分流手术、右心导管检查及血管形态测量在血流诱导型肺动脉高压大鼠模型中的应用

摘要

本方案描述了一种在大鼠中建立血流诱导肺动脉高压（PAH）模型的手术方法，以及分析该模型主要血流动力学和组织学终点的实验步骤。

摘要

在本实验方案中，通过联合使用60 mg/kg野百合碱（MCT）注射与经主动脉-腔静脉分流术（MCT+Flow）增加肺血流量来诱导肺动脉高压（PAH）。分流术通过将18号针头从腹主动脉插入邻近的腔静脉建立。研究表明，增加的肺血流量是诱发一种具有明确疾病进展阶段的重度PAH的关键触发因素，其特征为早期出现中膜肥厚，随后形成新生内膜病变，并逐渐导致小肺血管闭塞。为测量该模型中的右心及肺血流动力学，经右颈静脉插入带有柔性球尖导管的硬质套管进入右心室，进行右心导管检查。随后将导管推进至主肺动脉及更远端的肺动脉。肺血管系统的组织病理学评估采用定性与定量两种方法：定性评估通过评分肺小叶前和肺小叶内血管的肌化程度及新生内膜的存在情况；定量评估则通过测量血管壁厚度、壁腔比以及闭塞评分来完成。

引言

该方法的目的是建立一种可重复的大鼠严重血流诱导性肺动脉高压模型，并测量其主要的血流动力学和组织病理学终点指标。

肺动脉高压（PAH）是一种临床综合征，其特征是肺血管阻力进行性升高，最终导致右心室衰竭和死亡。在肺动脉高压性疾病（PH）这一大类疾病谱中，PAH 是最为严重的形式，目前仍无治愈手段¹。PAH 的基础血管病变表现为典型的血管重塑，导致血管腔闭塞。正常无肌层血管出现肌层化以及血管中膜层肥厚被认为是 PAH 的早期病变，这些改变也可见于其他类型的 PH²，且被认为具有可逆性³。随着 PAH 的进展，内膜层开始发生重塑，最终形成特征性的新生内膜病变²。这种新生内膜型肺血管重塑为 PAH 所特有，目前认为不可逆转⁴。

由于肺动脉高压（PAH）是一种罕见疾病，其病理生物学机制的深入理解以及新疗法的开发在很大程度上依赖于动物模型。大鼠单克洛碱（monocrotalin, MCT）模型是一种简便的方法 单次打击 一种被频繁使用且至今仍被广泛采用的模型。MCT 是一种毒素，可导致肺小动脉损伤及局部炎症⁵60 mg/kg MCT ....

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得荷兰中央动物实验委员会及格罗宁根大学医学中心动物护理委员会（NL）的批准。实验使用了体重在180至300克之间的Wistar和Lewis大鼠。

1. 动物饲养与适应

1. 到达中心动物房后，将大鼠以每笼5只进行群养。在为期7天的适应期期间，使大鼠适应人为操作，但不得进行任何实验操作。

2. 无菌野百合碱的制备与注射

1. 配制 1 mL 浓度为 60 mg/mL 的野百合碱（MCT）溶液时，称取 60 mg 野百合碱置于 2-mL 离心管中。加入 700 µL 的 0.9% NaCl 溶液，再加入 200 µL 的 1 M HCl。将离心管置于热水下温育并涡旋混匀。使用 6 N NaOH 将溶液 pH 调至接近 7.0。为啮齿类动物注射制备 MCT 溶液时，须采用无菌操作技术。
2. 按每千克体重皮下注射 1 mL 无菌的 60 mg/mL MCT 溶液（例如，300 g 大鼠注射 0.3 mL 的 60 mg/mL MCT）。注意：我们不推荐使用更小的注射体积，因为可能导致给药剂量不准确。

3. 腔静脉-主动脉分流手术

1. 麻醉
   1. 用5%异氟烷/100%氧气充满诱导室₂ （流速：1 L/min）....

结果

代表性结果见图4。所示结果展示了以下各组Lewis大鼠MCT+FLOW模型的特征：对照组（n = 3）、MF8组（n = 5）、MF14组（n = 5）、MF28组（n = 5）和MF-RVF组（n = 10）。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni校正。

60 mg/kg MCT 与增加的肺血流量可导致 28 天时（MF28）右心室收缩压（sRVP）（23 ± 6 至 56 ± 11 mmHg）、肺动脉收缩压（sPAP）（20 ± 4 至 54.0 ± 10 mmHg）和平均肺动脉压（mPAP）（16 ± 3 至 36 ± 4 mmHg）显著升高。这些压力在右心室功能衰竭发生阶段（MF-RVF）之前均维持在高水平（图 4）。在肺动脉高压早期阶段（MF8 和 MF14），sRVP、sPAP 和 mPAP 均未见升高。肺动脉舒张压和右心房压在疾病晚期有所上升，.......

讨论

本方法描述了对经MCT预处理的大鼠建立动静脉瘘以诱导血流依赖性肺动脉高压的外科手术步骤，以及评估该模型中肺动脉高压主要血流动力学和组织病理学终点的技术。

方案中的关键步骤与故障排除

手术及术后操作。在建立主动脉-下腔静脉分流术的过程中，最关键的步骤是主动脉与下腔静脉的分离。包裹主动脉和下腔静脉的膜组织应充分游离，以实现两个目的：1）获得良好的视野，便于观察针穿刺主动脉的位置以及穿刺后针在下腔静脉内的位置；2）在穿刺点上方为主动脉提供足够的空间以便夹闭。然而，这些膜组织也起到引导血流从主动脉经穿刺孔进入下腔静脉的作用（图1）。若过度剥离这些膜组织，将导致分流处发生渗漏。使用组织胶可封闭渗漏，但胶水也可能渗入分流通道，从而影响其有效直径。当胶水导致分流通道或任一血管血流受限时，可尝试轻柔地清除胶水，但此操作可能引起下腔静脉或引导分流的膜组织破裂。可通过使用棉签压迫并释放近端主动脉，观察下腔静脉内血液颜色的差异及血流湍流程度的变化，来评估分流通道的大小或通畅性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分流手术
无菌外科手套
Duratears 眼膏	Alcon	10380
氯己定
棉签
Histoacryl 组织胶	B. Braun Medical	1050052
Silkam 5-0 缝线 黑色 不可吸收	B. Braun Medical	F1134027
Safil 4-0 缝线 紫色 可吸收	B. Braun Medical
18 G 针头	Luer	NN1838R BD	针尖向外弯曲45度
纱布 10 x 10 cm	Paul Hartmann	407825
镇痛新 布托啡诺	RB Pharmaceuticals	5429	皮下注射
0.9% 氯化钠
大鼠通气面罩
手术刀片
Biemer钳 18 mm，5 mm开口	AgnTho	64-562
加热垫
Kocher钳
剃毛机
显微镜	Leica
右心导管术
无菌外科手套
眼膏	Duratears
氯己定
棉签
纱布 10 x 10 cm	Paul Hartmann	407825
Silkam 5-0 缝线 黑色 不可吸收	B. Braun Medical	F1134027
20 G 针头	Luer		针尖轻微向内弯曲
20 G 套管	Luer		用于插入导管，针尖预弯20度
硅胶导管 长15 cm			距尖端2 mm处有0.5 mm球囊
压力传感器	Ailtech
床旁监护仪 Cardiocap/5	Datex-Ohmeda
剃毛机
10 mL 注射器
0.9% 氯化钠			用于冲洗
血管形态学
50 mL 注射器
4% 甲醛
带管路的18 G 套管
Verhoeff染色试剂盒	Sigma-Aldrich	HT254	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US
数字切片扫描仪	Hamamatsu	C9600
ImageJ
弹性纤维（结缔组织染色）	Abcam	ab150667	http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf