Introduction
Le but de cette méthode est de créer un modèle reproductible sévère, l'hypertension artérielle pulmonaire induite par l'écoulement chez le rat et de mesurer son principe hémodynamique et le point final histopathologiques.
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est un syndrome clinique qui englobe une augmentation progressive de la résistance vasculaire pulmonaire conduisant à une insuffisance ventriculaire droite et la mort. Dans le spectre de la maladie superordinate des maladies hypertensives pulmonaires (PH), les HAP est la forme la plus grave et qui reste sans traitement 1. L'artériopathie sous-jacente dans l'HTAP se caractérise par une forme typique de remodelage vasculaire qui obstrue la lumière du vaisseau. Muscularisation des navires et l' hypertrophie de la couche de vaisseau médial non muscularized normales sont considérés comme des phénomènes précoces de la maladie dans les HAP, sont également observées dans d' autres formes de PH 2, et sont pensés pour être réversibles 3. Comme les HAP unees progrès, la couche intimale commence à remodeler, pour finalement former des lésions néointima caractéristiques 2. De type néo - intimale vasculaire pulmonaire remodelage est exclusive aux HAP et est actuellement considérée comme irréversible 4.
Comme les HAP est une maladie rare, les progrès dans sa compréhension pathobiologique et le développement de nouvelles thérapies se sont fortement appuyés sur des modèles animaux. Le monocrotalin (MCT) modèle chez le rat est un modèle simple à succès unique qui a été, et est toujours, utilisé fréquemment. MCT est une toxine qui provoque des lésions aux artérioles pulmonaires et une inflammation régionale 5. 60 mg / kg MCT conduit à une augmentation de la pression moyenne de l' artère pulmonaire (PAPm), la résistance vasculaire pulmonaire (PVR), et l' hypertrophie ventriculaire droite (HRV) après 3 - 4 semaines 6. Le histomorphologie se caractérise par une hypertrophie isolée médiane sans lésions néointima 5. Le MCTmodèle de rat représente donc une forme modérée de PH, et non les HAP, mais il est communément présenté comme celui-ci.
Chez les enfants atteints d'HTAP associée à un shunt congénitale de gauche à droite (PAH-CHD), augmentation du débit sanguin pulmonaire est considéré comme le déclencheur essentiel pour le développement des lésions néointima 7, 8, 9. Chez le rat, une augmentation du débit sanguin pulmonaire peut être induite par la mise en place d'un shunt entre l'aorte abdominale et la veine cave, une première technique décrite en 1990 10. Alternatives pour créer un flux pulmonaire accrue sont par pneumonectomie unilatérale ou par clavière anastomose de l' artère pulmonaire 11. inconvénients conceptuels de ces modèles se composent de croissance compensatoire potentiel du poumon restant et activation de la voie adaptative induite par la pneumonectomie ou de blessure iatrogène de la vascularisation pulmonaire dueanastomose de l'artère pulmonaire, à la fois confondant les effets de l'augmentation du débit sanguin pulmonaire.
Quand un shunt aorto-caval est créé et une augmentation du flux sanguin pulmonaire est induite en tant que deuxième succès chez les rats MCT-traités, des lésions néointima caractéristiques se produisent, et une forme sévère de l'HTAP et insuffisance ventriculaire droite associée (RVF) développent 3 semaines après l'augmentation débit 12. La progression hémodynamique des HAP dans ce modèle peut être évaluée in vivo par échocardiographie et cathétérisme cardiaque droit. Le histomorphologie vasculaire, l' épaisseur de la paroi de la cuve, le degré d'artérioles occlusion, et les paramètres de l' insuffisance ventriculaire droite forment les piliers de l'ex vivo caractérisation des HAP.
Cette méthode décrit des protocoles détaillés pour la chirurgie aorto-caval shunt (AC-shunt), cathétérisme cardiaque droit, et l'évaluation qualitative et quantitative des histomorphologie vasculaire.
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Protocol
Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité central néerlandais pour l'expérimentation animale et le soin des animaux Comité à l'Université Medical Center Groningen (NL). Les deux rats Wistar Lewis et ayant un grammage compris entre 180 et 300 g ont été utilisés.
1. Logement et Acclimatation
- Après l'arrivée à l'animalerie centrale, les rats des maisons en groupes de 5 par cage. Au cours d'une période d'acclimatation de 7 jours, accoutumer les rats à la manipulation humaine, mais ne pas effectuer toutes les procédures expérimentales.
2. Préparation et injection de stérile Monocrotalin
- Pour 1 ml de 60 mg / ml monocrotalin (TCM) en solution, peser 60 mg d'monocrotalin dans un tube de 2 ml. Ajouter 700 ul de NaCl à 0,9%. Ajouter 200 ul de 1 M HCl. Réchauffer la solution dans le tube sous l'eau courante chaude du robinet et le vortex il. Utiliser NaOH 6 N pour amener le pH vers 7,0. Utiliser une technique stérile pour la préparation du MCT pour l'injection dans les rongeurs. Injecter 1 mL de 60 mg de solution stérile / ml de TCM par kg par voie sous cutanée dans le cou (0,3 ml de 60 mg / ml de MCT pour 300 g de rat). NOTE: Nous préférons ne pas utiliser de plus petits volumes en raison de la plus grande chance que la dose injectée ne sera pas appropriée.
Chirurgie Shunt 3. Aorte-caval
- Anesthésie.
- Remplir la chambre d'induction avec 5% d' isoflurane / 100% O 2 (débit: 1 L / min) et placer le rat dans la chambre. Vérifiez la profondeur adéquate de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil arrière. Peser le rat.
- Rasage et nettoyer l'abdomen sur une zone qui est d'environ 8 cm de long et 3 cm de large. Placez le rat sur le dos sur un tapis de chaleur (37 ° C) couverte par un tapis stérile.
- Placez le museau dans une ventilation masque / hotte avec 2 - 3% d' isoflurane / 100% O 2 (débit: 1 L / min). Vérifiez la profondeur de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil arrière. Appliquer une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Shunt Surgery.
- Frotter la peau avec du chlorure-hexidine pour la désinfection. Injecter 0,01 mg / kg par voie sous cutanée buprénorphine pour l'analgésie post-opératoire.
- Utiliser des instruments stériles pour la chirurgie. Faire une incision avec une lame de scalpel # 10 dans l'abdomen sur la ligne médiane, à partir de 1 cm en dessous du diaphragme un descendant juste au-dessus des organes génitaux.
- Soulever l'intestin avec un coton-tige, couvrir les intestins dans une gaze stérile, humide (NaCl à 0,9%), et les placer sur le côté gauche de l'animal.
- Utiliser des tampons de coton pour séparer les membranes qui retiennent l'aorte abdominale et la veine cave inférieure aux tissus environnants.
REMARQUE: Ne pas disséquer les membranes entre l'aorte et la veine cave. - En utilisant des pinces dissidents, enlever la graisse aortique périvasculaire juste au-dessus de la bifurcation, que sur le côté droit de l'aorte et uniquement sur le site où l'aiguille sera insérée.
- Utilisez des cotons-tiges pour séparer l'aorte et la veine cave de 2 mm supeRior sur le site où l'aiguille sera insérée dans le but de créer un espace pour une pince Biemer.
- A ce domaine, la première place une ligature lâche (5-0 de suture) autour de l'aorte. Créer la tension sur la ligature en plaçant une pince de Kocher sur elle, puis placez le Kocher supérieur à l'incision (figure 1A). Placez le Biemer pince juste au- dessus de la ligature (Figur e 1A).
- En utilisant un coton - tige, comprimer la veine cave comme distalement que possible pour gêner la circulation (figure 1A). Pliez une aiguille (18 G dans ce protocole) dans un angle de 45 degrés, avec le pointage de l' orifice vers l'extérieur (figure 1A).
- Sous un angle de 90 degrés, insérer l'aiguille dans l'aorte juste au- dessus de la bifurcation, avec l'orifice de l'aiguille pointant vers la gauche (figure 1A). Manipuler la pointe de l'aiguille vers la gauche et l'insérer dans la veine cave.
NOTE: La pointe de l'aiguille doit maintenant être visible dans la veine cave (figure 1B). - Utiliser un second coton-tige pour pousser le sang restant dans l'aorte hors du site d'insertion pour prévenir la thrombose. Sécher la zone autour du shunt avec une gaze stérile pour que la colle pour coller de manière adéquate.
- Retirez l'aiguille entière de l'aorte et appliquer immédiatement une goutte de colle de tissu sur le site de ponction dans l'aorte. Assurez-vous de ne pas coller le coton-tige sur le tissu. Débrider l'aorte.
- Vérifier le shunt manuellement en tirant sur et en relâchant la ligature proximale aorte au shunt. Relâchement devrait colorer la partie distale de la veine cave du shunt en rouge vif et créer des turbulences sur le site de shunt.
NOTE: Serrage tournera le sang dans la veine cave retour au rouge foncé. - Placez les intestins de retour chez l'animal. Fermez la couche musculaire et la peau avec résorbables 4-0 sutures. Aérer l'animal avec 100% O 2 pour récupérer de l' anesthésie.
REMARQUE: Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
- Chirurgie Sham.
- Effectuer toutes les procédures ci-dessus, sauf pour l'insertion de l'aiguille dans l'aorte.
- Les soins post-chirurgicaux.
- Placer le rat dans une cage unique et dans un incubateur à 37 ° C jusqu'au lendemain matin.
- Vers 6 h après la chirurgie, injecter 0,01 mg / kg par voie sous cutanée buprénorphine pour l'analgésie post-opératoire. Répétez le lendemain matin si le rat montre des signes d'inconfort.
NOTE: Les 3 premiers jours après la chirurgie, les rats ont tendance à manger et à boire moins (ce qui est particulièrement important lorsque chow ou de l'eau potable sont mélangés avec des médicaments). La plupart des rats montrent un comportement normal 3 jours après la chirurgie. Sinon, suivre de près. La perte de poids supérieure à 15% en 1 semaine est considérée comme anormale et ces rats doivent être euthanasiés par l'extraction du volume de sang en circulation sous anesthésie.
REMARQUE: Dans ce protocole, l'animal est euthanasie par l'extraction du volume de sang en circulation sous anesthésie.
- Sacrifiez 1 jour après l'intervention chirurgicale (MF8) pour les réponses cellulaires et fonctionnelles précoces à l' augmentation du débit sanguin pulmonaire (par exemple, le gène de régulation à la hausse ou à des facteurs de transcription précoce).
- Sacrifiez 1 semaine après la chirurgie (MF14) pour un phénotype PAH vasculaire stade précoce (hypertrophie médiale sans lésions néointima).
- Sacrifiez 2 semaines après la chirurgie (MF21) pour une HTAP vasculaire phénotype à un stade avancé (marqué hypertrophie médiale et la formation néointimale) avec une légère élévation dans RVP et PAPm.
- Sacrifiez 3 semaines après la chirurgie (MF28) pour une HTAP vasculaire phénotype stade terminal (occlusion néointimale marquée) et une forte élévation de la RVP et PAPm. Les signes cliniques d'insuffisance ventriculaire droite sont courantes dans ce stade.
- Sacrifice après jour 28 (MF-RVF) Pour insuffisance ventriculaire droite HTAP associée (RVF), cliniquement définie comme la dyspnée, léthargie sévère, et la perte de poids (<10% en 1 semaine). Terminate rats lorsque l'un de ces signes est présent. Souvent, les rats développent ces symptômes entre les jours 28 et 35 et, si on les laisse sans surveillance, meurent spontanément pendant cet intervalle de temps.
5. Droit Coeur cathétérisme
- Anesthésie.
- Remplir la chambre d'induction avec 5% d' isoflurane / 100% O 2 (débit: 1 L / min) et placer le rat dans la boîte. Vérifiez la profondeur adéquate de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil arrière. Peser le rat.
- Rasage et nettoyer le cou sur le côté droit-ventral du rat et, pour le protocole échocardiographie, le thorax et l'abdomen supérieur.
- Placez le rat sur le dos sur un tapis de chaleur (37 ° C) et placer le museau dans une ventilation masque / hotte avec 2 - 3% d' isoflurane / 100% O 2 (débit: 1 L / min). Le museau doit être orienté vers le chercheur.
- protocole échocardiographie.
- Effectuer l'échocardiographie selon le protocole décrit par Brittain et al. dans JoVE 13.
- protocole de cathétérisme.
NOTE: Ce protocole utilise une canule rigide avec une pointe préformée plié à 20 degrés pour guider le cathéter de silicium de 15 cm avec un ballon de 2 mm de la pointe. Une aiguille de 20 G avec son orifice légèrement plié vers l'intérieur est utilisé pour insérer la canule dans la veine jugulaire droite (voir la liste des matériaux). Rats à toute phase de progression et de contrôle des HAP peuvent être utilisés dans ce protocole.- Désinfecter le cou avec du chlorure-hexidine. Faire une incision de 1,5 cm avec une lame de scalpel # 10 dans la partie droite-ventraledu cou, de la clavicule droite à l'os mandibulaire.
- Étaler le tissu avec des ciseaux. En utilisant une pince à épiler, retirez délicatement le tissu en dehors jusqu'à la veine jugulaire apparaît. Disséquer les membranes autour de la veine jugulaire en utilisant une pince à échardes.
- Mettez la tension sur la veine jugulaire en plaçant une ligature lâche (5-0 de suture) autour de la cuve. Augmenter la tension et la bande de la ligature sur le masque de ventilation (figure 2A).
- En aval du site d'insertion, placer une ligature lâche autour du récipient à serrer après que la canule est en place afin d'éviter les fuites et les pertes de pression.
- En utilisant les poignées d'une pince à cintrer légèrement la pointe d'une aiguille 20 G avec l'orifice à l'intérieur pour diriger la canule avec le cathéter.
- Introduire la pointe de l'aiguille de 20 G dans la veine et placer rapidement la canule contenant le cathéter à l'intérieur du navire. Retirez l'aiguille, puis fermez la ligaturequi a été préparé à l'étape 5.3.4.
- Procéder à la canule contenant le cathéter dans la veine jugulaire. La pointe de la canule est à une courbe de 20 degrés (voir étape 5.3.5). Manœuvrer la canule sous la clavicule et de faire avancer un peu pour entrer dans l'oreillette droite (figure 2C).
- Pour entrer dans le ventricule droit, pointer le bout de la canule vers la gauche, vers le cœur (figure 2D). Sur le moniteur de chevet, une courbe de pression de RV devrait apparaître, correspondant à la figure 2D.
- Lorsque la courbe de pression de RV est constante, notez la pression ventriculaire droite systolique et diastolique 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipuler la pointe de la canule vers la gauche et vers le haut. Faire avancer le cathéter dans la canule (figure 2E).
- Faire avancer le cathéter dans l'artère pulmonaire (PA). Aucune résistance doit être ressentie lors du passage de la valve pulmonaire.
REMARQUE: Lorsque le cathéter pénètre dans l'artère pulmonaire, le dla pression iastolic va augmenter. Sur le moniteur de chevet, une courbe de pression PA devrait apparaître, correspondant à la figure 2E. - Lorsque la courbe de pression PA est constante, notez la pression systolique, diastolique et moyenne pression PA 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Faire progresser le cathéter dans la canule jusqu'à ce que la balle à la pointe du cathéter vient se coincer dans une artère pulmonaire. Observez la courbe de pression sur le moniteur chute de chevet et correspondre à la courbe de pression de coin à la figure 2F.
- Lorsque la courbe de pression de coin est constante, notez la pression systolique, diastolique et moyenne pression de coin.
- Tirez lentement le cathéter, puis mesurer et noter les valeurs pour sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 et dRVP2, tel qu'il est affiché sur le moniteur de chevet.
- Lorsque dans le RV, légèrement retirer la canule et le cathéter pour mesurer la pression auriculaire droite (RAP) signifie. La courbe doit correspondre à la courbe de RAP dans la figure 2A.
NONTE: Dans ce protocole, les rats sont euthanasiés après le protocole de cathétérisation par l'extraction du volume de sang en circulation sous anesthésie.
6. Évaluation Morphologie et morphométrie
REMARQUE: Dans ce protocole, l'animal est euthanasie par l'extraction du volume de sang en circulation sous anesthésie. Rats à toute phase de progression et de contrôle des HAP peuvent être utilisés dans ce protocole.
- Après le sacrifice, sortez les poumons en coupant la trachée à environ 5 mm au-dessus de la bifurcation des bronches et les vaisseaux qui relient les poumons vers le cœur. Mettez les poumons dans une solution saline froide. Disséquer le poumon gauche. Couper la bronche principale gauche à la bifurcation.
- Remplir une seringue de 50 ml avec 4% de paraformaldehyde, fixez un tube avec une canule à la seringue, et accrocher la seringue d'un mètre au-dessus de la table de travail. Monter la canule dans la bronche principale gauche pour remplir passivement le poumon avec du paraformaldéhyde.Poignée paraformaldéhyde avec prudence.
- Laisser incuber le poumon gauche dans le paraformaldehyde pendant 48 h.
- Déshydrater le poumon gauche en l'incubant successivement dans 70% d'éthanol (1 h), 80% d'éthanol (1 h), 90% d'éthanol (1 h), 100% d'éthanol (3 h), le xylol (2 h) et de la paraffine ( 2 h).
- Incorporer le poumon gauche dans de la paraffine, à l'hile du poumon en regard de la cassette.
- Colorer les sections pulmonaires 4 um paraffine en utilisant une coloration Verhoeff ou Elastica van Gieson, selon les instructions du fabricant 29. Assurez - vous que les lames élastiques sont bien différenciés (comme dans la figure 3). Balayez les coupes colorées à un grossissement de 40X.
- Divisez le poumon en 4 quadrants. Dans chaque quadrant, trouver 10 navires avec un diamètre extérieur <50 pm (intra-acineuses) et 10 navires avec un diamètre extérieur> 50 pm (pré-acineuses). Prenez une photo (2 x 40 images par poumon). Zoom au hasard jusqu'à un grossissement de 20x et photographier tous les naviresdans ce domaine en vue de minimiser les biais de sélection.
- Exclure les navires qui ont un plus long le plus court rapport qualité / diamètre> 2, une forme circulaire incomplète, ou un effondrement de plus d'un quart de la paroi du vaisseau.
NOTE: Un exemple d'un navire exclu est représenté sur la figure 3b Faire de chaque image sur le même grossissement (40X) et inclure une barre d'échelle. - Ouvrir ImageJ et la première image. Tracer une ligne droite sur la barre d'échelle dans l'image pour définir l'échelle via "Analyse" et "Définir l' échelle." Pour "distance connue," utiliser la valeur sur la barre d'échelle de l'image. Utiliser micromètres (um) comme unité de longueur. Réglez l'échelle mondiale.
- Utilisation de "sélections à main levée," tracer une ligne sur la bordure intérieure de la zone luminale (figure 3), et utiliser "mesure" (Ctrl m) pour mesurer ce domaine. Ensuite, tracer une ligne autour de la elast extérieureic lamina (Figure 3) pour mesurer la zone de navires total.
- Calculer le luminal et le diamètre extérieur (
) en utilisant 
. - Calculer l'épaisseur de la paroi à l'aide
. - Calculer le rapport paroi / lumière en utilisant
. - Calculer le score d'occlusion en utilisant
. - Note du navire sur muscularisation (non, muscularisation partielle ou totale) (figure 3B).
NOTE: Les navires ayant une limitante élastique double pour plus de la moitié de la circonférence sont définies comme totalement muscularized. Les navires ayant une lame élastique à double moins de la moitié de la circonférence sont définies comme partiellement muscularized. - Marquer le navire en présence d'un Neointima (oui ou non) (figure 3C).
NOTE: Les navires sans limitante élastique interne clairement définie combinée avec (souvent excentrique) luminal occlusion sont définis comme des lésions néointima.
) en utilisant 
. 
. 
. 
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Representative Results
Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 4. Les résultats présentés montrent des caractéristiques de MCT + FLOW chez des rats Lewis dans les groupes suivants: contrôle (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), et MF-FVR ( n = 10). Des analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA avec correction de Bonferroni.
60 mg / kg de MCT et l'augmentation pulmonaire conduisent le flux sanguin vers une augmentation moyenne de la pression ventriculaire droite systolique (APV) (23 ± 6 56 ± 11 mmHg), la pression artérielle pulmonaire systolique (SPAP) (20 ± 4 54,0 ± 10 mm Hg ), et la moyenne pression artérielle pulmonaire (PAPm) (16 ± 3-36 ± 4 mmHg) à 28 jours (MF28). Ils restent tout aussi élevé jusqu'au stade où une insuffisance ventriculaire droite se développe (MF-FVR) (Figure 4). Aux stades précoces (HAP MF8 et MF14), pas d'augmentation de l'APV, sPAP et PAPm est observée. PAP diastolique et un droitaugmentation de la pression d'essai à la fin des phases, mais pas de manière significative. pressions Wedge ne changent pas de manière significative au cours de la progression de la maladie.
Ventriculaire ventriculaire droite à gauche et du septum rapport de poids augmente de manière significative de MF14 à MF-RVF, indiquant une hypertrophie ventriculaire droite. rapport poids humide à sec du foie est augmenté de façon significative au stade MF-RVF, ce qui indique un œdème du foie et insuffisance ventriculaire droite congestive.
Muscularisation des vaisseaux intra-acineuses <50 pm augmente progressivement au cours de la progression des HAP. Les navires de cette taille normalement ne disposent pas d'une couche médiane musculaire chez les rats témoins. A MF14, près de la moitié de ces navires (43 ± 17%) a un support musculaire totale (comme dans la figure 3B). A MF28 et MF-RVF, presque tous les artériole est muscularized (98,7 ± 2,5% et 100 ± 0%). lésions néointimale se produisent d'abordà MF21, tout en MF28 et MF-RVF, environ 65% de tous les artérioles ont une couche néointimale (comme dans la figure 3C). Les artériolaires mur-à-lumière de rapport et de l'occlusion des scores à la fois augmenter de manière significative de MF14 à MF28 (respectivement, 10,4 ± 3,9 à 71,5 ± 30 (con: 7,1 ± 0,2) et 20,0 ± 2,8 à 54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). Les caractéristiques hémodynamiques et histomorphologiques de progression HAP dans les MCT + FLOW chez les rats Wistar sont semblables 14.
Figure 1. Représentation schématique de la chirurgie Shunt aorto-caval. A) L'aorte est tendu et serré supérieur au site d'insertion. La veine cave inférieure est comprimée à l'emplacement d'insertion. L'aiguille, courbé à 45 ° et avec l'orifice vers l'extérieur, est inséré dans l'aorte à un angle de 90 °. B) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Droit de procédure de cathétérisme cardiaque et courbes de pression représentatifs. A) La veine jugulaire droite est tendue avec une ligature et du ruban adhésif sur le masque de ventilation. Le cathéter est placé dans la veine jugulaire. B) Un moniteur de chevet affichant une bonne vague de pression ventriculaire. C) Le cathéter dans la canule placée dans l'oreillette droite après l' introduction dans la veine jugulaire droite. Ci-dessous: un droit onde de pression auriculaire typique. D) Le cathéter à l' intérieur de la canule placée dans le ventricule droit. Ci-dessous: un ventricul typique droitar onde de pression dans les HAP en phase terminale. E) Le cathéter est avancé dans la canule pour entrer dans l'artère pulmonaire principale. Ci-dessous: une onde de pression artérielle pulmonaire typique. F) Le cathéter est avancé dans les artères pulmonaires jusqu'à ce qu'une onde de pression de coin est affiché sur le moniteur. Ci-dessous: une onde de pression capillaire pulmonaire typique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Vascular Morphologie et morphométrie chez les rats de contrôle et de HAP. A) Un navire normal, non-muscularized avec un score d'occlusion de 3,7%. B) Une artériole totalement muscularized avec un score d'occlusion de 24,3%. C). Une lésion néointimale avec un score d'occlusion de 54,1%. RÉ) E) La mesure de la cuve et la superficie totale luminale (dans une cuve contenant une représentation schématique d'une lésion néo - intimale), y compris les calculs. Les barres représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Les résultats représentatifs de pulmonaire hémodynamique et vasculaire Morphologie / Morphométrie. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA avec des corrections de Bonferroni. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. con: contrôle; MF (monocrotalin + flux); RVF: insuffisance ventriculaire droite; s: systolique; d: diastolique; m: moyenne; VPR: pression ventriculaire droite; PAP: pulmonarLa pression artérielle y; RAP: pression auriculaire droite. RV: ventricule droit; LV: ventricule gauche; IVS: septum interventriculaire; BW: poids corporel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cette méthode décrit la procédure chirurgicale d'un shunt aorto-caval chez les rats pré-traités avec MCT pour créer HTAP induite par le flux et les techniques pour évaluer l'hémodynamique principe et la fin histopathologiques qui caractérisent les HAP et ce modèle.
Étapes critiques au sein du Protocole et de dépannage
La chirurgie et post-chirurgie. Au cours de la chirurgie de shunt aorto-caval, l'étape la plus critique est la dissection de l'aorte et la veine cave. Les membranes qui entourent l'aorte et la veine cave doit être disséqué suffisant pour créer 1) une bonne visibilité de la zone de l'aorte, où l'aiguille est insérée, et de la position de l'aiguille dans la veine cave après l'insertion et 2) un espace suffisant pour bloquer l'aorte au-dessus du site d'insertion. Les mêmes membranes, cependant, sont également utilisés pour conduire le sang de l' aorte par le biais du site de ponction entre les deux vaisseaux (figure 1). Disséquer les membranes trop seprovoquer la dérivation de la fuite. Colle tissulaire peut régler la fuite, mais il ne peut alors suinter également dans le shunt, ce qui compromet sa taille. Lorsque la colle a limité l'écoulement à travers le shunt ou l'un des navires, la colle peut être retirée doucement, mais la rupture de la veine cave ou des membranes qui effectuent le shunt peut se produire. La taille ou l'adéquation du shunt peut être estimé en comparant la différence de couleur et le degré de turbulence du sang dans la veine cave inférieure lors de la compression et la décompression de l'aorte proximale avec un coton-tige.
Une aiguille de 18 G a été montré pour créer un shunt adéquat qui se traduit par une forme cohérente et reproductible de la progression des HAP dans Lewis (cet article) et Wistar (voir référence 14) rats et ventriculaire droite surcharge de volume 15. Une aiguille de 18 G a créé le shunt la plus équilibrée, avec une augmentation significative débit pulmonaire, d'une part, et un taux de complications post-opératoires bas d'autre part. Le problème post-chirurgicale la plus fréquente est la perte de poids. La perte de poids jusqu'à 10% en 1 semaine se produit chez tous les rats après une intervention chirurgicale, probablement en raison d'une plus faible consommation au cours des premiers jours après la chirurgie. Les rats sont euthanasiés lorsque la perte de poids est supérieur à 15% en 1 semaine, car cela est considéré comme un signe de malaise. chow liquide peut améliorer l'alimentation dans la première semaine après la chirurgie. les complications postopératoires sont rares derrière la paralysie de la jambe et l'ischémie intestinale, ce qui entraîne aussi l'euthanasie. Au total, moins de 5% des rats ont dû être euthanasiés après l'opération.
Cathétérisme. Les étapes critiques pendant le protocole de cathétérisme commencent par la régulation de l'anesthésie. La profondeur de l'anesthésie doit être aussi minime que possible (1,5 à 2% d'isoflurane dans ce protocole), comme une augmentation de la profondeur de l'anesthésie semble diminuer ventriculaire droite et la pression artérielle pulmonaire, en particulier chez les rats atteints d'insuffisance ventriculaire droite. Les mesures ont tendance à become fiable lorsque le protocole est supérieur à 20 min dans la durée.
La prochaine étape critique est la manipulation du cathéter dans le RV et dans l'artère pulmonaire principale. Cela peut être difficile. Rinçage du cathéter peut aider à la courbe du cathéter dans le tube d'écoulement lorsque la pointe est coincé dans la trabécules de la RV. La manipulation elle-même peut causer RV dyskinésie, qui montre des courbes de pression irrégulière sur le moniteur de chevet. L'introduction du cathéter dans le ventricule droit et l'artère pulmonaire devraient fonctionner correctement. Lorsque la pointe est bloqué à la valve pulmonaire, une résistance se fait sentir. Presser à travers cette résistance peut entraîner la valvule pulmonaire à la rupture, ce qui limite la fiabilité des mesures ultérieures.
Dans le présent protocole, les rats sont sacrifiés après la procédure de cathétérisme. En théorie, cependant, la veine jugulaire et plaie chirurgicale peuvent être fermées après que le cathéter est retiré, car les animaux peuvent vivre avec seulementle restant gauche veine jugulaire.
Morphométrie. Dans l'évaluation de l'épaisseur de la paroi et l'occlusion vasculaire scores, l'étape la plus critique est d'identifier les lames élastiques. De l'expérience, la probabilité de succès à cette fin est le plus grand avec un Verhoeff ou Elastica van Gieson coloration bien différencié. Alors que la lumière peut généralement être discerné facilement à partir de l'intima (pour mesurer la zone vasculaire interne), distinction des médias de l'adventice peut exiger un peu plus près (pour mesurer la surface vasculaire externe). Certains protocoles mesure intima et l'épaisseur médiane séparément, définissant l'intima que la couche entre la lumière et la lamina élastique interne et le support en tant que couche entre la lamina élastique interne et externe. Cela est généralement possible dans un stade précoce MCT + FLOW PAH. Cependant, artérioles dans la maladie avancée, en particulier les lésions néointima, peuvent afficher lames élastiques multiples et souvent perdre l'intégrité des lames élastiques ( Avantages et limites de l'ajout du flux comme Trigger L'utilisation de l'augmentation du débit sanguin pulmonaire pour créer des HAP chez le rat a plusieurs avantages, le mais le plus important étant qu'il est connu (patho) déclenchement physiologique de la maladie, ce qui favorise la traduction aux HAP-CHD humaine (Eisenmenger Physiologie), également à d' autres formes de HAP 9. Le modèle permet la régulation du débit en faisant varier la taille de l'aiguille lors de la création AC-shunt. Dans huhomme PAH-CHD, la fermeture du shunt va conduire à l'inversion des HAP dans la phase précoce de la maladie, mais à la progression des HAP dans les stades avancés de la maladie. Fermeture du shunt in vivo permettrait un à étudier l'effet de la suppression de la gâchette à différents points de temps de progression de la maladie et donc d'étudier les mécanismes de (non-) inversion des HAP. Malheureusement, à l'heure actuelle, la fermeture shunt est pas possible dans le modèle actuel. Les effets de la normalisation hémodynamique (par exemple, l'élimination des excès de débit et de la normalisation de la pression artérielle pulmonaire) chez les rats atteints d'HTAP de flux associé peuvent être étudiés par la transplantation du poumon gauche affecté à un rat receveur avec une circulation normale. Il a été montré précédemment que la normalisation hémodynamiques chez le rat par une greffe de poumon humain et HAP CHD par la fermeture d'une dérivation cardiaque, conduit à la régression de l' hypertrophie de la média dans un stade précoce 21 HAP. Les effets de la hémodynamique normalesation dans les stades avancés de la expérimentale flux-HAP sont actuellement inconnus. Importance par rapport aux modèles alternatifs Le modèle MCT seul coup. Une injection sous-cutanée de 60 mg / kg de MCT est un moyen simple et efficace pour créer un modèle d'hypertension artérielle pulmonaire chez le rat. TCM induit une lésion des cellules endotheliales artérielles pulmonaires, suivie d' une hypertrophie de la couche musculaire des artères pulmonaires 5. Bien que les mécanismes exacts restent floues, diverses voies et facteurs de croissance ont été identifiés qui participent à l'hypertrophie médiale suivante MCT. intervention pharmaceutique sur ces voies a souvent réussi à réduire l'hypertrophie médiale et PAPm dans MCT-rats. Cependant, étant donné que l' hypertrophie médiale est connu pour avoir une tendance naturelle à inverser chez les humains 3 et a également été décrite pour inverser spontanément dans MCT-rats 16, l'effet de ces traitementsdevrait être évalué de façon critique. Le MCT + FLOW modèle à double-hit. L'ajout de sang pulmonaire a augmenté le débit de 7 jours après l'injection de MCT modifie de manière critique la (vasculaire) phénotype d'une manière dépendant du temps caractéristique. À MF14 (7 jours après l'induction de l'écoulement accru), les navires normalement non muscularized commencent à développer une couche médiane musculaire. À MF21, les médiaux augmente d'épaisseur et les premières lésions néointima se produisent. A MF28, une couche néointimale a développé dans la plupart des navires. Entre MF28 et MF35, la plupart des rats développent une insuffisance cardiaque droite et meurent de son séquelles. Des études antérieures chez des rats + TCM de flux ont montré que l'addition d'écoulement vers MCT conduit à l'activation de groupes spécifiques de gènes. Dans certains groupes, le flux opposé les effets induits par MCT; dans d' autres, le débit amélioré ces effets, et une grappe contenait des gènes qui étaient spécifiquement régulés à la hausse après écoulement 17. Un de ces gènes spécifiques de flux est lecroissance précoce-1 gène réponse 14 (Egr-1). Inhibition précoce de Egr-1 a donné lieu à l'atténuation de l' HTAP et la formation néointimale dans MCT + rats de débit 18. Egr-1 a également été associée à néointimale remodelage dans l' HTAP humaine (PAH-CHD et HTAP idiopathique) 19. Ces observations ajouter à la preuve que l'augmentation ou perturbé le flux sanguin pulmonaire est un déclencheur essentiel pour la formation néo-intimale. Le modèle de flux uniquement un seul touché. Chez les rats avec un shunt aorto-cave sans MCT-injection, l' hypertension artérielle pulmonaire (PAPm> 25 mmHg) se développe entre 10 et 20 semaines après l' induction de dérivation 20. À 20 semaines, l'histologie vasculaire pulmonaire est dominé par l'hypertrophie médiale des artères pré-acineuses et néo-muscularisation des artérioles intra-acineuses. Bien que certaines lésions néointima ont également été décrites dans ce modèle 20, le développement de ces lésions a besoin de t o être confirmée et quantifiée. Le modèle Sugen-hypoxie. Un autre modèle commun pour les HAP avec des lésions néointima est le rat Sugen5416-hypoxie (SuHx). blocs Sugen5416 le facteur de croissance endothéliale (VEGF), les récepteurs vasculaires. Ceci induit des dommages aux cellules endothéliales et une cascade de signalisation qui, en combinaison avec l' hypoxie, évoque endothéliale apoptose et la prolifération 22. Après l'injection Sugen5416, le rat est placé dans une chambre hypoxique pendant 4 semaines, sur lesquels HTAP se développe. Le rat est ensuite ré-exposé à normoxie pendant 4 semaines. Des composés pharmacologiques qui ciblent l' apoptose endotheliale résistance ou les cascades de signalisation du TGF-B et de BMP ont montré la possibilité d'inverser les lésions de la néointima dans ce modèle , 23, 24, 25. Une nouvelle variante du modèle est le modèle SuHx Sugen-pneumectomy, ce qui se traduit également par HTAP sévère avec des lésions de la néointima > 26. Toutefois, ce modèle n'a pas encore été totalement caractérisés. Un procédé génétique nouveau à induire chez des rats PH implique une mutation dans le gène récepteur de la BMP-2, ce qui se traduit par muscularisation significative (PH) , mais aucune formation de néo - intima (HAP) 27. Des résultats comparables ont été rapportés en ce qui concerne le nombre de lésions néointima et le degré d'occlusion luminale dans la phase terminale de SuHx non traités et des rats TCM + 28 Débit. Les principales différences entre les deux modèles sont 1) que le PAPm dans MCT + flux augmente progressivement, alors que dans l'SuHx PAPm a été démontré, à diminuer progressivement après la ré-exposition à normoxie 28; 2) que le modèle TCM + Flux connaît un stade précoce de la maladie, caractérisée par une hypertrophie médiale et la dysfonction endothéliale; 3) que le temps qu'il faut les deux modèles pour parvenir à un stade terminal où l'échec ventriculaire droite commence à se développer (4 semaines en MCT + débit, 8 semaines à SuHx)ef "> 28 est différent; et 4) que Sugen5416 interfère dans une voie moléculaire (VEGF) , dont le rôle dans la pathogenèse de l' HTAP est encore difficile Cela peut entraver la traduction aux HAP humaine.. Applications ou orientations futures Les phases de la maladie distinctes du MCT + modèle de débit permettent une 1) pour tester les mécanismes de progression de la maladie (tissu humain en général est uniquement disponible à partir post-mortem ou procédures explants) et interventions 2) pour tester dans différentes stratégies. Une stratégie préventive pourrait être initiée à la construction du shunt (MF7). Une intervention précoce peut être initiée à MF14. Cela peut être utile en tant que stratégie de traitement avant la fermeture shunt chez les enfants avec un shunt cardiaque congénitale et HTAP associée qui a progressé dans la zone grise entre la maladie réversible et irréversible. stratégies d'inversion peuvent être lancées à MF21 ou MF28. Les étapes ultérieures montrent toutes deux lésions néointima, une manifestation de HAP en phase terminale. </ P> En conclusion, l'ajout d'une augmentation du débit pulmonaire à MCT chez le rat crée un modèle de l'HTAP progressive et sévère qui imite le développement de la maladie humaine. Droit cathétérisme cardiaque et l'évaluation qualitative et quantitative de l'histopathologie vasculaire forment les pierres angulaires de la caractérisation de la maladie dans ce domaine et d'autres modèles pour les HAP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
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- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
