para MF28 (respectivamente, 10,4 ± 3,9 para 71,5 ± 30 (con: 7,1 ± 0,2) e 20,0 ± 2,8 para 54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). Os hemodinâmicos e histomorfológicas características de progressão da HAP em MCT + FLUXO em ratos Wistar são similares 14.
Figura 1. Representação esquemática da cirurgia de derivação aorto-cava. A) A aorta é posta sob tensão e apertada superior ao local de inserção. A veia cava inferior é comprimida para o local de inserção. A agulha, dobrada a 45 ° e com o orifício para o exterior, é inserida na aorta em um ângulo de 90 °. B) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Direito procedimento de cateterização cardíaca e curvas de pressão representativos. A) A veia jugular direita é tensionada com uma ligadura e colado sobre a máscara de ventilação. O cateter é colocado na veia jugular. B) Um monitor de cabeceira exibindo uma onda de pressão do ventrículo direito. C) O cateter no interior da cânula colocada no átrio direito após a introdução na veia jugular direita. Abaixo: uma onda de pressão atrial direita típico. D) O cateter no interior da cânula colocada no ventrículo direito. Abaixo: a ventricul típica direitaonda de pressão ar na HAP em fase terminal. E) O cateter é avançada em que a cânula entrar na artéria pulmonar principal. Abaixo: uma onda típica pressão arterial pulmonar. F) O cateter é avançada para as artérias pulmonares até uma onda de pressão de cunha é exibida no monitor. Abaixo: uma onda típica pressão capilar pulmonar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Vascular Morfologia e morfometria em ratos controle e HAP. A) Uma embarcação normal, não-muscularização com uma pontuação de oclusão de 3,7%. B) A arteríola totalmente muscularização com uma pontuação de oclusão de 24,3%. C). Uma lesão neointimal com uma pontuação de oclusão de 54,1%. D) E) A medição da área total do vaso e luminal (num recipiente com uma representação esquemática de uma lesão da neoíntima), incluindo os cálculos. As barras representam 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os resultados representativos de Pulmonar Hemodinâmica e Vascular Morfologia / morfometria. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o one-way ANOVA com correções de Bonferroni. Os valores são representados como a média ± SEM. con: controle; MF (monocrotalin + fluxo); RVF: falência do ventrículo direito; s: sistólica; d: diastólica; m: média; RVP: pressão do ventrículo direito; PAP: pulmonarpressão arterial Y; RAP: pressão atrial direita. RV: ventrículo direito; LV: ventrículo esquerdo; IVS: septo interventricular; BW: peso corporal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método descreve o procedimento cirúrgico de shunt aorto-cava em ratos pré-tratados com MCT para criar HAP induzida pelo fluxo e as técnicas para avaliar o princípio hemodinâmica e pontos finais histopatológicos que caracterizam HAP e este modelo.
Passos críticos dentro do Protocolo e solução de problemas
Cirurgia e pós-cirurgia. Durante a cirurgia de derivação aorto-cava, a etapa mais crítica é a dissecção da aorta e veia cava. As membranas que envolvem a aorta ea veia cava deve ser dissecado o suficiente para criar um) uma boa visibilidade da área da aorta, em que a agulha vai ser inserido, e da posição da agulha na veia cava após a inserção e 2) o espaço suficiente para prender a aorta acima do local de inserção. As mesmas membranas, no entanto, também são utilizados para realizar o sangue da aorta através do local de punção entre os dois vasos (Figura 1). Dissecando as membranas muito vaifazer com que o shunt a vazar. cola de tecidos pode resolver o vazamento, mas pode, em seguida, também infiltrar-se o shunt, comprometendo o seu tamanho. Quando a cola restringiu o fluxo através do shunt ou qualquer um dos vasos, a cola pode ser removido suavemente, mas de ruptura da veia cava ou das membranas que conduzem a derivação pode ocorrer. O tamanho ou a adequação da derivação pode ser estimado pela comparação da diferença de cor e o grau de turbulência do sangue na veia cava durante a compressão e descompressão da aorta proximal com um cotonete.
Uma agulha de 18-G foi mostrado para criar uma derivação adequada que resulte em uma forma consistente e reprodutível de progressão PAH em Lewis (neste artigo) e Wistar (ver referência 14) ratos e de sobrecarga de volume do ventrículo direito 15. Uma agulha de 18-G criou o shunt mais bem equilibrada, com um aumento significativo do fluxo pulmonar, de um lado e uma taxa de complicação pós-operatória baixo, por outro lado. O problema pós-cirúrgico mais comum é a perda de peso. A perda de peso até 10% em uma semana ocorre em todos os ratos após a cirurgia, presumivelmente devido à menor consumo nos primeiros dias após a cirurgia. Os ratos são sacrificados quando a perda de peso superior a 15% em 1 semana, já que este é considerado um sinal de mal-estar. Chow líquido pode melhorar a alimentação na primeira semana após a cirurgia. complicações pós-operatórias são raras posterior paralisia da perna e do intestino isquemia, o que também resultará em eutanásia. No total, menos de 5% dos ratos tiveram de ser sacrificados no pós-operatório.
Cateterismo. As etapas críticas durante o protocolo de cateterismo começar com o regulamento da anestesia. A profundidade da anestesia deve ser o mínimo possível (1,5-2% isoflurano neste protocolo), como um aumento na profundidade anestésica parece diminuir ventricular direita e as pressões arteriais pulmonares, especialmente em ratos com insuficiência ventricular direita. As medições têm uma tendência a become pouco fiáveis quando o protocolo excede 20 min de duração.
O próximo passo é crítico da manipulação do cateter no RV e na artéria pulmonar principal. Este pode ser um desafio. A lavagem do cateter pode ajudar a curva do cateter na via de saída quando a ponta está preso em trabéculas do VD. A manipulação em si pode causar discinesia RV, que mostra curvas de pressão irregulares no monitor de cabeceira. A introdução do cateter no ventrículo direito ea artéria pulmonar deve funcionar sem problemas. Quando a ponta fica preso na válvula pulmonar, a resistência é sentida. Pressionando por esta resistência pode causar a válvula pulmonar à ruptura, o que limita a confiabilidade das medidas subsequentes.
No presente protocolo, os ratos são sacrificados após o procedimento de cateterismo. Em teoria, no entanto, a veia jugular e ferida cirúrgica pode ser fechada depois de o cateter é puxado para fora, como animais podem viver com apenaso restante na veia jugular.
Morfometria. Na avaliação dos escores de espessura de parede e de oclusão vascular, o passo mais crítico é identificar as lâminas elásticas. A partir da experiência, a probabilidade de sucesso para este fim é o maior com uma Verhoeff ou Elastica-van Gieson coloração bem diferenciado. Enquanto o lúmen geralmente pode ser discernido facilmente a partir da íntima (para medir a área vascular interno), distinção da mídia da adventícia pode exigir um olhar mais atento (para medir a área vascular externo). Alguns íntima protocolos de medida e espessura medial separadamente, definindo a íntima como a camada entre o lúmen e da lâmina elástica interna, e os meios de comunicação como a camada entre a lâmina elástica interna e externa. Isso geralmente é possível em MCT em estágio inicial + FLUXO HAP. No entanto, arteríolas na doença avançada, particularmente lesões neointimais, pode exibir várias lâminas elásticas e muitas vezes perdem a integridade da lâmina elástica ( Vantagens e Limitações de adicionar o fluxo como um gatilho O uso de aumento do fluxo sanguíneo pulmonar para criar HAP em ratos tem várias vantagens, sendo a mais proeminente que é um (pato-) gatilho fisiológico conhecido para a doença, o que favorece a tradução para humano PAH-CHD (Eisenmenger fisiologia), mas também a outras formas de HAP 9. O modelo permite a regulação do fluxo fazendo variar o tamanho da agulha durante a criação da AC-shunt. em huhomem HAP-CHD, o fecho da derivação vai conduzir à inversão da HAP na fase precoce da doença, mas a progressão da HAP em fases avançadas da doença. Encerramento do shunt in vivo iria permitir que um para investigar o efeito da remoção do gatilho em diferentes pontos de tempo de progressão da doença e, assim, para investigar os mecanismos de inversão de HAP (não). Infelizmente, no momento, o fechamento shunt não é viável no modelo atual. Os efeitos de normalização hemodinâmica (por exemplo, a remoção do excesso de fluxo e a normalização da pressão da artéria pulmonar) em ratos com hipertensão arterial pulmonar associada ao fluxo pode ser investigada por transplantação do pulmão esquerdo afectado em um rato receptor com circulação normal. Foi demonstrado anteriormente que a normalização hemodinâmico, em ratos por transplante de pulmão humano e em HAP-CI através do encerramento de uma derivação cardíaca, leva à regressão da hipertrofia da média no início de-fase 21 HAP. Os efeitos da hemodinâmica normaiszação nos estágios avançados da experimental fluxo-PAH são presentemente desconhecidos. Significativas relativamente a modelos alternativos O modelo MCT-hit single. Uma injecção subcutânea de 60 mg / kg de MCT é uma maneira simples e eficaz para criar um modelo de hipertensão pulmonar em ratos. MCT induz lesão celular pulmonar arterial endotelial, seguido por hipertrofia da camada muscular das artérias pulmonares 5. Embora os mecanismos exactos permanecem pouco claros, os vários percursos e factores de crescimento foram identificados que participam na hipertrofia da média seguinte MCT. intervenção farmacêutica sobre esses caminhos muitas vezes reduziu com sucesso a hipertrofia medial e PAP no MCT-ratos. No entanto, uma vez que hipertrofia da média é conhecido por ter uma tendência natural para inverter em seres humanos e 3 também tem sido descrita para reverter espontaneamente em ratos MCT-16, o efeito desses tratamentosdevem ser avaliados de forma crítica. O modelo double-hit MCT + fluxo. A adição de sangue pulmonar aumento do fluxo de 7 dias após a injecção MCT criticamente altera o fenótipo (vascular) de uma forma dependente do tempo característico. No MF14 (7 dias após a indução do aumento do fluxo), os vasos normalmente não muscularização começar a desenvolver uma camada média muscular. No MF21, as medial aumenta de espessura e as primeiras lesões neointimais ocorrer. No MF28, uma camada de neo-íntima desenvolveu, na maioria dos navios. Entre MF28 e MF35, a maioria dos ratos desenvolver insuficiência cardíaca direita e morrer de sua sequelas. Estudos anteriores em ratos Fluxo + MCT têm mostrado que a adição de fluxo ao MCT conduz à activação de grupos específicos de genes. Em alguns grupos, o fluxo contrário os efeitos induzidos pelo MCT; em outros, o fluxo melhorado estes efeitos, e um aglomerado continha os genes que foram especificamente sobre-reguladas após o fluxo 17. Um desses genes específicos de fluxo é acrescimento precoce de resposta de um gene 14 (Egr-1). Inibição precoce de Egr-1 resultou na atenuação da hipertensão arterial pulmonar e a formação da neointima em ratos de fluxo 18 + MCT. Egr-1 também foi associada a remodelação neointimal na HAP humana (PAH-CHD e HAP idiopática) 19. Estas observações adicionar à evidência que o aumento ou perturbado o fluxo sanguíneo pulmonar é um gatilho essencial para a formação neointimal. O modelo single-hit só de fluxo. Em ratos com um shunt aorto-cava sem MCT-injecção, hipertensão pulmonar (PAP> 25 mmHg) desenvolve-se entre 10 e 20 semanas após a indução de derivação 20. Na semana 20, a histologia vascular pulmonar é dominado por hipertrofia da média das artérias pré-acinares e neo-muscularização das arteríolas intra-acinares. Embora algumas lesões neointimais também têm sido descritos neste modelo 20, o desenvolvimento destas lesões t precisa o ser confirmada e quantificada. O modelo Sugen-hipoxia. Outro modelo comum para HAP com lesões neointimais é o rato Sugen5416-hipoxia (SuHx). Sugen5416 blocos do receptor de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Isto induz danos nas células endoteliais e uma cascata de sinalização que, em combinação com hipóxia, evoca apoptose endotelial e a proliferação de 22. Após a injecção Sugen5416, o rato é colocado numa câmara hipóxica durante 4 semanas, em que a HAP se desenvolve. O rato é em seguida re-expostas a normoxia durante 4 semanas. Compostos farmacológicos que têm como alvo as cascatas de sinalização de TGF-B e BMP-resistência a apoptose endotelial ou têm mostrado o potencial para reverter as lesões neointimais neste modelo 23, 24, 25. Uma nova variante do modelo é o modelo SuHx Sugen-pneumectomia, o que também resulta na HAP grave, com lesão neointimal > 26. No entanto, este modelo não foi totalmente caracterizado ainda. Um novo método de genética para induzir hipertensão pulmonar em ratos envolve uma mutação no gene do receptor de BMP-2-, o que resulta em muscularização significativa (PH), mas não a formação da neointima (HAP) 27. Resultados comparáveis foram relatados relativamente ao número de lesões neointimais e o grau de oclusão luminal no estágio final de SuHx não tratada e MCT + ratos de fluxo 28. As principais diferenças entre os dois modelos são: 1) que o PAP no MCT + Fluxo aumenta progressivamente, enquanto que em SuHx, o PAP tem sido mostrado para diminuir gradualmente após re-exposição a normoxia 28; 2) que o modelo + Fluxo MCT sabe numa fase precoce da doença, caracterizada por hipertrofia medial e disfunção endotelial; 3) que o tempo necessário para atingir ambos os modelos de um estágio final em que a falha do ventrículo direito começa a desenvolver (4 semanas em MCT + fluxo de 8 semanas, em SuHx)ef "> 28 é diferente; e 4) que Sugen5416 interfere em um caminho molecular (VEGF), cujo papel na patogênese da HAP ainda é incerto Isso pode dificultar a tradução para o PAH humana.. Aplicações futuras ou Directions As fases de doenças distintas do modelo de fluxo MCT + permitem 1) para testar os mecanismos de progressão da doença (tecido humano, em geral, só está disponível a partir de post-mortem ou procedimentos de explante) e 2) para testar intervenções em diferentes estratégias. A estratégia preventiva poderia ser iniciado com a construção do shunt (MF7). Uma intervenção precoce pode ser iniciado com MF14. Isto pode ser relevante como uma estratégia de tratamento prévio para desviar fechamento em crianças com um shunt cardíaco congênito e HAP associada que progrediu para a zona cinzenta entre a doença reversível e irreversível. estratégias de reversão pode ser iniciado com MF21 ou MF28. Fases posteriores Ambos mostram lesões neointimais, uma manifestação de PAH em fase terminal. </ P> Em conclusão, a adição de aumento do fluxo pulmonar ao MCT em ratos cria um modelo de hipertensão arterial pulmonar progressiva e severa que imita o desenvolvimento da doença humana. cateterismo cardíaco direito e a avaliação qualitativa e quantitativa da histopatologia vascular formam os pilares da caracterização de doenças neste e em outros modelos para HAP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
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- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
