Summary
مهام دخلول المبكر تعتمد على بلمرة الأكتين و. هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة للكيمياء الحيوية والوراثية التلاعب.
Abstract
العديد من الدالات دخلول المبكر، لا سيما البضائع البروتين الفرز والغشاء تشوه، تعتمد على بقع من خيوط الأكتين و القصيرة المنبسطة على الغشاء اندوسومال. وقد أنشأنا المستندة إلى الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة الوراثية والبيوكيميائية التلاعب. الكسور اندوسومال يعدها التعويم في التدرجات السكروز من الخلايا معربا عن البروتين اندوسومال المبكر RAB5 التجارة والنقل. وتعد كسور سيتوسوليك من مجموعات منفصلة من الخلايا. اندوسومال والكسور سيتوسوليك يمكن تخزينها مجمدة في النتروجين السائل، إذا لزم الأمر. في التحليل، تختلط اندوسومال والكسور سيتوسوليك، وهي المحتضنة المخلوط في 37 درجة مئوية تحت الظروف الملائمة (مثلاً، الأيونية القوام، الحد من البيئة). في الوقت المطلوب، الخليط رد الفعل هو ثابت، وهو كشف والاكتين مع فالويدين. ثم يتم تحليل التنو أكتين والبلمره بالفحص المجهري الأسفار. هنا، نحن التقرير أنه يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في دور العوامل التي تشارك أما في نويات أكتين على الغشاء، أو في استطالة اللاحقة، التفريع، أو كروسلينكينج من خيوط الأكتين و.
Introduction
في الخلايا حقيقية النواة أعلى، يتم استيعاب البروتينات والدهون في اندوسوميس المبكرة التي يحدث فيها الفرز. بعض البروتينات والدهون، التي تتجه إلى أن تكون تستخدم، يتم دمج المناطق أنبوبي من اندوسوميس المبكر وثم تنقل إلى غشاء البلازما أو غولجي عبر الشبكة (TGN)1،2. على النقيض من ذلك، البروتينات والدهون الأخرى يتم تعبئتها بشكل انتقائي في مناطق اندوسوميس المبكر الذي يحمل مظهر مولتيفيسيكولار. توسيع هذه المناطق، ولدى مفرزة من أوائل اندوسومال الأغشية، ناضجة في نهاية المطاف إلى حويصلات الناقل اندوسومال الحرة أو الهيئات مولتيفيسيكولار (التحويل الرأسي الخارجي/مفبس)، التي هي المسؤولة عن نقل البضائع نحو أواخر اندوسوميس1، 2.
أكتين يلعب دوراً حاسما في عملية يعيد غشاء المرتبطة بقدرة الفرز اندوسومال ونشوء حيوي دخلول. الفرز على طول مسارات إعادة التدوير لغشاء البلازما أو TGN البروتين يعتمد على ريترومير المعقدة والبروتينات المرتبطة بها. هذه الآلية الفرز ويبدو أن تكون مقترنة بتشكيل الأنابيب إعادة التدوير عن طريق تفاعلات ريترومير المعقدة، مع دبور وندبة المناظرة (غسل) أكتين المعقدة وتشعبت3،4،5 . على النقيض من ذلك، جزيئات متجهة إلى التدهور، لا سيما تنشيط مستقبلات الإشارات، يتم فرز في الحويصلات intraluminal (إيلفس) من اندوسومال الفرز مجمعات المطلوبة للنقل (اسكرت)2،6، 7. واو-أكتين بينما لا يعرف الدور المحتمل أكتين في عملية الفرز المعتمدة على اسكرت، يلعب دوراً مهما في نشوء حيوي للتحويل الرأسي الخارجي/مفبس والنقل خارج اندوسوميس المبكر. على وجه الخصوص، وجدنا أن أنيكسين A2 يربط المناطق الغنية بالكوليسترول دخلول المبكر، وجنبا إلى جنب مع spire1، نوكليتيس بلمرة الأكتين و. ويتطلب تشكيل شبكة أكتين تشعبت يحتفل في اندوسوميس النشاط المتفرعة من البروتين المتصلة أكتين (ARP) 2/3 معقدة، فضلا عن موسين البروتين ERM والبروتين ملزمة أكتين كورتاكتين8،9.
هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار. وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا للتحقيق في دور أنيكسين A2 في نويات واكتين وموسين وكورتاكتين في تشكيل اندوسومال أكتين شبكات8،9. بهذا البروتوكول في المختبر ، سلسلة معقدة من التفاعلات التي تحدث في اندوسوميس أثناء بلمرة الأكتين تصبح قابلة لتحليل الكيمياء الحيوية والجزيئية لخطوات متسلسلة من هذه العملية، بما في ذلك التنو أكتين، الخطي بلمرة والمتفرعة، وكروسلينكينج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الحلول والأعمال التحضيرية
ملاحظة: ينبغي إعداد كافة المخازن المؤقتة والحلول في المقطر مزدوجة (دد) H 2 o. نظراً لحالة ترطيب السكروز ويختلف تركيز جميع السكروز الحلول النهائية يجب أن تحدد استخدام إنكسار.
- تحضير فوسفات مخزنة المالحة دون divalent الكاتيونات (برنامج تلفزيوني-): 137 مم ناجي، 2.7 مم بوكل، 1.5 مم خ 2 ص 4، ومم 6.5 غ 2 هبو 4. قم بضبط ال pH إلى 7.4. تعقيم بالتعقيم (1 دورة في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-
- إعداد الأوراق المالية حل ايميدازول 300 ملم: 0.204 ز ايميدازول في 10 مل من O.Adjust pH إلى 7.4 في 4 درجات مئوية باستخدام تعقيم HCl. تصفية باستخدام 0.22 ميكرومتر المسامية تصفية الحجم وتخزينها في 4 ddH 2 درجة مئوية.
- التجانس إعداد المخزن المؤقت (غبطة؛ إعداد حوالي 100 مل): السكروز 250 ملم في ايميدازول 3 مم. قم بضبط ال pH إلى 7.4 في 4 درجات مئوية باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. تعقيم عامل تصفية باستخدام عامل تصفية حجم 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها في 4 ° تكملة جيم غبطة فقط قبل الاستخدام مع مزيج مثبطات البروتياز في تركيزات النهائي الموافق 10 مم ليوبيبتين وألف بيبستاتين 1 ملم 10 نانوغرام/مل أبروتينين.
- للتدرجات التعويم خطوة، تعد 62%، 39%، وحلول السكروز 35% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4، كما هو موضح أدناه. تحدد دقة تركيز جميع حلول السكروز باستخدام إنكسار النهائية-
- إعداد 100 مل من محلول السكروز 62% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. تذوب بإثارة ز 80.4 السكروز في ddH 2 س قبل تسخينها إلى 35 ° جيم إضافة 1 مل من 300 ملم ايميدازول حل الأسهم والتعبئة إلى 100 مل مع ضبط O. ddH 2 pH إلى 7.4 في 4 ° تعقيم جيم عامل تصفية باستخدام تصفية حجم المسام ميكرومتر ومخزن 0.22 في 4 درجات مئوية. إعداد
- 100 مل محلول السكروز 35% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. حل من خلال إثارة ز 40.6 السكروز في ddH 2 o. أضف 1 مل من محلول الأسهم ايميدازول 300 ملم وملء إلى 100 مل مع ضبط O. ddH 2 pH إلى 7.4 في استخدام درجة تعقيم تصفية جيم 4 0.22 ميكرومتر المسامية تصفية الحجم وتخزينها في 4 ° C.
- إعداد 50 مل سكروز 39% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. تمييع محلول السكروز 62% مع محلول السكروز 35%. مخزن في 4 درجات مئوية.
- حل الجيل الثالث 3g بارافورمالدهيد (PFA) بالتحريك في 100 مل من برنامج تلفزيوني-قبل وارميد إلى 60 درجة مئوية مع إضافة 1 م هيدروكسيد الصوديوم dropwise؛ وضبط الأس الهيدروجيني النهائي إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم عامل تصفية باستخدام عامل تصفية حجم 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها في-20 درجة مئوية.
تنبيه: 3% منهاج عمل بيجين كاشف سامة. - حل "بوكل م 1 إعداد" المخزون. حل ز 3.73 من بوكل بالتحريك في 50 مل من ddH 2 تعقيم O. عامل تصفية باستخدام عامل تصفية حجم 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-
- تحضير 50 س تتركز الأسهم محلول يحتوي على 0.625 "حبيس م" على درجة الحموضة 7.0 و 75 مم مجواك 2 في ddH 2 قاسمة سين ومخزن في-20 درجة مئوية.
- إعداد متزايدة المتوسطة. مزيج من إثارة ز 2.4 من poly(vinyl alcohol) م ث ~ 31,000 (PVA) مع ز 6 من الجلسرين. إضافة 6 مل من ddH 2 س وترك على الأقل 2 ح في درجة حرارة الغرفة. إضافة 12 مل 0.2 M تريس-Cl (pH 8.5) والحرارة إلى حوالي 53 درجة مئوية مع إثارة العرضية حتى قد حلت بولي-
- توضيح الحل باستخدام الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع المادة طافية وإضافة 2.5% (w/v) 1، 4--ديازابيسيكلو--[2.2.2] أوكتان (دابكو) لمنع فوتوبليتشينج أثناء الكشف عن الأسفار. دوامة لحوالي 30 ثانية حل. اليكووت إلى 1.5 مل أنابيب بلاستيكية ومخزن في-20 درجة مئوية.
2. خلية ثقافة
- خلايا "هيلا الثقافة" في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10 ٪، 10 ٪ الأحماض الأمينية غير الضرورية، 10% ل الجلوتامين، والبنسلين-ستربتوميسين 1%. الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في 5% CO 2 حاضنة.
- ترانسفيكت الخلايا 24 ساعة قبل التجربة مع بروتينات فلورية خضراء-RAB5 10، استخدام كاشف تعداء التجارية وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-
- عند الحاجة إليها، إعداد الكسور اندوسومال وسيتوسول من الخلايا المنضب بروتين الفائدة (أي، باستخدام [رني] أو كريسبر/Cas9) و/أو overexpressing نموذج wildtype أو المسخ من بروتين الفائدة.
3. إعداد جزء اندوسومال
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول مباشرة إعداد سوبسيلولار الكسور التي تحتوي على اندوسوميس والأغشية الخفيفة الأخرى. دخلول المنقي الكسور إذا لزم الأمر، يمكن أيضا أن تستخدم 11. إعداد أطباق بيتري 2 (10-سم القطر الخارجي؛ 57 سم 2) خلايا المتلاقية معربا عن التجارة والنقل-RAB5 كابتداء من المواد. العدد الإجمالي لخلايا هيلا المتلاقية في أطباق بيتري 2 يقابل تقريبا 2.5 × 10 7 الخلايا. عند الحاجة، اندوسوميس يمكن أيضا إعداد من الخلايا التي استنفدت من البروتين الفائدة (أي، باستخدام [رني] أو كريسبر/Cas9) و/أو overexpressing نموذج wildtype أو المسخ من بروتين الفائدة، ودائما الإعراب عن التجارة والنقل-RAB5-
تنبيه: ينبغي إجراء جميع الخطوات للبروتوكول تجزئة على مدت
- وضع أطباق بيتري على لوحة معدنية رطب في دلو الجليد شقة ويغسل فورا الخلايا مرتين مع 5 مل من المثلج برنامج تلفزيوني-- إزالة كل برنامج تلفزيوني-من الغسيل آخر
- وأضف 3 مل من برنامج تلفزيوني المثلج-كل طبق. لا ينبغي أن تجف الخلايا أثناء التعامل مع: إذا لزم الأمر، بوضع دلو الجليد على منصة هزاز تكون كافية لتغطية الخلايا بالسائل-
- ميكانيكيا إزالة الخلايا في برنامج تلفزيوني من أطباق بيتري استخدام شرطي مطاطية مرنة (أي، مكشطة خلية محلية الصنع). كشط الخلايا خارج الأطباق أولاً في حركة دائرية، سريعة حول خارج الطبق، متبوعة حركة نحو انخفاض في منتصف الطبق. كشط برفق للحصول على " أوراق " الخلايا المرفقة. نقل الخلايا باستخدام ماصة باستور بلاستيك مع فتحه واسعة لأنبوب 15 مل البوليبروبيلين مخروطية في مدت بلطف
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في العاشر 175 غ و 4 درجة مئوية.
- برفق إزالة المادة طافية (SN) وإضافة 1-3 مل من خضاب الدم لبيليه. استخدام ماصة باستور بلاستيك مع فتح على نطاق واسع، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مرة واحدة ريسوسبيند الخلايا.
- الطرد المركزي لمدة 7-10 دقيقة في 1,355 x ز و 4 ° "جيم بلطف" إزالة التعطيل.
- إجراء تجانس الخلية.
ملاحظة: شروط ينبغي لطيف حيث أن الأغشية البلازمية للخلايا مكسورة ولكن اندوسوميس تبقى على حالها.- إضافة وحدة تخزين معروفة غبطة مع مثبطات البروتياز على كل خلية بيليه (حوالي 100 ميكروليتر كل خلية بيليه). استخدام ميكروبيبيتي 1,000-ميليلتر، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حتى يتم حراكه الخلايا. لا إدخال فقاعات الهواء-
- إعداد حقنه السلين 1 مل بإبرة ز 22 مشطوف مسبقاً بغبطة وخالية من الهواء أو الفقاعات.
- ملء المحاقن مع تعليق خلية ببطء نسبيا (لتجنب خلق فقاعات الهواء)، ووضع طرف مشطوف من الإبرة ضد جدار الأنبوبة، وطرد تعليق خلية سريعاً لقص إيقاف الأغشية البلازمية للخلايا المرفقة.
- قاسمة صغيرة من هوموجيناتي (حوالي 3 ميليلتر) وتمييع في 50 ميليلتر من خضاب الدم على شريحة زجاجية. مزيج، وتغطي مع ساترة زجاج. تفقد هوموجيناتي تحت مجهر على النقيض مرحلة مجهزة X 20 أو 40 س الهدف.
ملاحظة: تحت الظروف المثلى، معظم خلايا مكسورة، لكن نوى، التي تظهر رمادي داكن وجولة الهياكل، ليست ( الشكل 1). - تكرار الخطوة 3.7.3 و 3.7.4 حتى معظم خلايا مكسورة؛ وعادة، 3-6 ضربات صعودا ونزولاً عن طريق الإبرة ضرورية. الاحتفاظ قاسمة صغيرة (10-30 ميليلتر) من هوموجيناتي لتحديد البروتين.
- هوموجيناتي الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 1,355 س ز و 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، بيليه (يعرف بيليه النووية؛ NP) يحتوي على النواة والمادة طافية (ويعرف المادة طافية بوستنوكليار؛ السندات الإذنية) يتضمن في سيتوسول والعضيات الإفراج عند تجانس وفي تعليق مجاناً- - بعناية جمع السندات الإذنية. تبقى مختبرين الصغيرة (10-30 ميليلتر) سندات أذنيه والحزب الوطني لتحديد البروتين وتجاهل أرستها. ضبط
- السندات الإذنية إلى 40.6 في المائة السكروز بتمييع محلول السكروز 62 في المائة مع نسبة السكروز % PNS:62 1:1.1 باستخدام السندات الإذنية. المزيج بلطف ولكن دقة، دون خلق فقاعات الهواء. تحقق من تركيز السكروز باستخدام مقياس الانكسار.
- وضع السندات الإذنية في السكروز 40.6 في المائة في الجزء السفلي من أنبوب تنبيذ فائق. تراكب بعناية مع 2.5 مل محلول السكروز 35% وملء الأنبوب الطرد المركزي بغبطة.
ملاحظة: يجب أن تكون الطبقات حلول السكروز حيث تكون واجهات مرئية بوضوح- - Ultracentrifuge التدرجات ح 1 في فور وان سيكس فايف، 000 x ز و 4 درجة مئوية.
- بعناية إزالة طبقة بيضاء من الدهون أعلى التدرج. بعد ذلك، جمع الواجهة التي تحتوي على اندوسوميس، بين غبطة والسكروز 35%، باستخدام ميكروبيبيتي 200 ميكروليتر مع تلميح قص.
ملاحظة: الكسور اندوسومال يمكن استخدامها مباشرة في مقايسة بلمرة الأكتين في المختبر أو يمكن أن اليكووتيد على الجليد، فلاش المجمدة في النتروجين السائل، والمخزنة في-80 درجة مئوية. - تحديد تركيز البروتين الكسور السندات الإذنية واندوسومال-
ملاحظة: هذا التركيز يجب أن يكون على الأقل 100 ميكروغرام/مل. ما يقرب من 2.5 × 10 7 خلايا تزرع في أطباق بيتري 2 مطلوبة للحصول السندات أذنيه مع مالا يقل عن 100 ميكروغرام/مل (راجع ملاحظة أعلاه)-
4. إعداد سيتوسول
ملاحظة: أطباق "بيتري 2 إعداد" (قطرها 10 سم؛ 57 سم 2) خلايا هيلا المتلاقية كابتداء من المواد. عند الحاجة، يمكن أيضا إعداد في سيتوسول من الخلايا المنضب بروتين الفائدة (أي، باستخدام [رني] أو كريسبر/Cas9) و/أو أوفيريكسبريسينج wildtype أو النموذج المسخ من بروتين الفائدة. أما بالنسبة للبروتوكول تجزئة دخلول، ينبغي تنفيذ كافة الخطوات في مدت
- كرر الخطوتين 3، 1-3، 8-
- وضع السندات الإذنية في أنبوب الطرد المركزي وأولتراسينتريفوجي لمدة 45 دقيقة في فور تو فايف زيرو، 000 x ز و 4 درجة مئوية.
- بعناية إزالة طبقة بيضاء في الأعلى وجمع SN (كسر سيتوسول) دون إزعاج بيليه ميكروسومي. الاحتفاظ قاسمة الكسر سيتوسول لتحديد البروتين.
ملاحظة: يمكن استخدامها مباشرة في مقايسة بلمرة الأكتين في المختبر سيتوسول أو يمكن أن الكوتيد على الجليد، فلاش المجمدة في النتروجين السائل، والمخزنة في-80 درجة مئوية. - تحديد تركيز البروتين سيتوسول-
ملاحظة: ينبغي أن يكون على الأقل 3 مغ/مل.
5. الاعتداء قياس دخلول-تعتمد على "بلمرة الأكتين" في المختبر
ملاحظة: يمكن أن يؤديها بلمرة الأكتين دخلول-تعتمد على استخدام النهج البديلة اثنين. في النهج الأول، المواد هي مختلطة في أنبوب اختبار وثابتة، ونقل إلى ساترة وتحليلها. في النهج الثاني، الموصوفة هنا، التحليل يمكن أن تنفذ مباشرة في دائرة التصوير ويمكن ثابتة وتحليلها دون اضطراب ميكانيكي ( الشكل 2). في هذا النهج الثاني، لا يتم نقل من أنبوب اختبار إلى ساترة الخليط المقايسة وهكذا يظل دونما قلاقل، تناقص خطر شبكات أكتين و يجري فعلياً بالقلق أثناء النقل. وبالإضافة إلى ذلك، هذا النهج الثاني متوافق مع تحليل الوقت الفاصل بين بلمرة الأكتين و. تجدر الإشارة إلى أنه لا يوجد فرق في تحليل البلمرة واكتين لوحظ مع أما النهج.
ملاحظة: استخدام قطع النصائح طوال البروتوكول.
- في أنبوب اختبار
- بلطف المزيج المثلج المنقي بروتينات فلورية خضراء-RAB5 اندوسوميس (الخطوة 3) مع سيتوسول (الخطوة 4) بنسبة 01:10 (تركيز البروتين) في أنبوبة الاختبار مخروطية المثلج 1.5 مل.
ملاحظة: تجربة نموذجية يتم الاضطلاع بحوالي 40-50 ميليلتر. - ضبط الخليط المثلج الرد النهائي بتركيزات 125 ملم بوكل (باستخدام الحل الأسهم بوكل م 1) و 12.5 مم حبيس 1.5 مم مجواك 2 (باستخدام 50 س الحل الأسهم). ثم، قم بضبط الخليط مع مثبطات البروتياز النهائي بتركيزات من 10 مم ليوبيبتين وبيبستاتين 1 مم أ 10 نانوغرام/مل أبروتينين. مزيج جميع المكونات بلطف.
- وضع أنبوبة الاختبار المحتوية على خليط رد فعل على 37 درجة مئوية، دون تهتز، واحتضان للوقت المطلوب-
ملاحظة: بشكل عام، وسوف يستغرق حوالي 3 دقيقة للكشف عن بلمرة الأكتين على اندوسوميس و 30 دقيقة لتشكيل شبكة واسعة. - في الوقت المطلوب (أي، 3 دقيقة أو 30 دقيقة)، ووقف رد الفعل بوضع أنبوبة الاختبار على الجليد وإضافة 1/10 (vol:vol) الحل منهاج العمل 3% بريكوليد-
- إضافة 0.3:10 (vol:vol) من 200 وحدة/مل (ميكرو ~6.6) فالويدين مترافق بالصبغ الأحمر-البرتقالي وصمة عار أكتين مبلمرة.
- ميكروليتر 12 مكان الخليط على 12 ميكروليتر من بولي تصاعد المتوسطة على شريحة زجاج الصغير. وضع كبار كوفيرسليبون زجاج 2 مم 18 × 18-
- تحليل العينة مع [كنفوكل] مجهرية.
- بلطف المزيج المثلج المنقي بروتينات فلورية خضراء-RAB5 اندوسوميس (الخطوة 3) مع سيتوسول (الخطوة 4) بنسبة 01:10 (تركيز البروتين) في أنبوبة الاختبار مخروطية المثلج 1.5 مل.
- في قاعة التصوير
- لجعل الدوائر التصوير المجهري، استخدام البلازما أنظف لمدة 1 دقيقة لتنظيف ساترة جولة 18 مم وقطرها جولة 35 ملم طبق بيتري مجهزة من أسفل زجاج عيار 20 ملم (0.16-0.19 ملم)-
- احتضان السطوح تنظيفها مع 1% β-الكازين لمدة 20 دقيقة للتقليل من البروتين ملزمة للزجاج. أغسل مرتين مع ايميدازول 3 مم-
- دخلول إضافة سيتوسول، في نفس الاعتداء الخليط كما هو الحال في الخطوات 5.1.1 و 5.1.2، إلى أنبوب اختبار بريكوليد 1.5 مل وتكمل الخليط المقايسة مع 0.1 ميكروغرام/ميكروليتر والرودامين-أكتين- ضبط النهائي الانكسار المخلوط إلى 1.375 (26.5 في المائة السكروز) باستخدام محلول السكروز 39% من
- -
ملاحظة: عادة، على نفس وحدة التخزين هو إضافة؛ ولكن هذا قد يكون تجريبيا إعادة تعديلها تبعاً لتركيز السكروز الكسر المجمعة، تحدد باستخدام مقياس، نظراً لتركيز السكروز قد تتغير قليلاً من التجربة إلى التجربة- - وضع الخليط على الطبق pretreated 35 ملم (الخطوة 5.2.1) وتغطية ذلك مع ساترة 18 ملم pretreated (الخطوة 5.2.1)-
- ضع الدائرة على 37 درجة مئوية، دون الهز.
- تحليل العينة باستخدام مجهر الأسفار [كنفوكل]-
6. ميلان الصورةكويسيتيون و "تحليل لشبكة أكتين"
- من الحصول على الصور الحصول على الصور مجهر [كنفوكل] مسح مقلوب.
ملاحظة: تم الأمثل إعدادات اقتناء الصورة مجهر [كنفوكل] مسح مقلوب مع هدف نفط نا 63 X 1.25. ضبط السلطة الليزر (عادة حوالي 50 ٪) إلى تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة.
- من الحصول على الصور الحصول على الصور مجهر [كنفوكل] مسح مقلوب.
- القياس الكمي لشبكة أكتين
- تحليل ميكروجرافس نيون. استخدام البرامج مفتوحة المصدر سيلبروفيلير (v2.1.1) 12 لقياس كمية أكتين الواحد دخلول (يمكن استخدام برامج بديلة).
- أولاً، تحديد اندوسوميس كالكائن الأساسي باستخدام الإشارات RAB5 التجارة والنقل. ثم تحديدها كمياً واكتين المرتبطة اندوسوميس الفردية باستخدام نشر إشارة أكتين (الصبغ الأحمر والبرتقال مترافق فالويدين) ككائن ثانوي-
- متوسط وتطبيع عدد المواد المرتبطة بها لكل كائن إلى حالة التحكم-
- تحليل ميكروجرافس نيون. استخدام البرامج مفتوحة المصدر سيلبروفيلير (v2.1.1) 12 لقياس كمية أكتين الواحد دخلول (يمكن استخدام برامج بديلة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لاكتساب نظرة ثاقبة تشكيل بقع واكتين في وقت مبكر دخلول الأغشية، تابعنا البروتوكول المبينة في الشكل 2. باختصار، تم transfected الخلايا مع التجارة والنقل RAB5 وثم أعدت اندوسوميس المبكر بوجود سوبسيلولار. كانت المحتضنة هذه اندوسوميس المبكر المنقي مع سيتوسول بغية توفير أكتين نفسها، فضلا عن عوامل أخرى ربما تشارك في رد الفعل. في نهاية فترة الحضانة، أوقف رد فعل تثبيت الخليط. ثم عينة جمعت وأودعت في شريحة مجهرية. وأخيراً، كشف واكتين مع فالويدين (الشكل 3A). التنو واكتين على الأغشية اندوسومال المبكر، فضلا عن عملية البلمرة اللاحقة حدث سريعاً. وفي الواقع، يمكن فعلا تصور أكتين و على اندوسوميس داخل 1 دقيقة بعد بداية رد فعل (الشكل 3A). هذه الهياكل أكتين، التي كانت في البداية قصيرة، سرعان ما أصبح أطول وتشعبت ومرتبطة ببعضها البعض مما أدى إلى تشكيل شبكة متشابكة من خيوط الأكتين (الشكل 3 ألف)، يفترض أن تعكس ديناميات أكتين غير متوازن في المختبر. ولوحظت معدلات التنو والبلمره مماثلة عندما نفذت المقايسة مع المنقي أكتين والرودامين المسمى بالإضافة إلى سيتوسول الخلية. وكان ذلك في أطباق زجاجية حيث يمكن تصويرها هياكل مباشرة، وفي غياب أي اضطراب (الشكل 3B). اندوسوميس المبكر في مقايسة الموصوفة هنا، نوكلياتي دي نوفو أكتين البلمرة بشكل انتقائي. وفي الواقع، لم تحدث بلمرة الأكتين عندما أجرى التفاعل في المختبر في غياب اندوسوميس أو سيتوسول. يمكن أن تكون اختتمت امتلاك القدرة الأساسية لدعم نويات والبلمره اللاحقة من خيوط الأكتين9،11اندوسوميس المبكر.
لتحليل كمية أكتين بلمرة من اندوسوميس، حللت الصور التي تم اكتسابها في أوقات مختلفة باستخدام سيلبروفيلير (الشكل 4 أ). تم قياس مقدار أكتين بلمرة الواحدة دخلول كمجال أكتين المحيطة من دخلول مبكر واحدة. معدل بلمرة الأكتين كان أعلى في بداية العملية، وانخفضت مع الوقت (الشكل 4 باء). ويمكن تحليل الشبكة أكتين بمزيد من التفصيل في وقت مبكر-النقاط بعد بداية رد فعل. عند هذه النقاط الزمنية المبكرة، الهياكل التي تحتوي على أكتين الفردية يمكن أن تكون لا تزال تفريقها عن بعضها البعض. بغية تقييم التنظيم المعقد لشبكات أكتين، تم حساب عدد خيوط أكتين المنبثقة عن كل دخلول (أي خيوط الأولية). وبالمثل، أحصى عدد خيوط أكتين الناشئة من خيوط الأولية (أي، خيوط الثانوي)، فضلا عن العدد من جميع خيوط أكتين الأخرى التي يمكن تحديدها في الشبكات والتي لم تنشأ من اندوسوميس ( أي، خيوط أخرى) (الشكل 4-E. متى كانت تتبع خيوط الأكتين، معلمات أخرى، مثل طول خيوط الأكتين الفردية وعدد من اندوسوميس متصلة بخيوط أكتين نفسه، يمكن أن تكون بسهولة حساب (الرقم 4F).
رقم 1: المرحلة صورة مجهرية على النقيض من هوموجيناتي خلية هيلا. بعد التجانس، تم تحميل الاستخراج بين شريحة مجهرية وساترة. للنشر، ألقي القبض على ميكروجرافس مع هدف X 100 بعد غمر النفط. لإجراء تفتيش روتيني، ومع ذلك، تصور استخراج الخلية تحت 20 X أو هدفا X 40 دون الانغماس النفط. تظهر الأمثلة اثنين من آراء عالية التكبير هوموجيناتي (أ-ب). نوى (نجمة) تظهر كهياكل جولة رمادي داكن اللون، دون مخلفات الخلية المرفقة. الأسهم تشير إلى الحبيبات المميزة متفاوتة الحجم والشكل، وترانسلوسينسي، التي تم إصدارها على تجانس الخلية وتتوافق مع المواد داخل الخلايا (أي، العضيات). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التمثيل التخطيطي للبروتوكول. وصف تخطيطي للبروتوكولات المستخدمة لإعداد مستخلصات اندوسومال (A) وسيتوسول مقتطفات (ب) ورصد بلمرة الأكتين من اندوسوميس في المختبر (ج). المادة طافية (SN) وتجانس المخزن المؤقت (HB) والمادة بوستنوكليار طافية (السندات الإذنية)، بيليه النووية (NP) وبارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نويات وبلمره الأكتين و على اندوسوميس المبكر في المختبر. اندوسوميس (A) تنقيته من هيلا الخلايا وإذ تعرب عن التجارة والنقل-Rab5 (الأخضر) وسيتوسول هيلا أعدت بشكل منفصل. في التحليل، اندوسوميس المبكر (EEs) كانت مختلطة مع سيتوسول، وكان المحتضنة المخلوط ليدل مرات. ثم كان على الخليط ثابتة، المسمى مع فالويدين (أحمر) للتسمية واكتين، وتحليلها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل] الأسفار. أشرطة: 10 ميكرون (اللوحة العلوية) و 5 ميكرومتر (أسفل اللوحة). (ب) EEs تنقيته من هيلا الخلايا معربا عن التجارة والنقل-Rab5 (الأخضر) وسيتوسول هيلا أعدت بشكل منفصل. هذه المقتطفات الخلية كانت المحتضنة مع المنقي والرودامين-أكتين (الأحمر) ليدل الأوقات في الدوائر المجهر وتم تحليلها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل]. شريط المقياس = 10 ميكرون. (ج) تم إجراء التجربة كما هو الحال في أ. كانت المحتضنة سيتوسول هيلا (دون EEs) والحلة اندوسوميس (الأخضر) المسمى بالتجارة والنقل-Rab5 (بدون سيتوسول) بشكل منفصل (لوحات الأيسر والأوسط) أو معا (اللوحة اليمنى) لمدة 30 دقيقة، ثابتة، والمسمى مع فالويدين (الأحمر) للتسمية واكتين، وتحليلها بواسطة الأسفار [كنفوكل] مجهرية. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحليل لشبكة أكتين- (أ) سير العمل لتحليل سيلبروفيلير. (ب) عدد من أكتين مبلمرة كانت كمياً بالنسبة إلى عدد اندوسوميس باستخدام البرمجيات سيلبروفيلير. البيانات هي s.e.m. ± متوسط (n = 3). البيانات وسائل ± المرسوم العالي (n = 3). 5 دقائق مقابل 15 دقيقة (ns ف= 0.0736)، 5 دقيقة مقابل 30 دقيقة (* P = 0.0195)، و 15 دقيقة مقابل 30 دقيقة (ns ف = 0.3129). (ج)اندوسوميس المبكر (EEs) تنقيته من خلايا هيلا معربا عن سيتوسول التجارة والنقل Rab5 والحلة أعدت بشكل منفصل، والفحص أجرى كما في الشكل 2 ألف. عينات تم إصلاحها بعد 7 دقائق. الفريق الأوسط يظهر صورة مجهرية نفسه، مع تداخل آثار هياكل أكتين و رسمها باستخدام البرنامج المساعد نيورونج13 من البرنامج إيماجيج. اللوحة اليسرى تظهر آثار فقط. شريط المقياس = 10 ميكرون. تمثيل والاكتين (د) هيكل تسلسل الترقيم المستخدمة في القياس الكمي مع برنامج إيماجيج. (ﻫ) التحديد الكمي لعدد خيوط الأكتين، كما هو معرف في ج-د. البيانات وسائل ± المرسوم العالي (n = 3). الفروع الرئيسية مقابل الفروع الثانوية (ns P = 0.5262)، الفروع الثانوية مقابل الفروع الأخرى (ns ف = 0.6815)، والفروع الرئيسية مقابل الفروع الأخرى (ns ف = 0.2254). هياكل (F) طول واكتين وعدد EEs كل هيكل الأكتين تظهر كأمثلة لمعلمات أخرى مما يمكن تحليلها مع التقدير الكمي المحدد في ج-د. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أكتين يلعب دوراً حاسما في دخلول غشاء ديناميات4،14. نحن أفاد سابقا أن التنو أكتين والبلمره تحدث في وقت مبكر اندوسوميس، تشكيل بقع واكتين أو الشبكات الصغيرة. وتشكل هذه الشبكات واكتين المطلوبة على الإطلاق للنقل الغشاء خارج اندوسوميس المبكر على طول مسار التدهور. التدخل في أي خطوة من هذه العملية التنو والبلمره يمنع نضوج دخلول ومن ثم النقل المصب نحو أواخر9،أندليسوسوميس اندوسوميس،من1115. على وجه الخصوص، قمنا باستخدام مقايسة الموصوفة أعلاه لتحليل خطوات متسلسلة بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس وتميز هذه العملية على المستوى الجزيئي.
في هذه التجارب، المسمى بالتجارة والنقل-RAB5 في فيفواندوسوميس المبكر، وتنقيته من تجزئة سوبسيلولار، والمحتضنة في أنبوب اختبار حضور سيتوسول للسماح أكتين و البلمرة في المختبر. وفي الوقت المطلوب، توقف رد فعل ويتم نقل الخليط رد فعل إلى شريحة مجهرية للتحليل بالأسفار مجهرية، باستخدام فالويدين لتسمية والاكتين. باستخدام هذه الاستراتيجية التجريبية، أظهرنا أن annexin A2 أمر ضروري التنو واكتين على اندوسوميس المبكر، جنبا إلى جنب مع SPIRE1، بينما يتوسط ARP2/3 واكتين التفريع، كما هو متوقع. واظهرنا أيضا أن ثمة حاجة لتشكيل شبكات واكتين التي تتوسط التحويل الرأسي الخارجي/مفب نشوء حيوي ونضوج على طول مسار تدهور خلايا الثدييات9،11موسين وكورتاكتين.
من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه، على الرغم من عدم تغيير مستويات منخفضة من RAB5 عن اكتوبيكالي اندوسوميس إلى أي حد كبير10، هذا جتباسي الصغيرة منظم رئيسي من أوائل دخلول غشاء ديناميات16،17 . في بعض التجارب، قد يكون من المناسب لتسمية اندوسوميس في التحليل استخدام بروتوكولات بديلة لذلك. على سبيل المثال، يمكن أن اندوسوميس المبكر مريح توصف باستخدام تتبع الفلورسنت المبتلعة، مثل البشرة عامل النمو أو ترانسفيرين4،من14.
كما تجدر الإشارة إلى أنه من الصعب من الناحية الفنية للصورة خيوط أكتين الفردية مع التقليدية [كنفوكل] مجهرية. ولذلك، نشير إلى هياكل واكتين في النص بأكمله لوصف شبكات أكتين في اندوسوميس. نتيجة لذلك، نرى أن تشكيل شبكة أكتين و يمكن قياسها كمياً أكثر دقة بقياس المساحة السطحية fluorescence الشبكات بدلاً من قوتها.
ليس من السهل أن يستبعد تماما إمكانية أن النشاط التنو أكتين ولاحظ في المختبر هو توسط بعض بنية أخرى أو عضية فإنها تظل ملزمة اندوسوميس RAB5 أثناء تنقية. ومع ذلك، هذا التلوث من المستبعد جداً. بينما شارك تنقية بعض العضيات في التدرجات بسبب الخصائص الفيزيائية مماثلة، أنها لا تميل إلى أن تبقى ملتزمة نوعا بعضها البعض بعد تنقية. وعلاوة على ذلك، النشاط التنو أكتين صارما يعتمد على أننيكسين4،A214، وموجودة على اندوسوميس المبكر الذي يحتوي على RAB514. وأخيراً، نجد أن هياكل أكتين و ترتبط بشكل انتقائي مع RAB5 اندوسوميس في فيفو ولم يتم العثور على اندوسوميس الأخرى أو على4،الأغشية الخلوية الأخرى14. وفي الختام، أكتين التنو النشاط الأكثر احتمالاً المرتبطة اندوسوميس RAB5، نظراً لهذا النشاط المشترك ينقي وشارك يموضع مع اندوسوميس RAB5.
في هذا التحليل، كثير مثل في فحوصات أخرى أن إعادة تشكيل ردود الفعل البيوكيميائية المعقدة التي تحكم ديناميات اندوسوميس16 أو الأغشية الأخرى18 والتي تتم في أنبوب اختبار، من المهم ضمان إعداد مقتطفات الخلوية الأمثل. ينبغي أن يكون تجانس الخلايا تحت ظروف لطيف للحد من الأضرار التي لحقت اندوسوميس والعضيات الأخرى، لا سيما نوى و lysosomes. أيضا، ينبغي أن تظل دخلول الكسور على الجليد في ظل الظروف التي تقلل من الإجهاد ناضح والأيونية، فضلا عن البلمرة العفوي أكتين. في تركيزات إضافية، عالية نسبيا من دخلول الكسر (≥0.1 mg/mL) وسيتوسول (إيه ثري mg/mL) مطلوبة من أجل بلمرة الأكتين و كافية اندوسوميس وكشفها، كما هو مبين في الخطوات 3.13 و 4-4، على التوالي. وبالمثل، من المهم إجراء الفحص مع 01:10 نسبة دخلول إلى سيتوسول (البروتين: البروتين)، كما هو مبين في الخطوة 5.1.1. وأخيراً، بيبيتينج بعد بلمرة الأكتين (أي، لإضافة منهاج عمل بيجين وفالويدين) ينبغي أن يتم بلطف جداً لتجنب الانهيار أو كسر الشبكة أكتين.
إذا لزم الأمر، مقايسة بلمرة الأكتين في المختبر يمكن أيضا القيام مباشرة مجهر التصوير الدائرة، بعد إضافة أكتين والرودامين المنقي الخليط المقايسة، للحد من الاضطرابات الميكانيكية للشبكات أكتين بلمرة على اندوسوميس (راجع الخطوة 5.2.3 و الشكل 2). وفي هذه الحالة، أفضل وسيلة لضبط استخراج السكروز 26.5 في المائة (0.85 م) نشر الحد (الانكسار من 1.375)، ومثل البراونية الحركة (الخطوة 5.2.3)، وإزالة المجاميع الممكنة لتنقية والرودامين-أكتين تنبيذ فائق قبل الاستخدام. قد لخص ملاحظاتنا أن مويسين يتحكم تشكيل شبكات واكتين على اندوسوميس تماما استخدام هذا الإصدار البديل لدينا4،المقايسة14.
أما إصدار بروتوكول لدينا، في أنبوبة الاختبار أو في قاعة التصوير، الأمثل لتحليل عالمي التنو واكتين والبلمره في اندوسوميس. ومع ذلك، ليس من السهل متابعة عملية بلمرة الأكتين من خلال وقت استخدام هذا النهج، في جزء منه لأن اندوسوميس غير قادرة على الحركة. ونتيجة لذلك، ليس من السهل رصد نمو خيوط فردية ومن ثم تحديد تاريخ الشبكة أكتين. على سبيل المثال، يمكن أن يكون من الصعب أن تميز واكتين المتفرع من كروسلينكينج. ومع ذلك، نحن على ثقة من أنه يمكن تحسين الظروف لرصد بلمرة الأكتين و في الوقت الحقيقي في قاعة التصوير عن طريق تحسين الظروف لشل اندوسوميس. وبالمثل، سيكون من المثير للاهتمام أن رصد بلمرة الأكتين و من الأغشية الاصطناعية باستخدام مكونات المنقي. وفي الواقع، أظهرنا سابقا أن التنو واكتين والبلمره يمكن أن تحدث في الدهنية بعد تي ملزمةأنه عامل التنو annexin A2 على بلير الحويصلية11. هذه الاستراتيجية سيكون مفيداً كذلك تشريح دور محددة من الدهون والبروتينات في عملية التنو وبلمره الأكتين و ووصف المكونات الحد الأدنى اللازم لتشكيل شبكة واكتين على الأغشية اندوسومال. وأخيراً، نعتقد أن هذه الاستراتيجية سوف تكون مفيدة جداً دراسة أخرى واكتين-تعتمد على العمليات التي تحدث في الأغشية دخلول، لا سيما تجنيد وتعبئة إليه ريترومير/يغسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وتلقى دعما من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية"؛ البرنامج "سينيرجيا السويسرية"؛ البولندية-السويسرية البحث البرنامج (بسبب-094/2010)؛ نككر في مجال البيولوجيا الكيميائية؛ وليبيد من المبادرة السويسرية SystemsX.ch، التي تقيمها "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (إلى ج. غ.). وأيد م. سين التطريز زمالة طويلة الأجل (التف-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
