Summary
Tidlige endosome funktioner afhænger af F-actin polymerisering. Her, beskriver vi en mikroskopi-baseret i vitro assay, der genopretter Nukleering og polymerisering af F-actin på tidlig endosomal membraner i reagensglas, hvilket gør dette kompleks række reaktioner medgørlige biokemiske og genetiske manipulationer.
Abstract
Mange tidlige endosome funktioner, især cargo protein sortering og membran deformation, afhænger af pletter af kort F-actin filamenter nukleeret på endosomal membran. Vi har etableret en mikroskopi-baseret i vitro assay, der genopretter Nukleering og polymerisering af F-actin på tidlig endosomal membraner i reagensglas, hvilket gør dette kompleks række reaktioner imødekommenhed over for genetiske og biokemiske manipulationer. Endosomal brøker er udarbejdet af opdrift i saccharose forløb fra celler, der udtrykker den tidlige endosomal protein normal god landbrugspraksis-RAB5. Cytosole fraktioner er fremstillet af særskilte partier af celler. Både endosomal og cytosole fraktioner kan opbevares frosset i flydende kvælstof, hvis det er nødvendigt. I analysen, endosomal og cytosole fraktioner blandes, og blandingen er inkuberes ved 37 ° C under de rette betingelser (fx ionisk styrke, at reducere miljø). Dengang ønskede reaktionsblandingen er fast, og F-actin er afsløret med phalloidin. Aktin Nukleering og polymerisation er derefter analyseret af Fluorescens mikroskopi. Vi rapporterer her, at denne analyse kan bruges til at undersøge rollen af faktorer, der er involveret i actin Nukleering på membranen, eller i den efterfølgende strækforlængelse, forgrener sig eller crosslinking af F-actin filamenter.
Introduction
I højere eukaryote celler, er proteiner og lipider internaliseret i tidlige endosomes hvor sortering opstår. Nogle proteiner og lipider, som er bestemt til at være reutilized, er indarbejdet i rørformede regioner i de tidlige endosomes og derefter transporteres til plasma membran eller til trans-Golgi network (TGN)1,2. Derimod pakket andre proteiner og lipider selektivt ind i regioner i den tidlige endosomes, der udviser et multivesicular udseende. Disse regioner udvide og efter udstationering fra tidlig endosomal membraner, tiden moden til gratis endosomal carrier blærer eller multivesicular organer (ECV/MVBs), som er ansvarlig for fragt transport mod slutningen endosomes1, 2.
Aktin spiller en afgørende rolle i den membran remodeling proces forbundet med endosomal sortering kapacitet og endosome Biogenese. Protein sortering langs den genanvendelse veje til plasma membran eller TGN afhænger af den komplekse retromer og de tilknyttede proteiner. Denne sortering maskiner synes at være koblet til dannelsen af genanvendelse tubuli via interaktioner retromer komplekse, med HVEPS og ar homolog (vask) komplekse og forgrenede actin3,4,5 . Derimod molekyler bestemt til nedbrydning, især aktiveret signaling receptorer, er sorteret i intraluminal vesikler (ILVs) af endosomal sortering komplekser kræves for transport (ESCRT)2,6, 7. Mens den mulige rolle af actin i ESCRT-afhængige sorterings processen ikke er kendt, spiller F-actin en vigtig rolle i ECV/MVBs Biogenese og transport ud over tidlige endosomes. Vi fandt navnlig, at annexin A2 binder kolesterol-beriget regioner af tidlige endosome, og sammen med spire1, nucleates F-actin polymerisering. Dannelsen af forgrenede actin netværket observeret på endosomes kræver det forgrenede aktivitet af actin-relaterede protein (ARP) 2/3 kompleks, samt ERM protein moesin og actin-bindende protein cortactin8,9.
Her, beskriver vi en mikroskopi-baseret i vitro assay, der genopretter Nukleering og polymerisering af F-actin på tidlig endosomal membraner i reagensglas. Denne analyse er blevet brugt tidligere til at undersøge rollen af annexin A2 i F-actin Nukleering og moesin og cortactin i dannelsen af endosomal actin net8,9. Med dette in vitro- protokollen blive den komplekse række af reaktioner, der opstår på endosomes under actin polymerisering modtagelig den biokemiske og molekylær analyse af de sekventielle trin i processen, herunder actin Nukleering, lineær polymerisering, forgrening, og crosslinking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. løsninger og præparater
Bemærk: alle buffere og løsninger bør forberedes i dobbeltdestilleret (dd) H 2 O. Fordi tilstanden hydrering af saccharose varierer, den endelige koncentrationen af alle saccharose løsninger skal bestemmes ved hjælp af et refraktometer.
- Forbered fosfatbufferet saltopløsning uden divalent kationer (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 og 6.5 mM Na 2 HPO 4. PH indstilles til 7,4. Steriliseres ved autoklavering (1 cyklus ved 121 ° C i 15 min) og opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede stamopløsning af 300 mM imidazol: 0.204 g imidazol i 10 mL af Hedeselskabet 2 O.Adjust til pH 7,4 ved 4 ° C ved hjælp af HCl. Filter-sterilisere ved hjælp af et 0,22 μm pore størrelse filter og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered homogenisering buffer (HB; forberede ca. 100 mL): 250 mM saccharose i 3 mM imidazol. PH indstilles til 7.4 ved 4 ° C ved hjælp af et pH-meter. Filter-sterilisere ved hjælp af et 0,22 μm pore størrelse filter og opbevares ved 4 ° C. supplement til HB lige før brug med en cocktail for proteasehæmmere endelige koncentrationer svarende til 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A og 10 ng/mL aprotinin.
- For trin flydemidler gradienter, forberede 62%, 39% og 35% saccharose løsninger i 3 mM imidazol, pH 7,4, som beskrevet nedenfor. Netop afgøre den endelige koncentration af alle saccharose løsninger ved hjælp af et refraktometer.
- Forberede 100 mL af 62% rørsukkeropløsning 3 mM imidazol, pH 7,4. Opløses ved omrøring 80,4 g saccharose i ddH 2 O præ varmes til 35 ° C. tilføje 1 mL af 300 mM imidazol stamopløsning og fyld til 100 mL med ddH 2 O. Juster pH til 7.4 på 4 ° C. Filter-sterilisere ved hjælp af et 0,22 μm pore størrelse filter og butik ved 4 ° C.
- Forberede 100 mL 35% rørsukkeropløsning 3 mM imidazol, pH 7,4. Opløses ved omrøring 40,6 g saccharose i ddH 2 O. tilføje 1 mL af 300 mM imidazol stamopløsning og fylde til 100 mL med ddH 2 O. Juster pH-værdien til 7.4 på 4 ° C. Filter-sterilisere bruger et 0,22 μm pore størrelse filter og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede 50 mL af 39% saccharose i 3 mM imidazol, pH 7,4. Fortynd 62% rørsukkeropløsning med 35% rørsukkeropløsning. Opbevares ved 4 ° C.
- 3 g PARAFORMALDEHYD (PFA) opløses ved omrøring i 100 mL af PBS-pre-warmed til 60 ° C samtidig tilføjer 1 M NaOH dråbevis; justere den endelige pH til 7.4 ved hjælp af NaOH. Filter-sterilisere ved hjælp af et 0,22 μm pore størrelse filter og opbevares ved -20 ° C.
Forsigtig: 3% PFA er en giftig reagens. - Forberede 1 M KCl stamopløsning. 3,73 g KCl opløses ved omrøring i 50 mL af Hedeselskabet 2 O. Filter-sterilisere ved hjælp af et 0,22 μm pore størrelse filter og opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 50 X koncentreret stamopløsning indeholdende 0,625 M Hepes til pH 7,0 og 75 mM MgOAc 2 i ddH 2 O. delprøve og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered montering medium. Mix af omrøring 2,4 g af poly(vinylalkohol) M w ~ 31.000 (PVA) med 6 g glycerol. Tilføje 6 mL af Hedeselskabet 2 O og henstår i mindst 2 timer ved stuetemperatur. Tilføj 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) og opvarmes til ca. 53 ° C med lejlighedsvise omrøring indtil PVA har opløst.
- Præcisere løsningen ved centrifugering ved 5.000 x g i 20 min. ved stuetemperatur. Indsamle supernatanten og tilføje 2,5% (w/v) 1,4 - diazabicyclo-[2.2.2] oktan (DABCO) at undgå photobleaching under registrering af fluorescens. Vortex for omkring 30 s til at opløse. Alikvot i 1,5 mL plasticrør og opbevares ved -20 ° C.
2. Celle kultur
- kultur HeLa celler i Dulbecco ' s ændret Eagle Medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 10% ikke-essentielle aminosyrer, 10% L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin. Vedligeholde dem ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Transfect celler 24 timer før forsøget med normal god landbrugspraksis-RAB5 10, ved hjælp af kommercielle Transfektion reagens ifølge producenten ' s instruktioner.
- Når det er nødvendigt, forberede endosomal brøker og cytosol fra celler forarmet af et protein af interesse (dvs. ved hjælp af RNAi eller CRISPR/Cas9) og/eller overekspression en vildtype eller mutant form af protein interesse.
3. Endosomal brøkdel forberedelse
Bemærk: denne protokol beskriver ligetil forberedelsen af subcellulært fraktioner der indeholder endosomes og andre lys membraner. Hvis det er nødvendigt, kan renset endosome fraktioner også være brugte 11. Forberede 2 petriskåle (10-cm ydre diameter; 57 cm 2) sammenflydende celler udtryk for normal god landbrugspraksis-RAB5 som udgangspunkt materiale. Det samlede antal sammenflydende HeLa celler i 2 petriskåle svarer nogenlunde til 2,5 x 10 7 celler. Når nødvendigt, endosomes kan også fremstilles af celler forarmet af et protein af interesse (dvs. ved hjælp af RNAi eller CRISPR/Cas9) og/eller overekspression en vildtype eller mutant form af protein af interesse, altid udtryk for normal god landbrugspraksis-RAB5.
forsigtighed: alle trin af fraktionering protokollen bør udføres på ice.
- Petriskåle på en våd metalpladen i en flad isspand og straks cellerne vaskes to gange med 5 mL iskold PBS-.
- Fjerner alle PBS - fra den sidste vask og tilsættes 3 mL iskold PBS-per parabol. Celler bør ikke tørre under håndtering: Hvis det er nødvendigt, placere isspand på en vuggende platform til tilstrækkeligt dække celler med væske.
- Fjerne mekanisk cellerne i PBS fra petriskåle ved hjælp af en fleksibel gummi politimand (dvs. hjemmelavet celle skraber). Skrabe celler ud retterne først i en hurtig, cirkulær bevægelse omkring ydersiden af skålen, efterfulgt af en nedadgående bevægelse i midten af fadet. Skrab forsigtigt at få " arkene " vedlagte celler. Forsigtigt overføre celler ved hjælp af en plastik Pasteur pipette med en bred åbning til et 15 mL konisk polypropylen rør på ice.
- Der centrifugeres i 5 min. ved 175 x g og 4 ° C.
- Forsigtigt fjerne supernatanten (SN) og tilføje 1-3 mL af HB til pellet. Ved hjælp af en plastik Pasteur pipette med en bred åbning, forsigtigt pipetteres op og ned en gang for at resuspend cellerne.
- Der centrifugeres i 7-10 min. ved 1,355 x g og 4 ° C. forsigtigt fjerne SN.
- Udføre celle homogenisering.
Bemærk: Betingelser skal være blid, plasma membraner i cellerne er brudt, men endosomes forblive intakt.- Tilføj en kendt mængde af HB med proteasehæmmere på hver celle pellet (ca. 100 μl pr. celle pellet). Ved hjælp af en 1.000-µL mikropipette forsigtigt pipetteres op og ned indtil cellerne er genopslemmes. Gør ikke indføre luftbobler.
- Udarbejde en 1 mL tuberkulin sprøjte med 22G nål pre skylles med HB og fri for luft eller bobler.
- Fyld sprøjten med cellesuspension relativt langsomt (for at undgå luftbobler), placerer den skrå spids mod mur af røret og udvise cellesuspension hurtigt at vride ud plasma membraner i de tilknyttede celler.
- Tager en lille alikvot af homogenatet (ca. 3 µL) og fortynde det i 50 µL af HB på et glas dias. Mix og dække med et glas coverslip. Inspicere homogenatet under et fasekontrast mikroskop udstyret med en 20 X eller 40 X mål.
Bemærk: Under optimale forhold, de fleste celler er brudt, men kerner, der vises som mørke grå og runde strukturer, er ikke ( figur 1). - Gentag trin 3.7.3 og 3.7.4 indtil de fleste celler er brudt, og normalt 3-6 up-and-down strøg gennem nålen er nødvendige. Holde en lille alikvot (10-30 µL) af homogenatet for protein bestemmelse.
- Centrifuge homogenatet for 7 min. ved 1,355 x g og 4 ° C.
Bemærk: efter centrifugering, pellet (defineret som den nukleare pellet; NP) indeholder kerner og supernatanten (defineret som postnuclear supernatanten; PNS) indeholder cytosol og organeller udgivet ved homogenisering og i frie suspension. - Omhyggeligt indsamle PNS. Holde små prøver (10-30 µL) af PNS og NP for protein beslutsomhed og kassér NP.
- Justere PNS til 40,6% saccharose ved fortynding 62% rørsukkeropløsning med PNS ved hjælp af et 1:1.1 forhold på PNS:62% saccharose. Bland forsigtigt, men grundigt, uden at skabe luftbobler. Kontrollere saccharose ved hjælp af refraktometret.
- Sted PNS i 40,6% saccharose i bunden af en ultracentrifugering tube. Overlay omhyggeligt med 2,5 mL af 35% saccharose løsning og fylde centrifugeglasset med HB.
Bemærk: Saccharose løsninger bør være lagdelt, således at grænseflader er klart synlige. - Ultracentrifuge forløb i 1 time på ̴165, 000 x g og 4 ° C.
- Fjern forsigtigt den hvide lag af lipider oven på farveforløbet. Næste, indsamle den grænseflade, der indeholder endosomes, mellem HB og 35% saccharose, ved hjælp af en 200-μL mikropipette med et cut tip.
Bemærk: Endosomal fraktioner kan bruges direkte i in vitro- actin polymerisering assay eller kan være aliquoted på is, flash-frosset i flydende kvælstof, og opbevares ved-80 ° C. - Afgøre proteinkoncentration af PNS og endosomal fraktioner.
Bemærk: Denne koncentration skal være mindst 100 µg/mL. Ca 2,5 x 10 7 celler dyrkes i 2 petriskåle er nødvendig for at opnå en PNS med mindst 100 µg/mL (Se ovenstående Note).
4. Cytosol forberedelse
Bemærk: forberede 2 petriskåle (10 cm diameter, 57 cm 2) sammenflydende HeLa celler som udgangspunkt materiale. Når det er nødvendigt, kan cytosol også tilberedes fra celler forarmet af et protein af interesse (dvs. ved hjælp af RNAi eller CRISPR/Cas9) og/eller overekspression en vildtype eller mutant form af protein af interesse. Hvad angår endosome fraktionering protokollen, bør alle trin udføres på ice.
- Gentag trin 3.1-3.8.
- Placer PNS i et centrifugeglas, og ultracentrifuge for 45 min. ved ̴250, 000 x g og 4 ° C.
- Forsigtigt fjerne det hvide lag på toppen og indsamle SN (cytosol brøkdel) uden at forstyrre microsome pellet. Holde en alikvot af cytosol fraktion protein bestemmelse.
Bemærk: Cytosol kan bruges direkte i in vitro- actin polymerisering assay eller kan være aliquoted på is, flash-frosset i flydende kvælstof, og lagret på-80 ° C. - Bestemmelse af protein blykoncentrationen i cytosol.
Bemærk: Det skal være mindst 3 mg/mL.
5. Assay måling Endosome-afhængige Actin polymerisering In Vitro
Bemærk: Endosome-afhængige actin polymerisering kan udføres ved hjælp af to alternative tilgange. I den første fremgangsmåde, materialerne blandes i et reagensglas, fast, og overført til en coverslip og analyseres. I den anden metode, beskrevet her, kan analysen udføres direkte i den billeddiagnostiske afdeling og kan være fast og analyseret uden mekaniske undertrykkelse af netbårne ( figur 2 c). I denne anden tilgang, assay blanding overføres ikke fra et reagensglas til en coverslip og dermed forbliver uforstyrrede, mindske faren for F-actin netværk bliver fysisk urolig under overførslen. Denne anden fremgangsmåde er derudover kompatible med en time-lapse analyse af F-actin polymerisering. Det skal bemærkes, at ingen forskel i analysen af F-actin polymerisering blev observeret med enten tilgang.
Bemærk: Brug skære tips hele protokollen.
- i et reagensglas
- forsigtigt mix iskold renset normal god landbrugspraksis-RAB5 endosomes (trin 3) med cytosol (trin 4) i forholdet 1:10 (proteinkoncentration) i en iskold 1,5 mL konisk reagensglas.
NOTE: Et typisk eksperiment udføres med ca 40-50 µL. - Justere den iskolde reaktionsblandingen til endelige koncentrationer af 125 mM KCl (ved hjælp af 1 M KCl stamopløsning), 12,5 mM Hepes og 1,5 mM MgOAc 2 (ved hjælp af 50 x stamopløsning). Derefter justere blandingen med proteasehæmmere til endelige koncentrationer af 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A og 10 ng/mL aprotinin. Forsigtigt blandes alle komponenter.
- Anbring reagensglasset indeholder reaktionsblanding ved 37 ° C, uden at ryste, og Inkuber i den ønskede tid.
Bemærk: Typisk, vil det tage ca. 3 min. at opdage actin polymerisering på endosomes og 30 min for dannelsen af et omfattende netværk. - Til den ønskede tid (dvs. 3 min eller 30 min), reaktionen standses ved at placere reagensglasset på isen og tilføje 1/10 (vol:vol) af den forkølede 3% PFA løsning.
- Tilføje 0.3:10 (vol:vol) af 200 enheder/mL (~6.6 μM) phalloidin konjugeret med rød-orange farvestof til at plette den polymeriserede actin.
- Sted 12 μl af blandingen på 12 μl af PVA montering medium på en micro glas dias. Sætte en 18 x 18 mm 2 glas coverslipon top.
- Analysere prøve med konfokalmikroskopi.
- forsigtigt mix iskold renset normal god landbrugspraksis-RAB5 endosomes (trin 3) med cytosol (trin 4) i forholdet 1:10 (proteinkoncentration) i en iskold 1,5 mL konisk reagensglas.
- i den billeddiagnostiske afdeling
- for at foretage mikroskopisk billeddannelse kamre, bruge plasma renere for 1 min at rense en runde 18 mm diameter coverslip og runde 35 mm diameter petriskål udstyret med en 20 mm glas bund (0,16-0,19 mm).
- Ruger de rensede overflader med 1% β-kaseiner for 20 min til at minimere protein binding til glasset. Vaskes to gange med 3 mM imidazol.
- Tilføj endosome og cytosol, i samme assay blanding som i trin 5.1.1 og 5.1.2, til en forkølede 1,5 mL reagensglas og supplere assay blandingen med 0,1 μg/μL rodamin-actin.
- Justere det endelige brydningsindekset af blandingen til 1.375 (26,5% saccharose) ved hjælp af 39% rørsukkeropløsning.
Bemærk: Typisk samme volumen er tilføjede; Dette har imidlertid være empirisk re justeret, afhængigt af saccharose i den indsamlede brøk, bestemmes ved hjælp af en refractomer, da saccharose kan let ændres fra forsøg til eksperiment. - Placer blandingen på massiv 35-mm skålen (trin 5.2.1) og dække det med massiv 18-mm coverslip (trin 5.2.1).
- Sted i salen ved 37 ° C, uden rystelser.
- Analysere prøven ved hjælp af fluorescens Konfokal mikroskopi.
6. Billede Acquisition og analyse af Actin netværk
- billede erhvervelse
- erhverve billeder på en inverteret scanning Konfokal mikroskop.
Bemærk: Billedindstillinger erhvervelse var optimeret til en inverteret scanning Konfokal mikroskop med en 63 X 1,25 NA olie mål. Justere laser power (normalt omkring 50%) til at opnå en god signal-støj-forholdet.
- erhverve billeder på en inverteret scanning Konfokal mikroskop.
- Kvantificering af actin netværk
- analysere de fluorescerende micrographs. Bruge opensource software CellProfiler (v2.1.1) 12 til at måle mængden af actin pr. endosome (alternativ software kan bruges).
- Første, identificere endosomes som det primære objekt ved hjælp af normal god landbrugspraksis-RAB5 signal. Derefter, kvantificere F-actin forbundet med individuelle endosomes ved hjælp af udbredelsen af actin signal (rød-orange farvestof konjugeret Phalloidin) som en sekundær objekt.
- Gennemsnitlige og normalisere antallet af tilknyttede materiale til hvert objekt til kontrol tilstand.
- analysere de fluorescerende micrographs. Bruge opensource software CellProfiler (v2.1.1) 12 til at måle mængden af actin pr. endosome (alternativ software kan bruges).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at få indsigt i dannelsen af F-actin pletter på tidlig endosome membraner, fulgte vi den protokol, der er skitseret i figur 2. Kort, celler blev transfekteret med normal god landbrugspraksis-RAB5 og derefter tidlige endosomes blev udarbejdet af subcellulært fraktionering. Disse renset tidlige endosomes var inkuberes med cytosol for at give actin selv samt andre faktorer, muligvis involveret i reaktionen. For enden af inkubationstiden blev reaktion stoppet af fiksering af blandingen. En prøve var derefter indsamles og deponeres på en mikroskopisk dias. Endelig, F-actin blev afsløret med phalloidin (figur 3A). Nukleering af F-actin på tidlig endosomal membraner samt den efterfølgende polymerisation proces opstod hurtigt. Faktisk kunne F-actin allerede visualiseres på endosomes inden for 1min efter begyndelsen af reaktion (figur 3A). Disse actin strukturer, der var i første omgang kort, blev hurtigt længere, forgrenede og forbundet med en anden fører til dannelsen af en sammenvævede net af actin filamenter (figur 3A), hvilket formentlig afspejler ubalanceret actin dynamics in vitro. Lignende Nukleering og polymerisation priser blev observeret, når analysen er gennemført med renset rodamin-mærket actin ud over celle cytosol. Dette blev gjort i glas-bund retter så strukturer kan være afbildet direkte, i mangel af enhver undertrykkelse af netbårne (figur 3B). I analysen beskrives her, samme tidlig endosomes de novo actin polymerisering selektivt. Faktisk opstår actin polymerisering ikke når in vitro- reaktion blev udført i enten endosomes eller cytosol fravær. Det kan således konkluderes, at tidlig endosomes besidder den grundlæggende evne til at støtte Nukleering og efterfølgende polymerisation af actin filamenter9,11.
For at analysere mængden af actin polymeriserede fra endosomes, blev billeder, der er erhvervet på forskellige tidspunkter analyseret ved hjælp af CellProfiler (figur 4A). Mængden af actin polymeriserede pr. endosome blev målt som området af actin omkring en enkelt tidlig endosome. Actin polymerisering satsen var højere i starten af processen og faldt med tid (figur 4B). Aktin netværk kunne analyseres nærmere i tidlig tid-point efter begyndelsen af reaktionen. Disse tidlige tid-punkter, kunne individuelle actin-holdige strukturer stadig være skelnes fra hinanden. For at vurdere den kompleks organisation af actin netværk, antallet af actin filamenter stammer fra hver endosome blev optalt (dvs. primære filamenter). Ligeledes blev antallet af actin filamenter med oprindelse fra primære filamenter (dvs., sekundære filamenter) talt, samt antallet af alle andre actin filamenter der kunne identificeres i net og det ikke stammer fra endosomes ( dvs., andre filamenter) (figur 4 c-E. Når actin filamenter blev sporet, beregnes andre parametre såsom længde af individuelle actin filamenter og antallet af endosomes forbundet til den samme actin filamenter, kunne være nemt (figur 4F).
Figur 1: fase kontrast Mikrograf af en HeLa celler homogenatet. Efter homogenisering, blev ekstraktet monteret mellem et mikroskopisk dias og en coverslip. Til offentliggørelse, blev micrographs fanget med et 100 X mål efter immersionsolie. For rutinemæssig inspektion, dog blev celle ekstrakt visualiseret under en 20 X eller en 40 X mål uden immersionsolie. To eksempler på høj forstørrelse udsigt over homogenatet er vist (A-B). Kerner (star) vises som runde strukturer mørk grå i farven, uden tilknyttede celle rester. Pilene peger på de karakteristiske granulat af varierende størrelse, form og translucence, som er udgivet på celle homogenisering og svarer til intracellulære materialer (dvs. organeller). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk fremstilling af protokollen. Skematisk beskrivelse af de protokoller, der bruges til at forberede endosomal ekstrakter (A) og cytosol ekstrakter (B) og overvåge actin polymerisering fra endosomes in vitro- (C). Supernatant (SN), homogenisering buffer (HB), postnuclear supernatanten (PNS), nukleare pellet (NP) og PARAFORMALDEHYD (PFA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Nukleering og polymerisering af F-actin på tidlig Endosomes In Vitro. (A) Endosomes renset fra Hela celler udtrykker normal god landbrugspraksis-Rab5 (grøn) og HeLa cytosol blev udarbejdet separat. I analysen, tidlig endosomes (EBS) blev blandet med cytosol, og blandingen blev udruget for den angivne tid. Blandingen blev derefter fast, mærket med phalloidin (rød) til label F-actin og analyseret af fluorescens Konfokal mikroskopi. Barer: 10 µm (toppanelet) og 5 µm (nederste panel). (B) EBS renset fra Hela celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis-Rab5 (grøn) og HeLa cytosol blev udarbejdet separat. Disse ekstrakter, celle var inkuberes med renset rodamin-actin (red) for den angivne tidspunkter i mikroskop kamre og blev analyseret af Konfokal mikroskopi. Skalalinjen = 10 µm. (C) eksperimentet blev udført som i A. HeLa cytosol (uden EEs) og HeLa endosomes (grøn) mærket med normal god landbrugspraksis-Rab5 (uden cytosol) blev udruget separat (venstre og mellemste paneler) eller sammen (højre panel) i 30 min, fast, mærket med phalloidin (rød) til label F-actin og analyseret af Fluorescens Konfokal mikroskopi. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: analyse af Actin netværk. (A) arbejdsproces af CellProfiler analyse. (B) antallet af polymeriseret actin var kvantificeret i forhold til antallet af endosomes ved hjælp af CellProfiler software. Data er medianen ± s.e.m. (n = 3). Data er middel ± s.d. (n = 3). 5 min versus 15 min (IF P= 0.0736), 5 min versus 30 min (* P = 0.0195), og 15 min versus 30 min (IF P = 0.3129). (C)Tidlig endosomes (EBS) renset fra Hela celler udtryk for normal god landbrugspraksis-Rab5 og HeLa cytosol blev udarbejdet særskilt, og analysen blev udført som i figur 2A. Prøverne blev fastsat efter 7 min. Den midterste panel viser den samme Mikrograf, med overlapningen af spor af F-actin strukturer trukket bruger NeuronJ plugin13 ImageJ software. Højre panel viser spor kun. Skalalinjen = 10 µm. (D) repræsentation af F-actin strukturere nummereringssekvensen bruges i kvantificering med ImageJ software. (E) kvantificering af antallet af actin filamenter, som defineret i C-D. Data er middel ± s.d. (n = 3). Primære grene versus sekundære grene (ns P = 0.5262), sekundære grene versus andre grene (IF P = 0.6815), og primære grene versus andre grene (ns P = 0.2254). (F) længden af F-actin strukturer og antallet af EBS pr. actin struktur er vist som eksempler på andre parametre end kan analyseres med kvantificeringen defineret i C-D. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktin spiller en afgørende rolle i endosome membranen dynamics4,14. Vi har tidligere rapporteret at actin Nukleering og polymerisation forekomme på tidlig endosomes, danner små F-actin patches eller netværk. Disse F-actin netværk er absolut nødvendige for membran transport ud over tidlige endosomes langs Nedbrydningsvejen. At gribe ind på alle trin i denne Nukleering og polymerisation proces forhindrer endosome modning og dermed downstream transport mod slutningen endosomes andlysosomes9,11,15. Navnlig, brugte vi analysen beskrevet ovenfor, til at analysere de sekventielle trin F-actin polymerisering på tidlig endosomes og at karakterisere processen på molekylært niveau.
I disse eksperimenter, er tidlig endosomes mærket med normal god landbrugspraksis-RAB5 i vivo, renset af subcellulært fraktionering og inkuberes i et reagensglas i cytosol til F-actin polymerisering i vitro. På det ønskede tidspunkt, reaktionen standses og reaktionsblandingen er overføres til et mikroskopisk dias for analyse af Fluorescens mikroskopi, bruger phalloidin til at mærke F-actin. Bruger denne eksperimentelle strategi, viste vi at annexin A2 er nødvendige for Nukleering af F-actin på tidlig endosomes, sammen med SPIRE1, mens ARP2/3 medierer F-actin forgrening, som forventet. Vi viste også, at moesin og cortactin er nødvendig for dannelsen af de F-actin netværk, der mægle ECV/MVB Biogenese og modning langs Nedbrydningsvejen i pattedyrceller9,11.
Det er vigtigt at huske på, at selv lave niveauer af ectopically udtrykt RAB5 ikke ændrer endosomes til nogen væsentlig grad10, denne lille GTPase er et centralt regulator af tidlige endosome membran dynamics16,17 . I nogle forsøg, kan det derfor være hensigtsmæssigt at etiket endosomes i analysen ved hjælp af alternative protokoller. For eksempel, kan tidlig endosomes være bekvemt mærket ved hjælp af endocytosed fluorescerende sporstoffer, såsom epidermal vækstfaktor eller transferrin4,14.
Det bør også bemærkes, at det er teknisk vanskeligt at billedet individuelle actin filamenter med konventionelle Konfokal mikroskopi. Derfor henviser vi til F-actin strukturer i hele teksten til at beskrive actin netværk på endosomes. Som følge heraf mener vi, at dannelsen af en F-actin netværk kan kvantificeres mere præcist ved at måle fluorescens areal af net snarere end deres intensitet.
Det er ikke let at helt udelukke muligheden for, at actin Nukleering aktiviteten observeret i in vitro er medieret af nogle andre struktur eller organelle, der forbliver bundet til RAB5 endosomes under rensningen. Sådan kontaminering er imidlertid usandsynligt. Mens nogle organeller Co rense på hældninger på grund af ens fysiske egenskaber, de har ikke tendens til at være kvantitativt bundet til hinanden efter rensning. Derudover afhænger actin Nukleering aktivitet strengt af annexin A24,14, som er til stede på tidlig endosomes indeholdende RAB514. Endelig finder vi, at F-actin strukturer er knyttet selektivt til RAB5 endosomes i vivo og findes ikke på andre endosomes eller andre cellulære membraner4,14. Afslutningsvis er actin Nukleering aktivitet sandsynligvis forbundet med RAB5 endosomes, da denne aktivitet Co renser og co lokaliserer med RAB5 endosomes.
I denne analyse er meget som i andre assays, at Rekonstituer de komplekse biokemiske reaktioner der styrer dynamikken i endosomes16 eller andre membraner18 og der er udført i et reagensglas, det vigtigt at sikre, at præparatet de cellulære ekstrakter er optimal. Celler skal være homogeniseret blid betingelser til at begrænse skader på endosomes og andre organeller, især kerner og lysosomer. Også, endosome fraktioner skal holdes på is under forhold, der minimerer osmotisk og ioniske stress samt spontan actin polymerisering. I yderligere, relativt høje koncentrationer af endosome fraktion (≥0.1 mg/mL) og cytosol (≥3 mg/mL) er nødvendige for passende F-actin polymerisering på endosomes og opdagelse, som angivet i trin 3.13 og 4.4, henholdsvis. Det er ligeledes vigtigt at gennemføre analysen med en 1:10 forholdet mellem endosome til cytosol (protein: protein), som angivet i trin 5.1.1. Endelig, pipettering efter actin polymerisation (dvs., at tilføje PFA og phalloidin) skal gøres meget forsigtigt for at undgå kollaps eller bryde actin netværk.
Hvis nødvendigt, kan in vitro- actin polymerisering assay også der foretages direkte i et mikroskop imaging kammer, efter at tilføje renset rodamin-actin til assay blandingen, at begrænse mekaniske perturbationer af actin netværk polymeriserede på endosomes (Se trin 5.2.3 og figur 2). I dette tilfælde er det bedst at justere ekstrakt til 26,5% (0.85 M) saccharose (refraktive indeks af 1.375), begrænsende diffusion og Brownske-lignende motion (skridt 5.2.3), og at fjerne mulige aggregater af renset rodamin-actin af ultracentrifugering før brug. Vores bemærkninger at moesin styrer dannelsen af F-actin netværk på endosomes var fuldt sammenfattet ved hjælp af dette alternativ version af vores assay4,14.
Enten version af vores protokol, i prøveglasset eller i den billeddiagnostiske afdeling, er optimalt for en global analyse af F-actin Nukleering og polymerisering på endosomes. Det er imidlertid ikke let at følge actin polymerisering proces gennem tid ved hjælp af denne fremgangsmåde, dels fordi endosomes ikke er immobile. Derfor er det ikke let at overvåge vækst af enkelte filamenter og dermed bestemme historie af actin netværk. For eksempel kan det være svært at diskriminere F-actin forgrening fra crosslinking. Men, vi er overbeviste om, at betingelserne for at overvåge F-actin polymerisering i realtid kan forbedres i den billeddiagnostiske afdeling ved at optimere betingelserne for at immobilisere endosomes. Ligeledes vil det være interessant at overvåge F-actin polymerisering fra kunstige membraner ved hjælp af renset komponenter. Faktisk har viste vi tidligere at F-actin Nukleering og polymerisering kan forekomme på Liposomer efter bindende than Nukleering faktor annexin A2 på Liposom tolagede11. Denne strategi vil være nyttigt at yderligere dissekere specifikke lipider og proteiner i F-actin Nukleering og polymerisation rolle og til at karakterisere de minimale komponenter nødvendigt at danne en F-actin netværk på endosomal membraner. Endelig mener vi, at denne strategi vil være meget nyttigt at studere andre F-actin-afhængige processer, der forekommer på endosome membraner, især rekruttering og mobilisering af retromer/vask maskiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Støtte blev modtaget fra den schweiziske National Science Foundation; den schweiziske Sinergia program; Polsk-schweizisk forskning program (2010/PSPB-094); NCCR i kemisk biologi; og LipidX fra den schweiziske SystemsX.ch initiativ, evalueres af den schweiziske National Science Foundation (til J. G.). O. M. blev støttet af en EMBO langsigtede fellowship (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
