Summary
Här introducerar vi en ny teknik avsedd att registrera elektroencefalografi (EEG) hos frittflyttande neonatala epileptiska valpar och beskriva dess förfaranden, egenskaper och tillämpningar. Med den här metoden kan man registrera EEG i mer än en vecka.
Abstract
EEG är en användbar metod för att detektera elektrisk aktivitet i hjärnan. Dessutom är det ett allmänt använt diagnostiskt verktyg för olika neurologiska tillstånd, såsom epilepsi och neurodegenerativa störningar. Det är emellertid tekniskt svårt att få EEG-inspelningar hos nyfödda eftersom det kräver special hantering och stor omsorg. Här presenterar vi en ny metod för att registrera EEG hos nyfödda råttappar (P8-P15). Vi konstruerade en enkel och pålitlig elektrod med hjälp av datorns stiftposi; Det kan enkelt implanteras i en råttavalps skalle för att registrera EEG-signaler av hög kvalitet i normal och epileptisk hjärna. Valpar fick en intraperitoneal (ip) injektion av neurotoxinkaininsyra (KA) för att inducera epileptiska anfall. Den kirurgiska implanteringen utförd i denna procedur är billigare än andra EEG-procedurer för nyfödda. Med den här metoden kan man registrera högkvalitativa och stabila EEG-signaler i mer än en vecka. Vidare kan denna procedur också tillämpas på vuxen raTs och möss för att studera epilepsi eller andra neurologiska störningar.
Introduction
Det är väl etablerat att kontinuerlig kommunikation mellan neuroner krävs för att få normal hjärnfunktion. Den interneuronala kommunikationen sker primärt vid synapser, där information från en neuron överförs till en andra neuron. Denna synaptiska överföring är medierad av två typer av dedikerade strukturella arrangemang: elektriska eller kemiska synapser 1 . Elektrofysiologi är det fält som fångar den elektriska potential som produceras under internuronal kommunikation som styr övergripande kroppsfunktioner och beteende 2 . EEG är den vanligaste metoden bland många elektrofysiologiska tekniker.
EEG är en teknik som används för att detektera förändringar i elektriska signaler som produceras av interna eller yttre stimuli. Dessutom är det ett viktigt test för klinisk diagnos och utfallsprognos av olika neurologiska tillstånd, såsom epilepsi, Parkinsons och Alzheimers sjukdomarE, samt effekter av farmakologiska och toxikologiska medel 3 . I allmänhet visar en epileptisk patient hyperexcitabilitet och nedsatt funktionell anslutning i hjärnan; Dessa sammanfattas som interictala epileptiformutsläpp (IED) och kan registreras av EEG i form av skarpa, övergående spikar; Skarpa vågor; Spik-vågkomplex; Eller polyspikes 4 . Huvuddelen av epileptiska hjärnan är den spontana förekomsten av epileptiska anfall, som kan registreras antingen från hårbotten eller från hjärnparenchymen för att lokalisera hjärnområdet som är ansvarigt för anfallen 5 . Vidare har EEG också mycket viktiga implikationer i neurodegenerativa störningar som Alzheimers sjukdom (AD). Forskning tyder på att förändrade EEG-inspelningar och försämrade oscillatoriska nätverk hos AD-patienter är vanliga. Men vår kunskap om patofysiologin hos nätverksoscillationer i neurodegenerativa sjukdomar iS förvånansvärt ofullständig och behöver undersökas ytterligare 6 .
I detta protokoll har vi konstruerat en enkel elektrod med vilken man kan registrera EEG för att förstå den elektriska kommunikationen i både den normala och den patologiska hjärnan. Den kirurgiska implanteringen i denna metod är billigare än andra tillgängliga procedurer 7 . Dessutom kan denna metod användas för att registrera högkvalitativa och stabila EEG-signaler för längre tidsramar ( dvs. 2-4 timmar varje dag i 1 vecka). Dessutom använde vi lättare elektroder (väger ca 26 mg) som gör att djuren kan uppträda mer naturligt 8 . Denna metod är allmänt tillämplig på studien av EEG hos neonatala råttor som kräver förstärkaren och digitaliseraren, som vanligtvis används i elektrofysiologilaboratoriet och kräver inga ytterligare enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård, kirurgiskt ingrepp och inspektionsförfaranden var i överensstämmelse med riktlinjerna för Animal Care and Use Committee i Södra Kina.
1. Elektrodeberedning (Figur 1A-C)
OBS: Datorpinnen loci är helt enkelt en ledad kontakt som en del av signalgränssnittet i kommunikationsenheter. Den består av en manlig kontakt som pluggar in i honkontakten.
- Separera försiktigt man- och honstiften från datorns stiftposi ( Figur 1A ) med hjälp av en stift. Anslut man- och honstiften tillsammans för att bilda en elektrod och applicera cyanoakrylat för att skapa en stark limning ( figur 1C ).
- Sätt elektroderna i en bägare fylld med destillerat vatten och lägg det till ultraljudsrengörare i 10 minuter. Flytta dem till en torkugn vid 45 ° C i 30 minuter. Sterilisera elektroderna med UV-ljus i 30 minuter.
2. Kirurgiskt förfarande (Figur 1D-F)
- Förbered de steriliserade kirurgiska instrumenten och stereotaxiska apparater. Bedöva den neonatala råttavalpen med användning av isoflurananestesi (2,5%) med luft. När pupen är djupt bedövad, justera dosen av isofluran till 1,0%. Utför en svans eller tå nypa före operationen för att säkerställa korrekt däck av anestesi.
- Fix pupen på den stereotaxiska apparaten genom att placera öronstängerna i öronkanalerna och lätta dem åt.
OBSERVERA: Dra inte öronstången för hårt, eftersom neonatalskallen är väldigt mjuk. - Underhålla det sterila kirurgiska fältet genom att spruta all utrustning med 70% etanol. Gör ett 15 mm snitt på huvudet med en skalpell. Använda tångar, dra försiktigt hårbotten bort från mittlinjen vid de fyra hörnen. Lägg lite saltlösning i bomull under huden för att hålla snittet öppet ( Figur 1D ).
- Hitta bregma och lambda poäng på skallenOch markera dem med en penna. Använd en sprutnål (26 G) för att göra två burrhål i prefrontal cortex (PFC) och hippocampus.
OBS: PFC ligger vid +1,8 mm bakom bregma och -0,5 mm i sidled till mittlinjen, medan hippocampus ligger vid -2,0 mm främre mot bregma och ± 0,5 mm i sidled till mittlinjen ( Figur 1D och E ). Djupet på elektroden ska inte vara mer än 2 mm under den kortikala ytan för att minimera hjärnskador. - Använd tång för att hålla elektroderna och sätt in referens- och inspelningselektroderna i respektive PFC och hippocampus. Applicera erytromycinsalva runt elektroden för att undvika eventuell infektion. Fixera elektroden med cyanoakrylat.
- Förbered dental akrylcement så att den har en limig och viskös konsistens. Applicera tandcementen för att täcka elektroderna och resten av skallen.
OBS: Torka noggrant skalle innan du applicerar tandcementen. Applicera 5% pikrinsyra på elektroderna för att skydda dem.
OBS! Hela proceduren bör ske i en biosäkerhetskåpa för att upprätthålla sterila förhållanden. - Ta bort djuret från den stereotaxa ramen och injicera 300 μL 10% glukos subkutant. Placera den på en uppvärmd filt för återhämtning. Se till att djuret är varmt (37 ° C) och ambulerande ( dvs helt återhämtat). Administrera buprenorfin intraperitonealt (0,05 mg / kg) för postkirurgisk smärta.
OBS: Lämna inte ett djur obevakat förrän det har återvunnit tillräcklig medvetenhet (dvs normalt beteende och rörelse). - Återvänd valpen till sin hemmabur med sin damm efter att det återvinner medvetandet. Vänta i två dagar tills djuret är helt återhämtat.
3. EEG-inspelning
- Efter full återhämtning, anslut elektroderna implanterade på skallen av pupen till förstärkaren i sin egen bur. Anslut förstärkaren till en analog-digital cOmformare och fäst omvandlaren till en dator; Förbindelseledningarna ska behandlas noggrant så att de inte blir trassliga.
- Välj minst 10 000 Hz samplingsfrekvens på datainsamlingsenheten för inspelning (sändarens bandbredd är 1-100 Hz). Se till att uppgifterna samplas ordentligt.
- Efter att ha fått baslinjen inspelning, injicera pupen intraperitonealt med kaininsyra (KA) (2 mg / kg) för att inducera epileptiska anfall. 15 min efter KA-injektionen observera och registrera epileptiska urladdningar. Beslagsprocesser genom KA är vanligtvis fysiska.
OBS: Den ictal-toniska varaktigheten är cirka 15,2 ± 0,9 s, beslagslängden är ca 62 ± 5 s. Beslag kan förhindras i neonatal råtta genom att ge IP-injektion av klorhydrat (400 mg / kg). - Spara den digitaliserade data och analysera den med hjälp av signalbehandlingsprogramvarupaket, som spike2. Reveal effektnivån för olika frekvenskomponenter i neonatal EEG-signalen med perfOmformning av en effektspektrumanalys. Beräkna effekten i en 1-min tidsram genom att hitta den roten-medel-kvadratiska amplituden från 1 till 100 Hz (EEG-band) 9 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om ovanstående kirurgiska ingrepp utförs på ett korrekt sätt, kommer en neonatal pup EEG-inspelning med en råtta att utföras framgångsrikt. 10 min efter KA-injektionen uppstod ett vanligt beteendemönster i form av oregelbundna rörelser och repor, skakningar och förlust av balans. Figur 2 visar de representativa råa EEG-spåren och interictala, ictal-toniska och ictal-kloniska expanderade spåren. Återkommande interictala och ictal EEG urladdningsmönster började 15-60 min (30 ± 5,2 min, medelvärde ± SEM) efter KA-injektion ( Figur 2A och 2B ). Figur 2D och 2E representerar tonisk-kloniska anfall som är den vanligaste typen. Den ictal toniska varaktigheten varade 15,2 ± 0,9 s ( Figur 2D ). De representativa resultaten visade att toniska urladdningar följdes av kloniska utbrott ( Figur 2B, 2D och 2E).
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Illustration av kirurgisk implantationsprotokoll. ( A ) Liten datorstiften. ( B ) Kvinna stift (vänster) och manstift (höger). Skalafältet används för att mäta längden på honpinnen. ( C ) Connected kvinnlig och manlig stift. ( D ) Utsatt skalle. Nr 1 presenterar referensplatsen, nr 2 presenterar Bregma, nr 3 och 4 nuvarande inspelningsställen, och nr 5 presenterar lambda. ( E ) Elektrodeimplantation. Nr 1 presenterar referenselektroden, nr 3 och 4 presenterar inspelningselektroden. ( F ) Återvunnen råtta valp (P9). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Figur 2: KA-inducerad Neonatal Seizure. ( A ) Ett representativt EEG-spår från en P10-råtta som injicerades med KA (2 mg / kg, ip) visade återkommande epileptiska utbrott. ( B ) Fördjupad syn på enskilda klusterliknande epileptiska utsläpp från lådan i A. ( C , D och E ). Typiska interiktala, ictaltoniska och ictal-kloniska spår utvidgas från lådan i B. ( F ) Sammanfattad data som visar Den genomsnittliga EEG-effekten (1 minutersfönster) före och efter KA-injektionen (medelvärde ± SEM). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: EEG-inspelningsinställningar. Representativ spårinspelning är shoWn i fritt rörlig neonatal råtta pup. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här rapporterar vi kirurgiska och inspelningsförfaranden för att förvärva EEG hos fritt rörliga neonatala råttor med hjälp av trådbunden metod ( Figur 3 ). Det har föreslagits att P7-P12 råtta pupen är i utvecklingsåldern som motsvarar en heltids mänsklig nyfödd 10 , 11 . Det är tekniskt svårt att få EEG-inspelningsdata av hög kvalitet när man arbetar med råttor i denna åldersgrupp. Dessutom krävs specialiserad hantering och stor omsorg 8 .
Tidigare studier som granskar in vivo EEG-inspelningar hos neonatala råttor har utförts med användning av trådbundna inspelningslösningar hos P12 eller äldre djur 12 , men dessa metoder är mycket kostsamma. Genom att förlita sig på enkla elektroder har vi kunnat göra en elektrod ( Figur 1 ) som minskar kostnaden för försöket till så lite som $ 1 samtidigt som det ger hög densitet EEGinspelningar. Kirurgisk implantering i denna metod kan ta så lite som 10 minuter, beroende på kirurgiets komplexitet.
De kritiska stegen i detta protokoll är implantation av elektroder. Det bör göras noggrant. För att upprätthålla konstant kontakt av elektroden med skallen är följande steg viktigt att överväga. För det första, ta bort vävnadsskräp på skallen med hjälp av steriliserad bomullspinne eftersom det kan sätta ut elektroden från skalle. För det andra, använd cyanoakrylat ordentligt för att fästa elektroden med skallen. För det tredje, behåll dentalcementens tillräckliga viskositet. Det är bättre att applicera dentalcement i två lager; Första skiktet ska vara lite tätt för att täcka skallen medan det andra skiktet ska vara lite rinnande för att täcka hörnen på det första skiktet. Tryck försiktigt på dentalcementen med en pipettspets för att slå ner den för att göra det starka bindemedlet. Om det är för vattent kan det bygga ett isolerande lager under elOde, och om det är för tätt, kommer dentalcementen lätt att falla av skallen på grund av sin egen vikt. Det är också viktigt att behålla vallens kroppstemperatur vid 37 ° C under operationen för överlevnad.
Tillämpningen av denna procedur är begränsad till registrering av EEG hos nyfödda råttappor mellan åldrarna P8 och P15 eftersom de växande valparna kan ta bort dentalcementen och elektroden från deras skalle. När det gäller ytterligare tillämpningar kan denna metod också användas för att registrera den elektriska aktiviteten hos vuxna råttor och möss efter mindre modifiering. Dessutom låter den här metoden sig bra att använda i olika beteendexperiment, såsom den förhöjda plus labyrinten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation of China (31171355) och Guangdong Science Foundation (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
