In Vitro Polymerisation av F-aktin på tidig Endosomes
Summary
Tidig endosome funktioner är beroende av F-aktin polymerisation. Här, beskriver vi en mikroskopi-baserade in vitro- test som omformulerar den kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig endosomal membran i provrör, vilket gör detta komplex serie av reaktioner biokemiska och genetiska manipulationer.
Abstract
Många tidiga endosome funktioner, särskilt Last protein sortering och membran deformation, beror på fläckar av kort F-aktin filament nucleated på det endosomal membranet. Vi har etablerat en mikroskopi-baserade in vitro- test som omformulerar den kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig endosomal membran i provrör, vilket gör detta komplex serie av reaktioner kan bli föremål för genetiska och biokemiska manipulationer. Endosomal fraktioner förbereds av flyttankar i sackaros övertoningar från celler som uttrycker det tidiga endosomal proteinet GFP-RAB5. Cytosoliska fraktioner är beredda från separata satser av celler. Både endosomal och cytosoliska fraktioner kan förvaras frysta i flytande kväve, om det behövs. I analysen, den endosomal och cytosoliska fraktioner blandas och blandningen är inkuberas vid 37 ° C under lämpliga förhållanden (t.ex. jonstyrka, minska miljö). Vid önskad tid, reaktionsblandningen är fast, och F-actin avslöjas med phalloidin. Aktin kärnbildning och polymerisation analyseras sedan av fluorescensmikroskopi. Vi rapporterar här, att denna analys kan användas för att undersöka betydelsen av faktorer som är inblandade i aktin kärnbildning på membranet, eller i efterföljande töjning, förgrening eller tvärbindning av F-aktin filament.
Introduction
I högre eukaryota celler, är proteiner och lipider internaliserad i tidigt endosomes där sortering sker. Vissa proteiner och lipider, som är avsedda att vara reutilized, är införlivad med tubulär regioner i den tidiga endosomes och transporteras sedan till plasmamembranet eller till trans-Golgi nätverk (TGN)1,2. Däremot paketeras andra proteiner och lipider selektivt till regioner i de tidiga endosomes som uppvisar ett multivesicular utseende. Dessa regioner expandera och, vid lösgörande från tidig endosomal membran, så småningom mogen i gratis endosomal carrier blåsor eller multivesicular organ (ECV/MVBs), som ansvarar för frakttransporter mot sena endosomes1, 2.
Aktin spelar en avgörande roll i den membran remodeling process som är associerad med endosomal sortering kapacitet och endosome biogenes. Protein sortering längs de återvinning vägarna till plasmamembranet eller TGN beror på den komplexa retromer och de associera proteinerna. Denna sortering maskiner verkar vara kopplat till bildandet av återvinning tubuli via samspelet mellan retromer som är komplexa, med WASP och Scar homologt (WASH) komplexa och förgrenade aktin3,4,5 . Däremot molekyler avsedda för nedbrytning, särskilt aktiveras signalering receptorer, sorteras i intraluminal blåsor (ILVs) av den endosomal sortering komplex krävs för transport (ESCRT)2,6, 7. Medan den eventuella betydelsen av aktin i processen ESCRT-beroende sortering inte är känt, spelar F-aktin en viktig roll i biogenes av ECV/MVBs och transport bortom tidig endosomes. Vi fann särskilt att annexin A2 binder kolesterol-berikade regioner av tidig endosome, och tillsammans med spire1, kärnbildas F-aktin polymerisation. Bildandet av förgrenade aktin nätverket observerats på endosomes kräver aktiviteten förgrening av proteinet aktin-relaterade (ARP) 2/3 komplex, liksom den ERM protein moesin och aktin-bindande protein cortactin8,9.
Här beskriver vi en mikroskopi-baserade in vitro- test som omformulerar den kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig endosomal membran i provrör. Denna analys har använts tidigare för att undersöka betydelsen av annexin A2 i F-aktin kärnbildning och moesin och cortactin i bildandet av endosomal aktin nätverk8,9. Med in vitro- protokollet bli en komplex serie av reaktioner som uppstår på endosomes under aktin polymerisation mottaglig för biokemiska och molekylära analysen av de sekventiella steg av processen, inklusive aktin nukleation, linjär polymerisation, förgrening och crosslinking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aktin spelar en avgörande roll i endosome membran dynamics4,14. Tidigare rapporterade vi att aktin kärnbildning och polymerisation inträffar på tidig endosomes, bildar små F-aktin patchar eller nätverk. Dessa F-aktin nätverk krävs absolut för membran transport bortom tidig endosomes längs nedbrytningsvägen. Störande vid varje steg av denna kärnbildning och polymerisation process förhindrar endosome mognad och därmed nedströms transport mot sena en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fick stöd från schweiziska National Science Foundation; Schweiziska Sinergia programmet; Polska-schweiziska forskningsprogrammet (PSPB-094-2010); NCCR i kemisk biologi; och LipidX från det schweiziska SystemsX.ch initiativet, utvärderas av schweiziska National Science Foundation (till J. G.). O. M. stöddes av ett långsiktigt EMBO-stipendium (2012-ALTF-516).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!. Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
