Introduction
この方法の目的は、ラットにおける重度、流れによって誘発される肺動脈高血圧症の再現可能なモデルを作成するために、その原理血行動態及び組織病理学的エンドポイントを測定することです。
肺動脈性肺高血圧症（PAH）、右心室不全や死に至る肺血管抵抗の漸進的増加を含む臨床症候群です。肺高血圧疾患（PH）の上位疾患スペクトラムの中で、PAHは治癒1せずに残っている最も深刻なフォームと1です。 PAHにおける基礎となる動脈症は、血管内腔を閉塞血管リモデリングの典型的な形が特徴です。通常の非muscularized血管のMuscularizationと内側容器層の肥大はPAHの初期疾患現象とみなされ、また、PH 2の他の形態で見られる、と3可逆的であると考えられています。 PAH Aとしてdvances、内膜層は、最終的に特徴的な新生内膜病変2を形成し 、改造を開始します。新生内膜型肺血管リモデリングは、PAHに排他的であり、現在4不可逆的であるとみなされています。
PAHは稀な疾患であるため、その病理生物学的理解の進歩と新しい治療法の開発は、動物モデルに大きく依存してきました。ラットにおけるmonocrotalin（MCT）モデルがされている単純な単一のヒットモデルであり、まだ、頻繁に使用されます。 MCTは、肺動脈と地域炎症5への損傷を引き起こす毒素です。 4週6から60ミリグラム/キロのMCTは、3後の平均肺動脈圧（MPAP）の増加、肺血管抵抗（PVR）、および右心室肥大（RVH）につながります。組織形態は、新生内膜病変5せずに孤立した内側の肥大によって特徴付けられます。 MCTそれは一般的に、後者のように示されるが、ラットモデルは、このように、適度なPHの形ではなく、PAHを表します。
先天性左から右へのシャント（PAH-CHD）に関連付けられているPAHの小児では、肺の血流が新生内膜病変7、8、9の開発に不可欠なトリガとしてみなされている増加しました。ラットでは、腹部大動脈及び大静脈、第1990 10に記載された技術との間のシャントを作成することによって誘導することができ、肺の血流を増加させました。増加した肺の流れを作成するための選択肢が一方的摘術により、または肺動脈吻合部11に鎖骨によるものです。これらのモデルの概念の欠点は、または起因する肺血管系の医原性損傷の肺切除によって誘発され、残りの肺および適応経路活性化の潜在的な代償成長から成り肺動脈吻合に、両方の増加した肺の血流の影響を混乱させる。
大動脈大静脈シャントが作成され、MCT投与ラットにおける第二のヒットとして誘発される肺の血流を増加させると、特徴的な新生内膜病変が発生し、増加した後にPAHの重症型と関連した右心室不全（RVF）は、3週間の開発します12を流れます。このモデルにおけるPAHの血行力学的進行は心エコー検査および右心カテーテル法によってインビボで評価することができます。血管の組織形態学、血管壁の厚さ、動脈閉塞の程度、および右心室不全のためのパラメータは、PAHのex vivo特徴付けの柱を形成します。
この方法は、大動脈大静脈シャント（AC-シャント）手術、右心カテーテル法、および血管組織形態の定性的および定量的評価のための詳細なプロトコルを記述しています。
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Protocol
動物を対象とする手順は、動物実験のためにオランダ中央委員会と大学医療センターフローニンゲンでの動物保護委員会（NL）によって承認されています。 180〜300 gの量の両方のWistar及びルイスラットを使用しました。
1.住宅と順化
- ケージ当たり5のグループ内の中央動物施設、家のラットに到着した後。 7日間の順応期間中は、人間の取り扱いにラットを慣らすが、任意の実験手順を実行しないでください。
無菌Monocrotalinの調製および注射
- 60 mg / mlでmonocrotalin（MCT）溶液1mLに対して、2 mLのチューブにmonocrotalin 60mgの重量を量ります。 0.9％のNaCl 700μLを追加します。 1 M HClを200μLを追加します。ホットランニング水道水とボルテックスその下のチューブ内の溶液を温めます。 7.0に向けてpHを6 NのNaOHを使用してください。げっ歯類への注入のためのMCTの調製のための滅菌技術を使用してください。 首のキロ皮下あたり滅菌60ミリグラム/ mLのMCT溶液（300グラムのラットでは60 mg / mlでMCTの0.3 mL）を1mLのを注入します。注：私たちは、注入量が適切でないことを大きなチャンスによる小さいボリュームを使用しません。
3.大動脈 - 大静脈シャント手術
- 麻酔。
- 5％イソフルラン/ 100％O 2（流量：1リットル/分）での誘導チャンバーを記入し、チャンバー内にラットを置きます。後肢足指のピンチを実行することによって、麻酔の適切な深さを確認してください。ラットを計量。
- 約8センチ3センチ幅である領域の上腹部を剃るし、清掃してください。滅菌マットで覆われたヒートマット（37°C）にその背中にラットを置きます。
- 3％イソフルラン/ 100％O 2（：1 L /分の流れ） - 2で換気マスク/フードで鼻を置きます。後肢足指のピンチを実行することによって、麻酔の深さを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
- シャントスールGeryの。
- 消毒のための塩素-hexidineで皮膚をスクラブ。キロブプレノルフィン皮下術後鎮痛のための0.01 mgの/注入します。
- 手術のために滅菌器具を使用してください。ちょうど性器上記にまで延びているダイヤフラムの下に1cmで出発、正中線上腹部の＃10手術用メスの刃で切開を行います。
- 滅菌、濡れたガーゼ（0.9％のNaCl）で腸をカバーし、綿棒で腸を持ち上げ、および動物の左側に配置します。
- 腹部大動脈と周囲の組織に下大静脈を取り付ける膜を分離するために綿棒を使用してください。
注：大動脈と大静脈の間の膜を分析しないでください。 - トゲ鉗子を使用して、唯一の大動脈の右側にだけ針が挿入されるサイト上で、ちょうど分岐の上に血管周囲の大動脈脂肪を取り除きます。
- 2ミリメートルのsupeから大動脈と大静脈を分離するために綿棒を使用してください針がBiemerクランプのためのスペースを作成するために挿入されるサイトにrior。
- このエリアでは、最初の大動脈の周りの緩い結紮糸（5-0縫合糸）を配置。切開（ 図1A）にコッヘルが優れ置き、それにコッヘルクランプを配置することによって、合字の張力を作成し、。 Biemerは合字（Figur電子の1A）にだけ優れたクランプ置きます。
- 綿棒を使用して、フロー（ 図1A）を妨害するよう遠位にできるだけ大静脈を圧縮します。外側（ 図1A）の方を向いてオリフィスを有するベンド45度の角度に針（このプロトコルで18 G）、。
- 90度の角度で、左（ 図1A）に針ポインティングのオリフィスと、ちょうど分岐の上、大動脈内に針を挿入します。左に針の先端を操作し、大静脈に挿入します。
注：針の先端は現在VISIでなければなりません大静脈（ 図1B）にBLE。 - 血栓症を防ぐために、挿入部位のうち、大動脈内の残りの血液をプッシュするために第2綿棒を使用してください。接着剤が十分に固執するようにするために、滅菌ガーゼでシャントの周りの領域を乾燥させます。
- 大動脈のうち、全体の針を引き、直ちに大動脈における穿刺部位に組織接着剤のドロップを適用します。組織に綿棒を接着しないように注意してください。大動脈のクランプを解除。
- 上の引っ張り、シャントを大動脈近位に結紮糸を解放することによって、手動でシャントを確認します。ゆるみは明るい赤にシャントに大静脈遠位を着色し、シャントサイトで乱流を作成する必要があります。
注：締め付けが戻って暗赤色の大静脈に血液を向けるだろう。 - バック動物で腸を置きます。再吸収可能な4-0縫合糸で筋層と皮膚を閉じます。麻酔から回復するために、100％O 2で動物を換気します。
注：ANIのままにしないでくださいそれは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人MAL。
- シャム手術。
- 大動脈への針の挿入を除いて、上記の手順のすべてを実行します。
- 手術後のケア。
- 単一のケージにし、翌朝まで37℃のインキュベーターにラットを置きます。
- 手術後6時間の周囲には、術後の鎮痛のためにブプレノルフィン皮下/キログラム0.01ミリグラムを注入。ラットが不快感の兆候を示している場合は、次の朝を繰り返します。
注：最初の3日間の手術後、ラットは、食べて、（固形飼料または飲料水を薬剤と混合した場合、これは特に重要です）あまり飲む傾向にあります。ほとんどのラットは3日、手術後に正常な挙動を示します。ない場合は、密接に監視します。 1週間で15％を超える体重減少が、異常とみなされ、かつ麻酔下にある間、そのようなラットは、循環血液量の抽出により安楽死されるべきです。
注：このプロトコルでは、動物は麻酔下ながら、循環血液量の抽出によって安楽死させます。
- 増加肺血流への早期の細胞および機能的応答（ 例えば、遺伝子のアップレギュレーションまたは初期転写因子）のための手術（MF8）の後に1日を生け贄に捧げます。
- 早期のPAH血管表現型（新生内膜病変のない内側肥大）のための手術（MF14）後1週間を生け贄に捧げます。
- RVPとMPAPにおける軽度の標高と進行期PAH血管表現型（マークされた内側肥大および新生内膜形成）のための手術（MF21）後2週間生け贄に捧げます。
- 末期PAH血管表現型（マークされた新生内膜閉塞）とRVPとMPAPに強い標高のための手術（MF28）後3週間生け贄に捧げます。右心室不全の臨床徴候は、この段階では一般的です。
- 28日目の後にサクリファイス（MF-RVF）、臨床的呼吸困難、重度の無気力、および体重減少（<1週間で10％）として定義されるPAH関連右心室不全（RVF）のために。これらの兆候の一つが存在する場合、ラットを終了します。頻繁に、ラットは日28と35との間にこれらの症状を発症、無防備放置すれば、この時間間隔の間に自然に死にます。
5.右心カテーテル法
- 麻酔。
- 5％イソフルラン/ 100％O 2（流量：1リットル/分）での誘導チャンバーを記入し、ボックス内にラットを配置します。後肢足指のピンチを実行することによって、麻酔の適切な深さを確認してください。ラットを計量。
- 心エコー検査プロトコル、胸部と腹部のために、ひげをそるとラットの右腹側に首をきれいに。
- ヒートマット（37°C）にその背中にラットを置き、2と換気マスク/フードに鼻を置く- 3％イソフルラン/ 100％O 2（流量：1リットル/分）。鼻は、研究者の方に直面しなければなりません。
- 心エコー検査プロトコル。
- ブリテンらによって記載されたプロトコルに従って、心エコー検査を行います。 Joveの13インチ
- カテーテルプロトコル。
注：このプロトコルは、予め形成されたチップで剛性のカニューレを使用して先端からボール2ミリメートルと15センチのシリコンカテーテルを案内するために20度曲げます。内側に少し曲げ、そのオリフィスを有する20-G 針が右頸静脈にカニューレを挿入するために使用されている（材料のリストを参照してください）。 PAHの進行及び制御のいずれかの相のラットは、このプロトコルで使用することができます。- 塩化hexidineで首を消毒します。右腹側で＃10手術用メスの刃を用いて1.5 cmの切開を行います首の、右鎖骨から下顎の骨に。
- ハサミを用いて組織を広げます。頸静脈が表示されるまで、ピンセットを使用して、静かに離れて組織を引っ張ります。破片の鉗子を使用して、頸静脈の周りに膜を解剖。
- 容器の周りに緩い結紮糸（5-0縫合糸）を配置することにより、頸静脈に緊張を置きます。緊張を高め、換気マスク（ 図 2A）に合字をテープで固定します。
- 挿入部位の下流に、カニューレは、漏れや圧力の損失を防止するために、 その場にある後締め容器の周囲に緩い結紮を置きます。
- 鉗子のハンドルを使用して、わずかにカテーテルを用いてカニューレを行うために内部にオリフィスを有する20-G針の先端を曲げます。
- 静脈に20-G針の先端を導入し、迅速に容器内にカテーテルを含むカニューレを配置します。針を引き抜き、その後、合字を閉じますそれはステップ5.3.4で調製しました。
- 頸静脈にカテーテルを含むカニューレを実施します。カニューレの先端が20度曲線である（ステップ5.3.5を参照してください）。鎖骨下カニューレを操縦し、右心房（ 図2C）を入力する少しを進めます。
- 右心室を入力するには、心臓（ 図2D）に向かって、左にカニューレの先端を指します。ベッドサイドモニタでは、RVの圧力曲線は、 図2Dに一致する 、表示されます。
- RVの圧力曲線が一定の場合、収縮期および拡張期の右心室圧1を書き留め（sRVP1 / dRVP1）。
- 左と上方向へのカニューレの先端を操作します。カニューレ（ 図2E）内にカテーテルを進めます。
- 主肺動脈（PA）へのカテーテルを進めます。肺動脈弁を通過するときに抵抗が感じされるべきではありません。
注：カテーテルは、主肺動脈、Dに入り、iastolicの圧力が上昇します。ベッドサイドモニタでは、PAの圧力曲線は、 図2Eに一致する 、表示されます。 - PAの圧力曲線が一定の場合、収縮期、拡張期を書き留め、およびPA圧1（sPAP1、dPAP1、mPAP1）を意味します。
- カテーテルの先端にボールが肺動脈にくさび止めされるまでさらにカニューレ内にカテーテルを進めます。ベッドサイドモニタの低下への圧力曲線を観察し、 図2Fにおけるウェッジ圧力曲線と一致しています。
- ウェッジ圧力曲線が一定の場合、収縮期、拡張期を書き留め、およびウェッジ圧力を意味します。
- ゆっくりとカテーテルを引いて、その後、ベッドサイドモニタに表示されているように、sPAP2、dPAP2、mPAP2、sRVP2、およびdRVP2の値を測定し、書き留めます。
- RVで、わずかに測定するために、カニューレとカテーテルを引き戻すときに右心房圧（RAP）を意味します。曲線は、図2AのRAP曲線と一致する必要があります。
NOTE：このプロトコルでは、ラットを麻酔下にある間循環血液量の抽出によりカテーテルプロトコルの後に安楽死させます。
6.形態評価および形態計測
注：このプロトコルでは、動物は麻酔下ながら、循環血液量の抽出によって安楽死させます。 PAHの進行及び制御のいずれかの相のラットは、このプロトコルで使用することができます。
- 屠殺後、約5mm気管支分岐部と心臓に肺を接続する船の上に気管を切断することによって肺を取り出します。冷生理食塩水で肺を置きます。左肺を解剖。分岐部に左主気管支をカットします。
- 、4％パラホルムアルデヒドで50-mLシリンジを埋めるシリンジにカニューレでチューブを取り付け、作業テーブルの上メートル程度の注射器を掛けます。受動的にパラホルムアルデヒドで肺を埋めるために左主気管支にカニューレを取り付けます。注意してパラホルムアルデヒドを扱います。
- 48時間パラホルムアルデヒドで左肺をインキュベートします。
- （70％エタノール（1時間）、80％エタノール（1時間）、90％エタノール（1時間）、100％エタノール（3 H）、キシロール（2時間）、そしてパラフィン中に連続的にインキュベートすることによって、左肺を脱水2時間）。
- カセットが直面している肺門と、パラフィンに左肺を埋め込みます。
- 製造業者の使用説明書29に従って、Verhoeffまたはエラス・ファン・ギーソン染色を用いてパラフィン包埋し、4μmの肺切片を染色します。弾性板はよく（ 図3のように）区別されていることを確認します。 40Xの倍率で染色した切片をスキャンします。
- 4象限に肺を分割します。各象限では、外径<50ミクロン（イントラ腺房）と外径10隻> 50ミクロン（プレ腺房）で10隻を発見。画像（肺あたり2×40画像）を取ります。ランダムに20倍の倍率と写真まであらゆる容器内のズームこの視野で選択バイアスを最小化します。
- > 2の最長/最短径の比、不完全な円形、または血管壁の4分の1以上の崩壊を持っている血管を除外します。
注：除外容器の例は、同じ倍率（40X）上の各画像を作成し、スケールバーを含む図3bに示されています。 - ImageJのと最初の画像を開きます。 「Analyseを 」を介してスケールを設定するためには画像中のスケールバー上の直線を描きます そして、「スケールを設定します 。」 「 既知の距離 、「画像のスケールバー上の値を使用します。長さの単位としてマイクロメートル（μm）を使用します。グローバルにスケールを設定します。
- 「 フリーハンド選択を 、「使用方法 管腔面積（ 図3）の内側の境界に線を引きます、 そして、「測定」を使用 （CRTL m）は、この領域を測定します。そして、外側ELASTの周りに線を引きます総血管面積を測定するICラミナ（ 図3）。
- （管腔と外径を計算します
）を使用して、 
。 - 使用した壁の厚さを計算します
。 - 使用した壁/ルーメン比を計算します
。 - 使用して閉塞スコアを計算します
。 - muscularizationに容器をスコア（なし、部分的、または合計muscularization）（ 図3B）。
注：半分以上の円周のための二重の弾性板との船舶が完全にmuscularizedとして定義されています。半周未満の二重弾性板と血管が部分的にmuscularizedとして定義されています。 - neoiの存在に容器のスコアntima（yesまたはno）（ 図3C）。
注：（多くの場合、偏心）管腔閉塞と組み合わせ明確に定義された内弾性板のない船舶は、新生内膜病変として定義されています。
）を使用して、 
。 
。 
。 
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Representative Results
代表的な結果を図4に示されています。コントロール（N = 3）、MF8（N = 5）、MF14（N = 5）、MF28（N = 5）、およびMF-RVF（：示された結果は、以下の群内のLewisラットにおけるMCT + FLOWの特性を示しますN = 10）。統計分析は、ボンフェローニ補正を用いて、一方向ANOVAを用いて行きました。
60ミリグラム/キログラムMCTおよび54.0±10 mmHgのに、収縮期右心室圧（sRVP）（23±6 56±11 mmHgの）の平均上昇に収縮期肺動脈圧（SPAP）（20±4を肺血流とリードを広げました）、および28日（MF28）で肺動脈圧（MPAP）（16±3±4〜36 mmHgの）を意味します。彼らは右心室不全が発達段階（MF-RVF）（ 図4）まで均等に高いまま。初期のPAH段階（MF8およびMF14）では、sRVP、SPAP、およびMPAPには上昇が観察されません。拡張期PAPと右A後期でのトライアル圧力上昇ではなく、かなり。ウェッジ圧力は、疾患の進行中に著しく変化しません。
右心室から左心室と右心室肥大を示すMF-RVFにMF14から大幅に中隔重量比が増加、。肝臓の湿潤対乾燥重量比は、肝臓の浮腫およびうっ血性右心室不全を示し、MF-RVF段階で著しく増大します。
イントラ腺房血管のMuscularization <PAHの進行中に漸進的に50μmの増加。このサイズの船は、通常、コントロールラットにおける筋肉中間層を有していません。 MF14では、これらの血管（43±17％）のほぼ半分は、（ 図3Bのように）総筋肉のメディアを持っています。 MF28とMF-RVFでは、ほぼすべての細動脈は（98.7±2.5％および100±0％）をmuscularizedされます。新生内膜病変が最初に発生しますMF21で、MF28とMF-RVFにしながら、すべての細動脈の約65％が（ 図3Cのように）新生内膜層を持っています。動脈壁ツールーメン比と閉塞スコアの両方それぞれMF28（へMF14から大幅に増加し、10.4±3.9 71.5±30（詐欺へ：7.1±0.2）および20.0±2.8 54.7±10.6（詐欺へ：12.2±0.3） ）。 WistarラットにおけるMCT + FLOWでのPAHの進行の血行動態及び組織形態学的特性は14似ています。
図1.大動脈大静脈シャント手術の概略図。 A）大動脈の張力と挿入部位よりも優れてクランプされます。大静脈は、挿入部位に劣って圧縮されます。 45°折り曲げられて外部に開口部を有する針は、90°の角度で大動脈内に挿入されます。 B） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.右心カテーテル法の手順と代表圧力曲線。 A）右頸静脈を結紮糸で引っ張られ、換気マスク上にテープで固定されています。カテーテルを頸静脈に配置されます。 B）右心室圧力波を表示するベッドサイドモニタ。 C）の右頸静脈に導入した後、右心房に配置されたカニューレ内のカテーテル。下：典型的な右心房圧力波。 D）右心室に配置されたカニューレ内のカテーテル。下：典型的な右ventricul末期PAH中のAr圧力波。 E）カテーテルは、主肺動脈を入力するようにカニューレに進んでいます。下：典型的な肺動脈圧の波。ウェッジ圧力波がモニタに表示されるまで、F）カテーテルは、肺動脈内に前進されます。下：典型的な肺動脈楔入圧波。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
制御およびPAHラットにおける図3.血管形態と形態計測。 A）3.7％の閉塞スコアと通常の、非muscularized容器。 B）24.3％の閉塞スコアと完全muscularized細動脈。 C）。 54.1パーセントの閉塞スコアと新生内膜病変。 D） E）計算を含む新生内膜病変の略図で容器内の全血管および管腔面積の測定（）、。バーは50μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
肺血行動態および血管形態/地形計測の図4.代表的な結果。統計分析は、ボンフェローニ補正を用いて、一方向ANOVAを用いて行きました。値は平均±SEMとして表されます。詐欺：コントロール; MF（monocrotalin +の流れ）。 RVF：右心室不全。 S：収縮期; D：拡張期;メートル：平均; RVP：右心室の圧力; PAP：pulmonaryの動脈圧; RAP：右心房圧。 RV：右心室。 LV：左心室。 IVS：心室中隔。 BW：体重。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、流れ誘発性PAHおよびPAHと、このモデルを特徴付ける原則血行動態及び組織病理学的エンドポイントを評価するためのテクニックを作成するために、MCTで前処置したラットにおける大動脈大静脈シャントの外科的手順を説明します。
プロトコルおよびトラブルシューティングの中で重要なステップ
手術と術後。大動脈大静脈シャント手術中、最も重要なステップは、大動脈と大静脈の解剖です。大動脈と大静脈が十分に解剖されるべきで囲む膜は、針が挿入され、大動脈領域の1）良好な視認性を作成すること、および挿入後大静脈内の針の位置と、2）十分なスペースへの挿入部位上記の大動脈をクランプします。同膜は、しかしながら、両方の容器の間で穿刺部位（ 図1）を介して大動脈に血液を実施するために使用されます。あまりにも多くの膜をします解剖シャントが漏れを引き起こします。組織接着剤は、漏出を解決するかもしれないが、それは、その後もその大きさを損なう、シャントに浸透することができます。接着剤は、シャントや血管のいずれかを通る流れを制限しているときに、接着剤を静かに除去することができますが、大静脈のまたはシャントを行い、膜の破裂が発生することがあります。シャントの大きさまたは妥当性は、色差と綿棒で近位大動脈の圧縮および伸張時大静脈内の血液の乱流の程度を比較することによって推定することができます。
18-G針は、ラット（14を参照参照）、右心室の容量負荷15のルイス（この記事）とWistar系におけるPAHの進行の一貫性と再現性のある形で、その結果、十分なシャントを作成することが示されています。 18-G針は、一方では有意に増加した肺の流れ、他方では、低術後合併症率で、最もバランスのとれたシャントを作成しました。 最も一般的な手術後の問題は、体重減少です。 1週間で10％までの重量損失は、おそらく低い摂取に起因する最初の数日間手術後、手術後全てのラットで発生します。重量損失は1週間で15％を超える場合、これは体調不良であることの徴候であると考えられているようにラットを安楽死させます。液体飼料は、手術後の最初の週に送り込む向上させることができます。レア術後合併症も安楽死につながる後肢の麻痺や腸の虚血、です。合計では、ラットの5％未満が術後安楽死させなければなりませんでした。
カテーテル。カテーテル検査プロトコル中の重要なステップは、麻酔のレギュレーションで始まります。麻酔深度の増加は、特に右心室不全ラットに、右心室と肺動脈圧を減少させるために表示される、 - （このプロトコルは2％イソフルラン1.5）麻酔の深さは、可能な限り最小限にする必要があります。測定はベーコンする傾向があり、プロトコルは、期間中に20分を超える電子信頼できません。
次の重要なステップは、RVおよび主肺動脈カテーテルの操作です。これは挑戦することができます。先端がRVの小柱でスタックしているときにカテーテルをフラッシュすると、流出路の曲線にカテーテルを助けることができます。操作自体は、ベッドサイドモニタに不規則な圧力曲線を示しているRVの運動障害を引き起こす可能性があります。右心室と肺動脈へのカテーテルの導入はスムーズに実行する必要があります。先端が肺動脈弁で立ち往生すると、抵抗が感じられます。この抵抗を介して押すと、次の測定の信頼性を制限する、肺動脈弁が破裂する恐れがあります。
現在のプロトコルでは、ラットは、カテーテル処置後に屠殺されています。カテーテルが引き抜かれた後に理論的には、しかし、頸静脈及び手術創は一緒に暮らすことができる動物として、閉鎖することができます残りの左頸静脈。
形態計測。血管壁の厚さと閉塞スコアの評価において、最も重要なステップは、弾性板を同定することです。経験から、この目的のために成功の可能性は十分に分化Verhoeffまたはエラス・ファン・ギーソン染色で最大です。内腔が通常（内部血管領域を測定する）内膜から容易に識別することができますが、外膜からのメディアの区別は（外部血管の面積を測定する）を詳しく見て必要な場合があります。別にいくつかのプロトコルのメジャー内膜および内側の厚さ、内部と外弾性板との間の層としての内腔と内弾性板、メディア間の層としての内膜を定義します。これは、初期段階のMCT + FLOW PAHに通常可能です。しかし、進行した疾患における動脈、特に新生内膜病変は、（複数の弾性板を表示し、多くの場合、弾性板の完全性を失う可能性があります トリガーとしてフローの追加の利点と制限事項 ラットにおいてPAHを作成するために増加した肺の血流の使用は、いくつかの利点、それはヒトPAH-CHD（アイゼンメンゲル生理学）への変換に有利疾患の既知の（病態）生理学的トリガーであることが最も顕著でなく、を有しますPAH 9の他の形態です。モデルは、AC-シャントを作成する際に、針の大きさを変化させることによって流れの調節を可能にします。 HUで男PAH-CHDは、シャントの閉鎖は、疾患の初期段階でのPAHの逆転につながるが、進行した疾患段階におけるPAHの進行になります。 インビボでのシャントの閉塞は、一つの疾患進行の異なる時点でトリガーの除去の効果を調査するために、したがって、PAHの（非）反転のメカニズムを調査することを可能にします。残念ながら、現時点では、シャント閉鎖は、現在のモデルでは現実的ではありません。フロー関連のPAHラットにおける血行動態の正規化（ 例えば、過剰な流れと肺動脈圧の正常化の除去）の効果は、通常の循環とレシピエントラットに影響を受けた左肺の移植によって調べることができます。肺移植によると、心臓シャントの閉塞によるヒトPAH-CHDのラットにおける血行動態正規化は、初期段階のPAH 21における内側肥大の退縮をもたらすことが以前に示されています。通常の血行動態の影響実験的な流れ-PAHの進行した段階で化は現在不明です。 代替モデルへの尊重と意義 シングルヒットMCTモデル。 60ミリグラム/キロのMCTの皮下注射は、ラットにおける肺高血圧症のためのモデルを作成するためのシンプルで効果的な方法です。 MCTは、肺動脈5の筋層の肥大に続く肺動脈内皮細胞傷害を誘発します。正確なメカニズムは不明であるが、様々な経路および成長因子は、MCT、次の内側の肥大に関与することが確認されています。これらの経路に応じて薬剤介入は、多くの場合、正常にMCT-ラットで内側肥大およびMPAPを削減しました。しかし、内側肥大ので、ヒト3に逆転する自然な傾向を有することが知られており、また、MCTラット16に自然にこれらの治療の効果を逆転することが記載されています批判的に評価されるべきです。 ダブルヒットMCT + FLOWモデル。 7日MCT注入後増加肺血流の添加が決定的に特徴的な時間依存的に（血管）の表現型を変化させます。 （7日増加した流れの誘導後）MF14では、通常は非muscularized血管は筋肉中間層を開発するために開始します。 MF21では、内側の厚さが増加し、最初の新生内膜病変が発生します。 MF28では、新生内膜層は血管の大部分で開発しました。 MF28とMF35の間、ほとんどのラットは、右心不全を発症し、その後遺症で死亡します。 MCT +流ラットにおける以前の研究は、MCTの流れの添加は、遺伝子の特定のクラスターの活性化をもたらすことが示されています。いくつかのクラスタでは、流れはMCTによって誘導される効果に反対しました。他に、流れはこれらの効果を高め、1クラスタは、流れ17の後に特異的にアップレギュレートされた遺伝子を含んでいました。これらのフロー特異的遺伝子の一つであります初期成長応答-1遺伝子14（EGR-1）。 Egr-1の初期の阻害は、MCT +フローラット18におけるPAHの減衰と新生内膜形成をもたらしました。 EGR-1は、ヒトPAH（PAH-CHDおよび特発性PAH）19における新生内膜のリモデリングと関連していました。これらの観察は、増加または肺の血流が、新生内膜形成のために必須のトリガである乱れ証拠に加えます。 シングルヒットフロー専用モデル。 MCT-注入なしの大動脈大静脈シャントとラットでは、肺高血圧症（> 25 mmHgのMPAP）は10〜20週間シャント誘導20の後に発症します。 20週の時点で、肺血管組織学は、プレ腺房動脈の内側肥大およびイントラ腺房細動脈のネオmuscularizationによって支配されています。いくつかの新生内膜病変は、このモデル20に記載されているが、これらの病変の発症は、Tを必要と O確認し、定量すること。 SUGEN-低酸素モデル。新生内膜病変を有するPAHのための別の一般的なモデルはSugen5416-低酸素（SuHx）ラットです。 Sugen5416ブロック血管内皮増殖因子（VEGF）受容体。これは、内皮細胞の損傷および低酸素症と組み合わせて、内皮アポトーシスおよび増殖22を連想させる、シグナル伝達カスケードを誘発します。 Sugen5416注射後、ラットは、PAHが発達する際に、4週間の低酸素チャンバ内に配置されています。ラットは、その後4週間酸素正常状態に再曝露されます。内皮アポトーシス耐性またはTGF-BおよびBMPのシグナル伝達カスケードを標的とする薬理学的化合物は、このモデル23、24、25に新生内膜病変を逆転させる可能性を示しています。 SuHxモデルの新しい亜種はまた、新生内膜病変と重症のPAHになるSUGEN-肺切除モデルであります > 26。しかしながら、このモデルは、まだ完全には特徴付けられていません。ラットでPHを誘導する新規な遺伝方法は重要muscularization（PH）はない、新生内膜形成（PAH）27をもたらすBMP受容体2遺伝子の突然変異を含みます。 同等の結果は、新生内膜病変の数および未処理SuHxとMCT +フローラット28の最終段階での管腔閉塞の程度に関して報告されています。両モデルの主な違いは1です）SuHxで、MPAPは、酸素正常状態28への再曝露後に徐々に減少することが示されているのに対し、MCT +フローにおけるMPAPは次第に、増大させること; 2）MCT +フローモデルは内側の肥大および内皮機能不全を特徴とする、疾患の早期段階を知っていること。 3）時間は、それは右心室不全が発症し始め末期（MCT +フローで4週間、SuHxで8週間）に到達するために、両方のモデルを取ることEF "> 28が異なっている、4）Sugen5416は、その役割は、PAHの病因でまだ不明である分子経路（VEGF）に干渉すること。これは、人間のPAHへの翻訳を妨げることがあります。。 将来のアプリケーションや行き方 MCT +フローモデルの明確な疾患の相が1 1）は、疾患の進行のメカニズムをテストすることができ（ヒト組織は、一般的に、死後または外植片の手順）と異なる戦略における2）テストするための介入からのみ利用可能です。予防戦略は、シャント（MF7）の構築を開始することができました。早期介入は、MF14で開始することができます。これは、可逆的かつ不可逆的な疾患との間のグレーゾーンに進行した先天性心臓シャントと関連するPAHの小児に閉鎖をシャントする前に治療戦略として関連している可能性があります。リバーサル戦略はMF21またはMF28で開始することができます。後期の両方が、末期PAHの症状を新生内膜病変を示しています。</ P> 結論として、ラットでのMCTに増加した肺の流れの添加は、ヒト疾患の開発を模倣プログレッシブ、重度PAHのモデルを作成します。右心カテーテル検査と血管組織病理学の定性的および定量的評価このにおける疾患の特徴付けの基礎とPAHのための他のモデルを形成します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
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