Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה assay להרחבה אישית assay בתסיסנית כי התשואות נתונים חזקים, כמותיים כדי למדוד התנהגות הטיפוח. השיטה מבוססת על השוואת ההבדל הצטברות צבע על גופים של חיות מטופחות לעומת מטופח על פני תקופה של זמן.
Abstract
תסמונת הטיפוח ההתנהגות היא מורכבת מורכבים צעד רב תוכנית הדורשת תנועה מתואמת של שתי קדמיות ו hindlegs. כאן אנו מציגים פרוטוקול assay grooming עיצוב קאמרית הרומן כי הוא חסכוני וניתן להרחבה עבור מחקרים קטנים או בקנה מידה גדול של תסיסנית תסיסנית . זבובים מאובקים בכל הגוף שלהם עם צבע צהוב מבריק ניתנה זמן כדי להסיר את הצבע מגופם בתוך החדר. זבובים מופקדים אז בנפח קבוע של אתנול כדי solubilize את הצבע. ספיגה ספקטרלית יחסית של דגימות אתנול לצבוע עבור חיות מטופחות לעומת מטומטמים נמדדים ומתועדים. פרוטוקול התשואות נתונים כמותיים של הצטברות צבע עבור זבובים בודדים, אשר ניתן בקלות ממוצעים לעומת דגימות. זה מאפשר עיצובים ניסיוניים בקלות להעריך יכולת הטיפוח עבור מחקרים בבעלי חיים מוטציה או מניפולציות מעגל. הליך זה יעיל הוא גם צדדי וניתן להרחבה. אנו מראים wזרימת אורק של הפרוטוקול ונתונים השוואתיים בין בעלי חיים WT לבין בעלי חיים מוטנטים עבור סוג תסיסנית אני דופמין קולטן ( DopR ).
Introduction
Grooming ב תסיסנית melanogaster ( ד melanogaster ) היא התנהגות מולדת חזקה הכוללת את התיאום של מספר רב של תוכניות עצמאיות המנוע 1 . פירות זבובים לנקות את גופם של אבק, חיידקים, פתוגנים אחרים שיכולים לעכב תפקוד פיזיולוגי נורמלי כגון חזון הטיסה, או להוביל לאתגרים חיסונית משמעותית. בחישה ובמענה לפעולה מכנית 2 ופעילות חיסונית 3 , זבובים משפשפים שוב ושוב את רגליהם או על אזור גוף ממוקד עד שהוא נקי מספיק והטיפוח מתקדם לחלק אחר של הגוף. זבובים לבצע תנועות grooming ב מובהק bouts כי מתרחשות בעיקר בדפוסים סטריאוטיפיים 1 , 4 . היררכיה התנהגותית מתבהרת כאשר אותות הטיפוח מסודרים לפי סדר עדיפויות. מעגלים ודפוסי פעילות זוהו בתמיכהFa, כי תוכניות הטיפוח בחלק העליון של ההיררכיה להתרחש הראשון לדכא אותות מקבילים מאזורים של הגוף כי הם groomed לאחר מכן 5 . העדיפות הגבוהה ביותר ניתנת לראש, אחר כך את הבטן, כנפיים, ולבסוף את בית החזה 5 .
תוכנית הטיפוח ב- D. melanogaster היא מערכת אידיאלית לחקר מעגלים עצביים, אותות מולקולריים מודולאריים ומעבירים נוירוטרנסמיטריים. לדוגמה, פשרה של תפקוד neurofibromin 6 , אובדן של תסיסנית X חלבונים פיגור שכלי נפשי ( dfmr1 ) 7 , וחשיפה bisphenol A (BPA) 8 כל לגרום להתנהגויות מוגזמות והתנהגויות אחרות אשר מקביל לסימפטומים אנושיים נפרדים של neurofibromatosis, שביר X תסמונת, ואת ההיבטים של הפרעות ספקטרום האוטיזם הפרעת קשב וריכוז Hyperactivity הפרעת (ADHD), בהתאמה. התנהגות Grooming יכול להיות גם הרגלטד דיפרנציאלי על פני זנים מוטציה 2 , ההלוואות זו תוכנית המנוע ללימודי גמישות התנהגותית. רוחב התופעות הנוירולוגיות שניתן לדגם על ידי תסיסנית דורש גישה השוואתית חדשה למדוד את היכולת של זבובים לחתן את עצמם.
הפעולה המשולבת של מובילי monoamine שלפוחית ואת השפע היחסי של דופמין ואמינים ביוגניים אחרים בגוף הוכחו לתווך זבוב פרי התנהגות grooming 9 , 10 . Octopamine ודופאמין לעורר פעילות טיפוח hindleg דומה זבובים ערופים, בעוד טירמין, החומר המוצא לייצור octopamine, תופעל גם טיפוח ובמידה פחותה 7. ארבעה קולטנים דופאמין זוהו ב ד melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, מטומטם ) ב hindleg התנהגות grooming 15 .
הטיפוח ניתן לכימות בעקיפין על ידי הסתכלות על מידת הניקיון שבו חיה יכולה לחתוך באופן מלא לאחר אבק לכל הגוף עם צבע סמן או אבק פלואורסצנטי 5 , 16 . שאר שאריות האבק שנותרו על הגוף יכולות לשמש כסמן יחסי להתנהגות הכללית. זבובים מאובקים לאחר שקיבלו מספיק זמן כדי החתן עשוי להיות לידי ביטוי גירעון מסוים בהתנהגות grooming. כמו חקירות הטיפוח הפכו נרחב יותר, פרוטוקולים שולבו פרקטיקות כגון עריפת ראש כדי להוסיף טיפולים תרופתי על הצוואר עצבי החיבור 10 , גירוי מישוש של זיפים כדי לעורר את התגובה grooming 2 ,והקלטת וידאו של התנהגות 15 . תצפית ישירה של הטיפוח ניתן ללמוד בקלות באמצעות תצפית חזותית הקלטה ידנית של תדירות ומשך של אירועים grooming ספציפיים 4 .
עיצבנו חמישה עשר חדרים grooming כי ניתן לבנות עם מדפסת 3D או חותך לייזר, ואת עיצובים תכנית מתאר זמינים עבור רבייה 15 . העיצוב משתמש בשני לוחות מרכזיים מחוברים עם פתחים מתאימים מופרדים על ידי רשת ושני לוחות הזזה העליון והתחתון, שממנו זבובים ו / או צבע נטען, בהתאמה. לאחר המאפשרים זבובים אבק זמן החתן, אנו להפקיד אותם אתנול כדי solubilize לצבוע ולמדוד את ספיגת של פתרון זה באורך גל של צבע. קורא צלחת ניתן להשתמש בדגמים מקבילים מרובים או ספקטרופוטומטר יחיד לקרוא ניתן להשתמש עבור דגימות בודדות. שיטה זו ממזער את השגיאה המושרה על ידי טיפול אלLows עבור grooming assays להיות לרוץ על קטן, חסכונית בקנה מידה. שיטה זו נגזרת ו שונה מן השיטות חלוץ על ידי ג 'ולי סימפסון אנדרו זרעים, אשר משתמשים בתאי grooming גדול עם אלמנטים חימום עבור מניפולציות מעגל טמפרטורה רגישה 5 . פרוטוקול הבא מציג את כימות של הטיפוח של הגוף כולו, כמו גם מראה שיטות חלופיות quantitation של הצטברות צבע על חלקי גוף בודדים. כמו כן, אנו מציגים נתוני השוואה מדגם בין מוטציות WT ו- DopR , כמו גם שיטות לחישוב מדד ביצועים פשוט להתנהגות הטיפוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
- הכן aspirator להזיז תסיסנית לחיות מתוך בקבוקון תרבות לחדר grooming. Aspirators לאפשר העברת בעלי חיים מודעים לתאי התנהגות כדי להבטיח כי הרדמה אינה משפיעה על התצפית ההתנהגותית שלאחר מכן.
- באמצעות מספריים לחתוך 1.5 מטר של צינור tygon מזהה ⅛ ", OD ¼". Cut לפחות 1 אינץ 'של קצה קצה 1 מ"ל חד פעמי micropipette. החזק חתיכת 1 ס"מ מרובע של רשת (פתיחה 0.196 אינץ ') על קצה לחתוך.
הערה: רוב עצות 1mL יש קו הדרגתית שבו קצה יושב בתיבת החבילה, בדרך כלל לחתוך לקו זה. - במקום snugly טרי 1 מ"ל micropipette עצה מעל קצה / רשת לחתוך. התבוננו בצורת רשת בין שני הטיפים. החלק הפנימי של קצה חדש יוצר חדר החזקת זבובים.
- חותכים את קצה קיצוני של קצה micropipette חדש להרחיב את פתיחת מספיק כדי לאפשר מעבר של זבוב אחד. הולדואר יהיה בערך להתאים את הפתיחה של החדר grooming (כ 1.5-2 מ"מ קוטר).
- התקינו בקפידה את הקצות המקוננות על קצה צינורות הטיגון. דחוף את הקצות לתוך הצינור כדי להבטיח התאמה הדוקה כדי לאפשר לחץ ואקום.
- בקצה השני של הצינור, לחתוך את קצה קצה micropipette 200 μL ולהתאים את סוף לחתוך צר לתוך צינורות. זהו הצד "הפה" של השואף.
- באמצעות מספריים לחתוך 1.5 מטר של צינור tygon מזהה ⅛ ", OD ¼". Cut לפחות 1 אינץ 'של קצה קצה 1 מ"ל חד פעמי micropipette. החזק חתיכת 1 ס"מ מרובע של רשת (פתיחה 0.196 אינץ ') על קצה לחתוך.
- הכן צינורות aliquot אבק. שוקלים כ 5 מ"ג של צבע צהוב מבריק על נייר במשקל שקוף. יוצקים את האבק לתוך צינור microcentrifuge 0.6 מ"ל לסגור בחוזקה את הכובע.
הערה: אנו מייעצים לשימוש כפפות ניטריל במהלך הכנה aliquot, כמו כמה כפפות לטקס חדיר לצבוע. - חזור על שלב 1.2) עבור כל דגימות בניסוי (אחד לכל זבוב בכל חדר).
- הכן אתנול (EtOH) צינורות: פיפ 1 מ"ל של EtOH 100% לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל. תווית צינורות עבור גנוטיפים או תנאים/ Li>
- חזור על שלב 1.4) עבור כל דגימות בניסוי (אחד לכל זבוב בכל חדר). שווי ולשמור את צינורות EtOH להשלמת assay הטיפוח. גם לכלול לפחות אחד "ריק" מדגם אשר יהיה רק 1 מ"ל EtOH ללא זבוב עבור שולטת שלילית.
- להרכיב כל חדר grooming ידי הברגה צלחת העליון מחליק (עם חורים קטנים), אבל משאיר את הצלחת התחתונה (עם חורים גדולים) הוסרו עבור תוספת של אבק.
- מניחים כל חדר השינה grooming הכרחי על השולחן עם הפנים למעלה למטה. הצד הזבוב של הכניסה הוא כלפי מטה.
- טען 5 מ"ג Brilliant צבע aliquot מבריק לתוך החדר על ידי הקשה על הצינור על פני השטח של החדר מעל הבאר הרצוי. הקש על החדר נגד השולחן כדי להבטיח כי כל האבק נופל דרך הרשת אל צלחת העליון.
- הברג את הצלחת התחתונה על כל חדר כזה הקצוות הרחבים של הפתחים חרוטי הפנים החוצה את החורים לא לנוח על הבארות. לאבטח את הבוטצלחת טום בחוזקה, כך שהוא לא להחליק ולשחרר צבע.
- הפוך את החדר מעל לדפוק אותו על השולחן כמה פעמים, כך האבק נופל דרך הרשת לנוח על הצלחת התחתונה.
- החלק את הצלחת העליונה של החדר לתוך "מיקום פתוח", כך חורים קטנים ליישר עם חמש עשרה בארות, המאפשר את כניסתם של זבובים לתוך בארות בודדים.
2. לטוס-אבק ו grooming
- טען זבוב אחד לתוך aspirator הפה על ידי מציצה בעדינות דרך קצה אחד של aspirator כאילו באמצעות קש. להפקיד את הזבובים על ידי נושבת קלות לכוון את הפתח לכיוון המטרה.
- לשאוב זבוב אחד לתוך כל משמש היטב עבור הניסוי. לאחר טעינת באר, החלק את הצלחת העליונה כך לטוס הוא לכוד בחדר קלטת במקום מעל הפתיחה של זה היטב במהלך הטעינה של החדר כולו כדי למנוע את הבריחה של הזבוב תוך טעינת בארות אחרות. אם זבובים מרובים הם aspirated לתוך סינגלובכן, להשאיר את הפתח חשף עד רק זבוב אחד נשאר.
- לאחר כל הבארות הדרושים מלאים זבובים, תהפכו את החדר כך את הצלחת התחתונה היא כלפי מעלה, כך אבק יש פוטנציאל מעיל את הזבובים על ידי נפילה דרך הרשת.
- מאובטח היטב את צלחות העליון והתחתון על ידי הידוק הברגים, ו מערבולת החדר לאבק את הזבובים במשך 4 שניות.
- לדפוק את החדר (צלחת העליונה כלפי מטה) על השולחן פעמיים כך צבע נופל אל הצד השני. לאחר מכן, להפוך את החדר מעל (צלחת העליונה כלפי מעלה) ולהפיל את החדר פעמיים כדי להבטיח צבע מתיישב על הרצפה של החדר התחתון הרחק זבוב שנערך בחדר העליון.
- עבור זבובים שליטה אשר אינם מורשים החתן, מיד להמשיך לשלב 3 של הפרוטוקול. עבור זבובים כי ישלים את assay, המשך לשלב 2.7.
- הניחו את החדר קאמרית על שולחן או משטח עם צלחת העליון כלפי מעלה במשך שלושים דקות כדי לאפשר זבובים לחתן. מניחים את התאאה רעש ורעש ללא שטח לשמור על הסביבה שלך קבוע לכל הניסויים grooming (רמות תאורה, לחות, טמפרטורה). אינקובטור שולחן ב RT או 25 ° C עם לחות שולט הוא אידיאלי.
3. הכנת דוגמאות וניתוח ספיגה
- שמירה על רמה קאמרית עם צלחת למעלה כלפי מעלה, בעדינות לפתוח את הצלחת התחתונה ולהסיר אותו מן החדר, נזהר לא לאבד צבע.
- מניחים את החדר על משטח פליי CO 2 עם זרימת אוויר נמוכה עד זבובים הם מורדמים.
- פתחו את צלחת העליון מהחדר. בזהירות להשתמש במלקחיים לתפוס רגל ולהזיז אחד לטוס אבק מכל חדר ולהפקיד אותו צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל EtOH. זמן ההעברה עבור 15 תאים כל אחד המכיל זבוב אחד הוא כ 3-5 דקות. הניסוי צריך גורם פעמים העברה אם / כאשר ניסויים מדהימים עם תאים מרובים כדי להבטיח היערכות יעילה של ניסויים. לאחר כל צינור microcentrifuge מכיל 1 לטוס, לסגור את מכסה ולהפוך את הצינור שלוש פעמים כדי לעורר ולערבב את הפתרון של צבע ואתנול.
- דגירה צינורות המכילים אתנול זבובים עבור 5 שעות ב RT כדי להבטיח הסרת מלאה של צבע מן לטוס לתוך פתרון. לאחר 5 שעות, במערבולת קצרה כל צינור (2) כדי להבטיח אישור של צבע מן הזבובים.
- Aliquot 50 μL של צינור 1.5 מ"ל ניסיוני לתוך באר של צלחת 96 גם אם זמין, לשים לב למיקום של כל מדגם על הצלחת. הוסף 200 μL של EtOH לדלל את המדגם 5x. הדילול נמנע השפעות התקרה של זבובים מאובקים בכבדות או פגמים גדולים grooming.
- השתמש הקורא צלחת לנתח כל מדגם ב 397 ננומטר. לחלופין, למדוד ספיגה עבור דגימות בודדים וחסר על ספקטרופוטומטר סטנדרטי בספקטרום גלוי אם קורא צלחת אינו זמין.
- לקרוא ולהקליט את המדגם דרך הקורא צלחת ולשמור את הגיליון האלקטרוני עם recordeד דוגמאות על הצלחת.
4. כימות התוצאות
- לקמפל תוצאות עבור כל הדגימות ולמדוד את השונות עבור כל גנוטיפ או מצב.
הערה: הצטברות צבע בזמן 0 דקות ובזמן 30 דקות נחשבים כתנאים נפרדים באמצעות ניתוח סטטיסטי על ידי ANOVA חד כיווני ותיקון Bonferroni או תיקונים אחרים עבור השוואות מקבילות מרובות. - חישוב הפרש אחוז ההבדל עבור כל גנוטיפ / תנאי באמצעות המשוואה הבאה: [(צבירת צבע אומר ערך בזמן 0 '- צבירת צבע מתכוון ערך בזמן 30') / צבירת צבע אומר ערך בזמן 0] x 100.
- להביע את אחוז עבור כל גנוטיפ ומצב של מגרשים בר להשוות בין גנוטיפים ותנאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay הטיפוח תשואות נתונים כמותיים כדי להעריך את הביצועים ההתנהגותיים על בסיס שארית יחסית של צבע שנצבר נותר על גופים של זבובים לאחר זמן מוגדר של המדידה לטיפוח (30 דקות). תמונות לדוגמה של עיצוב חדר השינה grooming השלבים העיקריים של assay מודגשים בתרשים 1 . זבובים לצבור כמות משמעותית של צבע מאבק מיידי על ידי vortexing בנוכחות צבע ( איור 2 ד, 2e ). זבובים אבק יכול לשמור על מגוון של הצטברות צבע שלאחר assay ( איור 2F, 2G ). לכן, solubilizing הצטברות צבע EtOH ו מדידה absorbance של דגימות בודדות מספק הערכה לשחזור רב מאוד של יכולת הטיפוח.
במחקר זה של DopR בתקנה של ginding hindleg, השווה את הביצועים grooming של היפומורף חזק (
כדי לחקור את ההבדלים להיותיכולות טווינת grooming foreleg לעומת hindleg תוכניות grooming, אנו העריכו ישירות הצטברות צבע על חלקי הגוף נפרדים במהלך הטיפוח ( איור 4 ). על ידי ניתוח הראש, הכנפיים, או "הגוף" (בטן / בית חזה / רגליים) של זבובים בודדים לאחר הניתוח, הצלחנו לאמוד באופן אמין הבדלים ודמיון בין גנוטיפים. הממצאים תמכו פרשנות כי אין הבדלים נכחו לתוכניות טיפוח רגל קדמית, כמו שאין הבדלים משמעותיים נצפו ראשי WT Vs. מוטציות DopR. עם זאת, הבדלים משמעותיים נצפו הן מדידות כנף והן הגוף בין גנוטיפים. זו טכניקה משלימה לבצע assay העיקרי על חלקי הגוף במקום זבובים שלמים מאפשר שיטה פשוטה להבחין בתחילה foreleg לעומת תוכניות hindleg grooming. תוצאות אלו היו מורחבות נוספת ונתמכת על ידי תצפיות התנהגותיות זהיר והקלטת וידאו או מעקב של רכיבים בודדים של הקדמית או hהתנהגויות לא אלגנטיות. כל התוצאות של איורים 2-4 משוכות באישור של Genes, Brain והתנהגות 15 .
איור 1: תסיסנית הטיפוח Assay זרימת עבודה. זה תרשים זרימה פשוטה מתאר את הצעדים העיקריים בפרוטוקול grooming, הדגשת כמה מן החומרים הדרושים וציוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: כימות של הטיפוח מבוסס על הצטברות Dye. ( א ) חדר הטיפוח. זבובים בודדים צבע צהוב מבריק ממוקמים בארות בודדים (1 לטוס: 1 גם). ממדיםו שרטוטים לייצור נתונים משלימים. ( B, d, f ) WT זכר תסיסנית (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 מבוגר זכר תסיסנית. ( B, c ) זבובים לפני האבק. ( ד, ה ) טס מיד לאחר אבק על ידי החדר vortexing, לפני הטיפוח (זמן: 0 דקות). ( F, g ) זבובים לאחר הטיפוח (זמן: 30 דקות). קנה מידה בר = 400 מיקרומטר. הודפס באישור גנים, מוח והתנהגות 15 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דופמין קולטן ( DopR / dDA1 / אילם ) נדרש עבור אפנון של התנהגות הטיפוח. ( א, ג, ה ) GroominG של wildtype (כחול) זבובים מוטציה (אדום / כתום) נמדד ב 0 דקות או 30 דקות לאחר אבק. SEM נמדדת עבור כל גנוטיפ ומצב. ( A, b ) n = 43 זבובים לכל גנוטיפ ומצב. (א) WT ו DopR f02676 עף הן התנהגות הטיפוח התערוכה (+ / + 30' לעומת + / + 0' = ערך p <0.0001, DopR f02676 30' לעומת DopR f02676 0' = ערך p <0.0001). זבובים DopR להיכשל החתן, כמו גם בעלי חיים WT ( DopR f02676 30 'לעומת + / + 30' = p ערך <0.001). אבקה חריפה של כל גנוטיפ ב 0 'תוצאות הצטברות שווה של אבק (ns = לא משמעותי). ( B, d, f ) הפרש אחוז הטבה מחושב עבור כל גנוטיפ (צבע לצבור ב 0 '- לצבוע לצבוע ב 30 / / לצבוע צבירה 0' x 100) מתן ערך יחסי להשוואת התנהגות grooming. ( ג ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
איור 4: דופמין קולטן פונקציה פוטנטיאטס Hindleg Grooming. ( א ) טיפוח של אזורים בודדים של WT (כחול) ו DopR F02676 / DopR f02676 (אדום) נמדד ב 30 דקות לאחר אבק ו לנתיחה הבאים. ערך p = לטעינת האגף = 0.0204. P = 0.0302. N = 33-35 זבובים לכל התנאים. SEM נמדדת עבור כל גנוטיפ ומצב. ניתוח סטטיסטי על ידי ANOVA דרך אחת ו תיקון Bonferonni. הודפס באישור גנים, מוח והתנהגות 15 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור משלים: שיטה חלופית עבור כימות חזותית של התנהגות Grooming באמצעות תמונה NIH J אינטנסיביות תוכנה פיקסל. ( א ) ויזואליזציה של wilDtype תסיסנית תחת היקף לנתח. Oval מגדיר הבטן הגב כמו באזור של ניתוח עבור עוצמת פיקסל. ( ב ) ויזואליזציה של הבטן הגב לאחר אבק עם אולטרה ירוק V10 צבע פיגמנט פלואורסצנטי. מסנן סטנדרטי עבור הקרינה הירוקה לוכדת את פיגמנט כחול ירוק. ( ג ) WT בעלי חיים לאחר ציפוי עם פיגמנט UGV10 (pregrooming). ( E ) WT בעלי חיים לאחר ציפוי עם פיגמנט UGV10 (postgrooming). ( D ) DopRf02676 מוטציה הומוזיגית לאחר ציפוי עם פיגמנט UGV10 (pregrooming). ( F ) DopRf02676 מוטציה הומוזיגית לאחר ציפוי עם פיגמנט UGV10 (שלאחר הטיפוח). ( G ) כימות עוצמת פיקסל לכל התנאים. N = 15 זבובים עבור כל גנוטיפ או מצב. ניתוחים סטטיסטיים על ידי ANOVA דרך אחת תיקון Bonferonni. Ns = הבדל לא משמעותי. *** מייצג ap <0.001. Plקלות לחץ כאן על מנת להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay הטיפוח הוא פשוט יחסית, אבל היינו הזהיר הניסויים להקדיש תשומת לב מיוחדת בנושאים הבאים. שמירה על חותם הדוק על ידי הידוק הברגים על צלחות העליון והתחתון לאחר החדרת זבובים וצבע הוא חיוני עבור תוצאות לשחזור. צבע צהוב מבריק הוא מאוד בסדר המפרקים רופפת יאפשר הפסדים של צבע מקצוות החדר. אי סדירות התוכן לצבוע עבור כל טוב יכול בקלות לזרוק את כימות הטיפוח כמו אבק לא אחיד יגדיל את השונות ואת שיעורי חיוביות שווא עבור אירועי הטיפוח. בנוסף אנו מעודדים את הניסויים להיות מודעים לסביבה שבה הם בוחרים להחזיק את החדר grooming במהלך 30 דקות grooming תקופה. איכות הסביבה של טמפרטורה, תאורה, שעה של יום ולחות חיוניים עבור ביצועים עקביים עבור מבחני תסיסנית התנהגות. החזקת חדרי הטיפוח בתוך חממה קטנה כדי למזער את o distractingR סביבות מעבדה משתנה אידיאלי לשחזור מקסימלי של תוצאות, אבל סידורים מרחביים אחרים יכולים גם להיות מוצלחים.
לגבי מדידות הצטברות צבע, ראינו כי צבע חדיר לכפפות לטקס, כך כפפות ניטריל עדיפים לטיפול ושקילת אבק. הקפד לא להפיץ אבק נרחב על פני משטחי מעבדה, כפי שהוא יהיה בקלות כתם בגדים פוטנציאליים מזהמים משטחים או ציוד. בידוד אזור אחד אחד לטוס תחנת / CO 2 כרית עבור ניסויים עדיף להכיל חשיפה לצבוע. אנחנו גם מעודדים את הניסויים כדי להיות בטוח להשתמש UV שקוף 96-גם צלחות. שיא ספיגה 397nm עבור צבע צהוב מבריק הוא ליד ספקטרום UV, תקן 96 צלחות טוב עשוי לתת חלש או לא מדויק אמצעים דילולים צבע. צבע הוא גם מסיס במים כחלופה EtOH. עם זאת, תסיסנית לא לשקוע בקלות במים ללא vortexing משמעותי בועות אוויר קטן אלוNg הגוף של בעלי חיים צבוע להראות עקביות נמוכה יותר מסיסות של צבע. אתנול מציג תוצאות טובות יותר באופן עקבי והשונות נמוכה יותר בהשוואה ישירה.
Assay שלנו יכול להיות שונה בקלות עבור טכניקות משלימות מחקרים מעודן יותר, כגון דיסקציה של הגוף לעוף שלאחר assay ( איור 4 ). תוספי מזון אלה עשויים להיות נחוצים כדי להבין אילו צעדים הטיפוח מושפעים, כמו הצטברות צבע רק באופן רחב מצביע על שינויים התנהגותיים מבלי להתייחס ישירות הגורם הביולוגי הבסיסי או עצבי. לאחר ההבדלים נצפו, ניסויים מקבילים באמצעות הקלטת וידאו או שיטות תצפית ישירה חיוניים בהבנת השורש ההתנהגותי של כל ההבדלים ביעילות הטיפוח. זה יכול להיחקר עוד על ידי כימות חזותי של הצטברות חלקיקי אבק על חלקי גוף ספציפיים באמצעות אמצעים אינטנסיבית פיקסל דרך תוכנית NIH ImageJ, יחד עם מעקב ישיר של foreleg ו hindlegהתנהגויות על ידי הקלדת קטעי וידאו. לגבי שיטות חלופיות לכימות חזותי של אבק פלואורסצנטי, ניסויים מוקדמים במעבדה ניצלו פיגמנט צבע ניאון נגזר אלקליין נדיר כדור הארץ מתכת סיליקט-אלומינט אוקסיד אירופיום. לאחר אבקת הזבובים עם פיגמנט צבע ניאון ו anaesthetizing או לערוף את החיות לאחר הטיפוח, הגופים ניתן להקליט ונותחו על ידי מיקרוסקופ דיגיטלי באמצעות מסנן פלואורסצנטי תקן עבור GFP על היקף לנתח ( נתונים משלימים ). בעוד שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של עוצמת פיקסל מקבילים את התוצאות שנצפו באמצעות צבע מבריק צהוב, מצאנו כי התפוקה של שיטה זו היא איטית יחסית את חלקיקי פיגמנט להשתנות במקצת בגודל והם פחות אחיד מאשר ציפוי שנצפה עבור מבריק צבע צהוב. עם זאת עבור כמה יישומים ניסיוניים שיטה חלופית זו היא ראויה, ויש מגוון משמעותי זמין פלואRescent צבעים שיכולים להיות שימושי עבור תסיסנית ויישומים nondrosophila או ניסויים אבק איטרטיבי שבו כימות של אירועים נפרדים הם חיוניים. יש לציין כי צבע הפיגמנט עצמו הוא מסיס במים אך מאבד במהירות את הקרינה שלו במים, בחומרה handicapping השירות של פיגמנט זה עבור אמצעים ספיגת תקן.
סוגים אלה של שיטות מיקוד ספציפי foreleg או hindleg grooming האירועים חיוניים להבנת הטבע המדויק של פנוטיפ ועשויים להדגיש מעגלים עצביים פוטנציאליים או תוכניות תנועה כדי לחקור עוד יותר. בנוסף, עבור ניסויים בקרה מקביל, זה חיוני כדי לשלול את הפוטנציאל הלא ספציפי סיבות התנהגותיות הטיפוח יכול להיות מושפע. אם בעלי חיים מציגים גירעונות מוטוריים נרחבים או חריגות, ייתכן כי גירעונות הטיפוח הם משניים פנוטיפים של תנועה רחבה. פשוט מעקב וידאו של בעלי חיים WT לעומת מוטציה או סיבCuit תנאים מניפולציה יכול בקלות להבחין בין משמרות גדולות במהירות או מרחק הכולל נסע, ללא תלות גירעונות הטיפוח.
Assay הטיפוח היא שיטה תכליתי מתאים למחקרים קטנים בקנה מידה גדול של תוכנית זו מורכבות רב multistep תנועה; את העיצובים הם השתנו בקלות להגדיל מימד קאמרי או מספר 15 . השיטה מניבה נתונים כמותיים חזקים, אידיאליים להערכה השוואתית של יכולת הטיפוח של הזבובים. הייצור של החדרים הוא חסכוני, והוא יכול להיעשות באמצעות מכונות שונות רבות (3D מדפסות, חותכי לייזר, טחנות CNC) בהתאם למשאבים הזמינים. הטכניקה מאפשרת תפוקה בינונית של דגימות בודדות שניתן להרחיב בקלות עבור מסכים גנטיים ומחקרי מיפוי מעגלים פונקציונליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות בריאן שפרד, טאט אודומריטרוג'רוג, אהרון ויללי, רובי פרום, אליס פיטמון, ורד הדרין לעבודה מוקדמת בבדיקות והקמת מתודולוגיה זו עיצובים קאמריים. אנו מודים לקלי טלז ולגרהם בוקאן על קריאה ועריכה של כתב היד. אנו מודים אנדרו זרעים וג 'ולי סימפסון על העבודה החלוצית שלהם ואת העצה שלהם ואת התמיכה בהצעה להשתמש Brilliant צהוב Dye (Sigma). עבודה זו נתמכת בין השאר על ידי מרי א 'גרוף כירורגית מחקר רפואי קרן חינוך, מרכז המדע ברונפמן, ואת תוכנית עמיתי הלמן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
