Summary
Frühen Endosom Funktionen hängen F-Aktin-Polymerisation. Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu biochemischen und genetischen Manipulationen.
Abstract
Viele frühen Endosom Funktionen, insbesondere Ladung Eiweiß Sortier- und Membran Verformung, kurz F-Aktin-Filamente kernhaltige auf Endosomal Membrane Flecken hängen. Wir haben festgestellt, einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt, wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu genetischen und biochemischen Manipulationen. Endosomal Fraktionen werden von float in Saccharose Steigungen aus Zellen, die mit dem Ausdruck der frühen Endosomal Protein GFP-RAB5 vorbereitet. Cytosolischen Brüche bereiten wir aus separaten Chargen von Zellen. Endosomal und cytosolischen Brüche können gespeichert werden in flüssigem Stickstoff eingefroren bei Bedarf. In dem Assay Endosomal und cytosolischen Brüche werden gemischt und die Mischung wird bei 37 ° C unter geeigneten Bedingungen (z. B. Ionenstärke, Verringerung der Umwelt) inkubiert. Zum gewünschten Zeitpunkt die Reaktionsmischung ist fest und die F-Aktin erschließt sich mit Phalloidin. Aktin Nukleation und Polymerisation werden dann durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Hier berichten wir, dass dieser Test verwendet werden, um die Rolle der Faktoren zu untersuchen, die entweder in Aktin Nukleation auf der Membran oder im nachfolgenden Dehnung, Verzweigungen oder Vernetzung von F-Aktin-Filamente beteiligt sind.
Introduction
In höheren Eukaryoten Zellen sind Proteine und Lipide in frühen Endosomen verinnerlicht wo sortieren auftritt. Einige Proteine und Lipide, die dazu bestimmt sind, bespielt werden, werden in röhrenförmigen Regionen von den frühen Endosomen aufgenommen und dann transportiert die Plasmamembran oder die Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)1,2. Im Gegensatz dazu sind andere Proteine und Lipide selektiv in Regionen von den frühen Endosomen verpackt, die ein multivesicular Erscheinungsbild aufweisen. Diese Regionen zu erweitern und nach Loslösung von frühen Endosomal Membranen, schließlich Reifen in freien Endosomal Träger Vesikel oder multivesicular Einrichtungen (ECV/MVBs), die verantwortlich sind für die Güterbeförderung in Richtung späten Endosomen1, 2.
Aktin spielt eine entscheidende Rolle in dem Umbau Membranverfahren Endosomal Sortierkapazität und Endosom Biogenese zugeordnet. Protein sortieren auf den recycling Bahnen um die Plasmamembran oder die TGN richtet sich nach der komplexen Retromer und die damit verbundenen Proteine. Diese Sortierung Maschinen scheint die Bildung von recycling Tubuli über Wechselwirkungen von komplexen, Retromer mit der Wespe und Narbe homolog (WASH) komplexen und verzweigten Aktin3,4,5 gekoppelt werden . Im Gegensatz dazu Moleküle bestimmt für Abbau, besonders Signalisierung Rezeptoren aktiviert, die Endosomal Sortierung komplexe erforderlich für Transport (ESCRT)2,6in Intraluminal Vesikel (ILVs) sortiert sind, 7. Während die mögliche Rolle von Actin in der ESCRT-abhängige Sortiervorgang nicht bekannt ist, spielt F-Aktin eine wichtige Rolle in der Biogenese der ECV/MVBs und Transport über frühen Endosomen. Vor allem fanden wir, dass annexin A2 bindet Cholesterin angereicherte Regionen der frühen Endosom und zusammen mit spire1, nucleates F-Aktin-Polymerisation. Die Bildung der verzweigten Aktin-Netzwerks auf Endosomen beobachtet erfordert die verzweigte Aktivität des Proteins Aktin-bezogene (ARP) 2/3 Komplex, sowie der ERM-Protein-Moesin und die Aktin-bindende Protein Cortactin8,9.
Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern wiederherstellt. Dieser Test hat früher zu untersuchen, die Rolle von annexin A2 in F-Aktin Nukleation und Moesin und Cortactin bei der Bildung der Endosomal Aktin Netze8,9. Mit diesem Protokoll in Vitro werden die komplexen Abfolge von Reaktionen auf Endosomen während Aktin-Polymerisation der biochemischen und molekularen Analyse der sequentielle Schritte des Prozesses, einschließlich Aktin Nukleation, lineare zugänglicher Polymerisation, Verzweigung und Vernetzung.
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Protocol
1. Lösungen und Vorbereitungen
Hinweis: alle Puffer und Lösungen sollten bereit sein, in bidestilliertem (Dd) H 2 O. Da die Hydratation Zustand von Saccharose variiert, die Endkonzentration aller Saccharose-Lösungen muss ermittelt werden mit einem Refraktometer.
- Prepare Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne zweiwertigen kationen (PBS-): 137 mM NAKI, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 und 6,5 mM Na 2 HPO 4. Den pH-Wert 7,4 einstellen. Sterilisieren durch Autoklavieren (1 Zyklus bei 121 ° C für 15 min) und bei Raumtemperatur lagern.
- 300 mM Imidazol-Stammlösung vorbereiten: 0,204 g Imidazol in 10 mL DdH 2 O.Adjust der pH-Wert 7,4 bei 4 ° C mit HCl. Filter-Sterilisieren mit 0,22 μm pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° c
- Vorbereiten Homogenisierung Puffer (HB; vorbereiten ca. 100 mL): 250 mM Saccharose in 3 mM Imidazol. Anpassen des pH-Werts 7,4 bei 4 ° C mit einem pH-Meter. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22 μm Pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° C. Ergänzung der HB kurz vor Gebrauch mit einem Cocktail von Protease-Inhibitoren bei Endkonzentrationen entspricht 10 mM Leupeptin, 1 mM Pepstatin A und 10 ng/mL Aprotinin.
- Für Schritt Floating Farbverläufe, vorbereiten, 62 %, 39 % und 35 % Saccharose-Lösungen in 3 mM Imidazol, pH 7,4, wie unten beschrieben. Genau zu bestimmen, die Endkonzentration aller Saccharose-Lösungen mit einem Refraktometer.
- Vorbereiten 100 mL 62 % Saccharoselösung in 3 mM Imidazol, pH 7.4. Auflösen von DdH 2 O 80,4 g Saccharose einrühren vorgewärmt, 35 ° C. Fügen Sie 1 mL 300 mM Imidazol-Stammlösung und Füllung zu 100 mL mit DdH 2 O. anpassen den pH-Wert 7,4 bei 4 ° c Filter-Sterilisieren mit 0,22 μm Pore Größe Filter und Speicher bei 4 ° c
- Bereiten 100 mL 35 % Saccharoselösung in 3 mM Imidazol, pH 7.4. Auflösen von 40,6 g Saccharose in DdH 2 O. Add 1 mL 300 mM Imidazol-Stammlösung rühren und füllen bis 100 mL mit DdH 2 O. anpassen den pH-Wert 7,4 4 ° C. Filter Sterilisieren mit 0,22 μm pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° c
- Bereiten 39 % Saccharose in 3 mM Imidazol, pH 7,4 50 mL. Verdünnen Sie die 62 % Saccharose-Lösung mit 35 % Saccharoselösung. Shop bei 4 ° c
- 3 g Paraformaldehyd (PFA) durch Rühren in 100 mL PBS-pre-warmed bis 60 ° C unter Zugabe von 1 M NaOH tropfenweise auflösen; den endgültige pH-Wert 7,4 mit NaOH einstellen. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-μm-Pore-Größe-Filter und Lagerung bei-20 ° c
Achtung: 3 % PFA ist eine toxische Reagenzien. - Bereiten Sie 1 M KCl-Stammlösung. 3,73 g KCl durch Rühren in 50 mL DdH 2 O. Filter-sterilisieren Sie einen 0,22-μm Pore Größe Filter verwenden und bei Raumtemperatur lagern.
- Vorbereiten 50 X konzentrierte Stammlösung mit 0,625 M Hepes bei pH 7,0 und 75 mM MgOAc 2 in DdH 2 O. Aliquot und Speicher bei-20 ° c Eindeckmedium
- vorbereiten. Durch Rühren 2,4 g Poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) mit 6 g Glycerin mischen. 6 mL DdH 2 O und lassen für mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Fügen Sie 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) und Hitze auf etwa 53 ° C mit gelegentlichen rühren, bis die PVA aufgelöst hat.
- Klären die Lösung durch Zentrifugation bei 5.000 X g für 20 min bei Raumtemperatur. Erfassen den Überstand und Hinzufügen von 2,5 % (w/V) 1,4 - Diazabicyclo-[2.2.2] Oktan (DABCO) Immunofluoreszenz bei Fluoreszenz-Erkennung zu verhindern. Wirbel für ca. 30 s, aufzulösen. Aliquoten in 1,5 mL-Kunststoff-Rohre und bei-20 ° c
2. Zellkultur
- Kultur HeLa-Zellen in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 10 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 % L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Pflegen sie bei 37 ° C in einem 5 % CO 2 Inkubator.
- Transfect Zellen 24 h vor dem Experiment mit GFP-RAB5 10, mit kommerziellen Transfection Reagens laut Hersteller ' Anweisungen s.
- Im Bedarfsfall bereiten Endosomal Brüche und Zytosol von Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder eine Wildtyp oder mutierte Form des Proteins des Interesses überexprimierenden erschöpft.
3. Endosomal Bruchteil Vorbereitung
Hinweis: dieses Protokoll beschreibt die direkte Vorbereitung der subzellularen Brüche mit Endosomen und anderen leichten Membranen. Bei Bedarf können gereinigtes Endosom Fraktionen auch gebrauchte 11 sein. Bereiten Sie 2 Petrischalen (10 cm Außendurchmesser; 57 cm 2) konfluierende Zellen GFP-RAB5 als Ausgangsmaterial zum Ausdruck zu bringen. Die Gesamtzahl der konfluierende HeLa-Zellen in 2 Petrischalen entspricht etwa 2,5 x 10 7 Zellen. Wenn nötig, die Endosomen auch zubereitet werden aus den Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder überexprimiert eine Wildtyp oder mutierte Form des Proteins des Interesses, immer Ausdruck GFP-RAB5 erschöpft.
Vorsicht: sollten alle Schritte des Protokolls Fraktionierung auf Ice durchgeführt werden
- Die Petrischalen auf eine nasse Metallplatte in eine flache Eiskübel und waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL eiskaltem PBS-.
- Entfernen Sie alle PBS - aus dem letzten Waschen und 3 mL eiskaltem PBS-pro Schale. Zellen sollten nicht während der Behandlung trocken: bei Bedarf legen Sie den Eiskübel auf eine rockende Plattform, die Zellen mit Flüssigkeit ausreichend abdeckt.
- Mechanisch entfernen die Zellen mit PBS-Puffer aus die Petrischalen mit einem flexiblem Polizisten (d. h. hausgemachte Zelle Schaber). Kratzen Sie die Zellen aus der Gerichte zuerst in einer schnellen, kreisförmigen Bewegung um die Außenseite der Schale, gefolgt von einer Abwärtsbewegung in der Mitte der Schale. Schaben sanft zu " Blätter " der angeschlossenen Zellen. Sanft zu übertragen die Zellen mit einer Kunststoff Pasteurpipette mit einer weiten Öffnung, eine 15 mL konische Polypropylen Rohr auf Ice
- Zentrifuge für 5 min bei 175 X g und 4 ° C.
- Sanft entfernen den überstand (SN) und 1-3 mL HB zum Pellet. Mit einer Kunststoff Pasteurpipette mit einer weiten Öffnung sanft nach oben und unten einmal um die Zellen zu Aufschwemmen pipette.
- Zentrifuge für ca. 7-10 min bei 1.355 x g und 4 ° C. sanft entfernen die SN.
- Zelle Homogenisierung führen.
Hinweis: Bedingungen sollen sanft damit die Plasmamembranen der Zellen gebrochen sind, aber die Endosomen intakt bleiben.- Hinzufügen eines bekannten Volumens von HB mit Protease-Inhibitoren auf jede Zelle Pellet (ca. 100 μl pro Zelle Pellet). Pipette mit einer Mikropipette 1.000 µL, sanft nach oben und unten, bis die Zellen Nukleinsäuretablette sind. Tue nicht Luftblasen einzuführen.
- Vorbereitung eine 1-mL Tuberkulin-Spritze mit einer 22G Nadel vorher gespült mit HB und frei von Luft oder Luftblasen.
- Füllen Sie die Spritze mit der Zellsuspension relativ langsam (damit keine Luftblasen), legen Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel an der Wand des Rohres und vertreiben die Zellsuspension schnell auf die Plasmamembranen der angeschlossenen Zellen zu scheren.
- Nehmen Sie eine kleine aliquoten Homogenat (ca. 3 µL) und in 50 µL HB auf einen Objektträger zu verdünnen. Mischen und mit einem Glas Deckgläschen abdecken. Homogenat unter dem Phasenkontrast-Mikroskop verfügt über einen 20 X oder 40 X Objektiv zu inspizieren.
Hinweis: Unter optimalen Bedingungen, die meisten Zellen sind gebrochen, aber Kerne, die als dunkelgrau erscheinen und Runde Strukturen, sind nicht ( Abbildung 1). - Wiederholen Sie Schritt 3.7.3 und 3.7.4 bis die meisten Zellen sind gebrochen; in der Regel 3-6 wechselvollen Striche durch die Nadel notwendig sind. Halten Sie eine kleine aliquoten (10-30 µL) von Homogenat zur Proteinbestimmung.
- Zentrifuge Homogenat für 7 min bei 1.355 x g und 4 ° c
Hinweis: nach der Zentrifugierung, das Pellet (definiert als die nuklearen Pellet; NP) enthält die Kerne und der Überstand (definiert als die postnukleare überstand; PNS) enthält die Zellflüssigkeit und die Organellen auf Homogenisierung und frei schwebend veröffentlicht. - Sammeln sorgfältig die PNS. Halten Sie kleine aliquoten (10-30 µL) des PNS und NP zur Proteinbestimmung und entsorgen Sie die NP.
- Einstellen der PNS 40,6 % Saccharose durch das Verdünnen der 62 % Saccharose-Lösung mit PNS 1:1.1 Verhältnis von PNS:62 % Saccharose. Mischen Sie sanft aber gründlich, ohne Luftblasen zu erstellen. Überprüfen Sie die Saccharose-Konzentration mit dem Refraktometer.
- Ort der PNS bei 40,6 % Saccharose am unteren Rand eine Ultrazentrifugation Rohr. Sorgfältig mit 2,5 mL 35 % Saccharoselösung überlagern und füllen die Zentrifugenröhrchen mit HB.
Hinweis: Die Saccharose-Lösungen sollten geschichtet werden, so dass Schnittstellen deutlich sichtbar sind. - Ultrazentrifuge Gradienten für 1 h bei ̴165, 000 X g und 4 ° c
- Entfernen Sie vorsichtig die weiße Schicht von Lipiden auf den Farbverlauf. Sammeln Sie als nächstes die Schnittstelle mit Endosomen zwischen HB und 35 % Saccharose, mit einer 200 μL Mikropipette mit Cut Spitze.
Hinweis: Die Endosomal Brüche können direkt in die in-vitro- Actin Polymerisierung Assay verwendet werden oder kann regelmÄÑig auf dem Eis, Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C. - Bestimmen die Proteinkonzentration der PNS und Endosomal Brüche.
Hinweis: Diese Konzentration sollte mindestens 100 µg/mL. Ca. 2,5 x 10 7 Zellen in 2 Petrischalen gewachsen sind notwendig, um ein PNS mit mindestens 100 µg/mL zu erhalten (siehe Hinweis oben).
4. Zytosol Vorbereitung
Hinweis: bereiten Sie 2 Petrischalen (10 cm Durchmesser; 57 cm 2) konfluierende HeLa-Zellen als Ausgangsmaterial. Bei Bedarf kann die Zellflüssigkeit auch aus Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder überexprimiert ein Wildtyp oder die mutierte Form des Proteins des Interesses erschöpft vorbereitet werden. Für das Endosom Fraktionierung Protokoll sollten alle Schritte durchgeführt werden, auf Ice
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8.
- Legen Sie die PNS in ein Zentrifugenröhrchen und Ultrazentrifugen für 45 min bei ̴250, 000 X g und 4 ° c
- Sorgfältig entfernen Sie die weiße Schicht an der Spitze und die SN (Zytosol Bruch) zu sammeln, ohne störende Microsome Pellet. Halten Sie ein Aliquot der Zellflüssigkeit Fraktion zur Proteinbestimmung.
Hinweis: Die Zellflüssigkeit kann direkt in die in-vitro- Actin Polymerisierung Assay verwendet werden oder kann regelmÄÑig auf dem Eis, Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C. - Bestimmen die Konzentration des Proteins von dem Zytosol.
Hinweis: Es sollte mindestens 3 mg/mL.
5. Measuring Endosom-abhängige Aktin-Polymerisation In Vitro Assay
Hinweis: Endosom-abhängige Aktin-Polymerisation kann mit zwei alternative Vorgehensweisen durchgeführt werden. Bei dem ersten Ansatz werden die Materialien gemischt in einem Reagenzglas, fixiert, und auf einem Deckgläschen übertragen und analysiert. Im zweiten Ansatz, der hier beschrieben wird kann der Test direkt in der bildgebenden Kammer durchgeführt werden und können behoben und analysiert werden ohne mechanische Störung ( Abbildung 2). In diesem zweiten Ansatz die Assay-Mischung ist nicht aus einem Reagenzglas auf einem Deckgläschen übertragen und somit bleibt unbeirrt, verringert die Gefahr von F-Aktin-Netzwerken wird physisch während der Übertragung gestört. Darüber hinaus ist der zweite Ansatz kompatibel mit einer Zeitraffer-Analyse der F-Aktin-Polymerisation. Es sei darauf hingewiesen, dass kein Unterschied in der Analyse von F-Aktin-Polymerisation mit beiden Ansätzen beobachtet wurde.
Hinweis: Verwendung schneiden Tipps im gesamten Protokoll.
- In einem Reagenzglas
- sanft Mischung eiskalte gereinigten GFP-RAB5 Endosomen (Schritt 3) mit Zytosol (Schritt 4) in einem Verhältnis von 01:10 (Proteinkonzentration) in eine eiskalte 1,5 mL konische Röhrchen.
Hinweis: Ein typisches Experiment erfolgt mit ca. 40-50 µL. - Stellen Sie das eiskalte Reaktionsgemisch zu Endkonzentrationen von 125 mM KCl (mit 1 M KCl Vorratslösung), 12,5 mM Hepes und 1,5 mM MgOAc 2 (mit den 50 x Stammlösung). Passen Sie dann die Mischung mit Protease-Inhibitoren, Endkonzentrationen von 10 mM Leupeptin, 1 mM Pepstatin A und 10 ng/mL Aprotinin. Vorsichtig mischen aller Komponenten.
- Legen Sie das Reagenzglas mit der Reaktionsmischung bei 37 ° C, ohne Zittern, und die gewünschte Zeit inkubieren.
Hinweis: In der Regel dauert es ca. 3 min, Aktin-Polymerisation Endosomen und 30 min für die Bildung eines umfassenden Netzwerks erkennen. - Zum gewünschten Zeitpunkt (z.B. 3 min oder 30 min), die Reaktion zu stoppen, indem man das Reagenzglas auf Eis und fügen Sie 1/10 (Vol:vol) der vorgekühlte 3 % PFA Lösung.
- 0.3:10 (Vol:vol) von 200 Einheiten/mL (~6.6 μM) Phalloidin konjugiert, rot-Orange Färbung der polymerisierte Actin Fleck hinzufügen.
- Ort 12 μL der Mischung auf 12 μL PVA Eindeckmedium auf einem Mikro Objektträger. Setzen Sie ein 18 x 18 mm 2 Coverslipon Glasplatte.
- Analyse die Probe mit der konfokalen Mikroskopie.
- sanft Mischung eiskalte gereinigten GFP-RAB5 Endosomen (Schritt 3) mit Zytosol (Schritt 4) in einem Verhältnis von 01:10 (Proteinkonzentration) in eine eiskalte 1,5 mL konische Röhrchen.
- In der bildgebenden Kammer
- um mikroskopische Bildgebung Kammern, verwenden Plasma Reiniger für 1 min zu einem Deckgläschen rund 18 mm Durchmesser und rund 35 mm Durchmesser Petrischale, ausgestattet mit einem 20 mm Glasboden reinigen (0,16 0,19 mm).
- Inkubieren Sie die gereinigten Oberflächen mit 1 % β-Casein für 20 min, Proteinbindung, das Glas zu minimieren. Waschen zweimal mit 3 mM Imidazol.
- Add Endosom und Zytosol, in der gleichen Mischung wie in den Schritten 5.1.1 und 5.1.2, in eine vorgekühlte 1,5 mL Teströhrchen assay und ergänzen die Assay-Mischung mit 0,1 μg/μL Rhodamin-Aktin.
- Einstellen der endgültigen Brechungsindex des Gemisches auf 1,375 (26,5 % Saccharose) mit 39 % Saccharoselösung.
Hinweis: In der Regel wird das gleiche Volumen hinzugefügt; Dies muss jedoch werden empirisch nachjustiert, abhängig von der Saccharose-Konzentration von der gesammelten Bruch, anhand einer Refractometer, da die Saccharose-Konzentration von Experiment zu Experiment leicht ändern kann. - Legen Sie die Mischung auf die vorbehandelte 35-mm-Schale (Schritt 5.2.1) und bedecken Sie es mit der vorbehandelten 18 mm Deckglas (Schritt 5.2.1).
- Legen Sie die Kammer bei 37 ° C ohne schütteln.
- Analyse der Probe mittels konfokale Fluoreszenzmikroskopie.
6. Bild-AcFassung und Analyse von Aktin Netzwerk
- Bildaufnahme
- erwerben die Bilder auf einem inversen Scan confocal Mikroskop.
Hinweis: Erwerb Bildeinstellungen wurden für eine invertierte Scan confocal Mikroskop mit einem 63 X 1,25 NA Öl Ziel optimiert. Passen Sie die Leistung des Lasers (in der Regel ca. 50 %), ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
- erwerben die Bilder auf einem inversen Scan confocal Mikroskop.
- Quantifizierung des Aktin-Netzwerks
- fluoreszierenden Mikrographen zu analysieren. Die Opensource-Software CellProfiler (v2.1.1) 12 verwenden, um die Menge an Aktin pro Endosom messen (alternative Software kann verwendet werden).
- Ermitteln Sie zuerst Endosomen als das primäre Objekt mit der GFP-RAB5-Signal. Dann die F-Aktin verbunden mit individuellen Endosomen mit der Ausbreitung der Aktin-Signals zu quantifizieren (rot-Orange Farbstoff konjugiert Phalloidin) als sekundäre Objekt.
- Durchschnittliche und normalisieren die Nummer des zugehörigen Materials für jedes Objekt in der Kontrollbedingung.
- fluoreszierenden Mikrographen zu analysieren. Die Opensource-Software CellProfiler (v2.1.1) 12 verwenden, um die Menge an Aktin pro Endosom messen (alternative Software kann verwendet werden).
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Representative Results
Um Einblicke in die Entstehung von F-Aktin-Patches auf frühen Endosom Membranen, folgten wir das Protokoll gemäß Abbildung 2. Kurz, Zellen wurden mit GFP-RAB5 transfiziert und dann frühen Endosomen von subzellulären Fraktionierung vorbereitet wurden. Diese gereinigten frühen Endosomen wurden mit Zytosol inkubiert, um Aktin sowie andere Faktoren, die möglicherweise in der Reaktion zur Verfügung zu stellen. Am Ende der Inkubationszeit war die Reaktion durch Fixierung des Gemisches gestoppt. Eine Probe wurde dann gesammelt und auf einer mikroskopischen Folie hinterlegt. Zu guter Letzt zeigte sich F-Aktin mit Phalloidin (Abb. 3A). Die Keimbildung der F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen sowie der anschließende Polymerisation kam schnell. F-Aktin könnte in der Tat bereits auf Endosomen innerhalb von 1 min. nach dem Beginn der Reaktion (Abbildung 3A) visualisiert werden. Diese Aktin Strukturen, die zunächst kurz waren, wurden schnell länger, verzweigte und in Verbindung mit einander, was zur Bildung eines verwobenen Netzes von Actinfilamente (Abbildung 3A), spiegelt vermutlich unausgewogen Aktin Dynamik in-vitro. Ähnliche Keimbildung und Polymerisation Preise wurden beobachtet, wenn der Test mit gereinigtem Rhodamin beschriftet Aktin neben Zytosol der Zelle durchgeführt wurde. Dies erfolgte im Glasboden-Gerichte, so dass Strukturen direkt, ohne jede Störung (Abb. 3 b) abgebildet werden konnten. In der hier beschriebenen Test Keimbildung frühen Endosomen selektiv de-Novo-Aktin-Polymerisation. Aktin-Polymerisation in der Tat nicht auftreten, wenn die in-vitro- Reaktion in der Abwesenheit von Endosomen oder Zytosol durchgeführt wurde. Es kann somit geschlossen werden, dass frühe Endosomen die grundlegende Fähigkeit zur Unterstützung der Keimbildung und anschließende Polymerisation von Actin Filamente9,11 besitzen.
Um die Menge an Aktin polymerisiert aus Endosomen zu analysieren, wurden Bilder, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten erworben mit CellProfiler (Abb. 4A) analysiert. Die Menge an Aktin polymerisiert pro Endosom wurde als die Gegend rund um einen einzelnen frühen Endosom Actin gemessen. Die Aktin-Polymerisation-Rate lag zu Beginn des Prozesses und ging mit der Zeit (Abbildung 4 b). Das Aktin-Netzwerk könnte etwas ausführlicher zu frühen Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion analysiert werden. Zu diesen frühen Zeitpunkten könnte einzelne Actin-haltigen Strukturen werden noch unterschieden werden von einander. Um die komplexe Organisation von Aktin-Netzwerken zu bewerten, wurde die Anzahl der Actinfilamente aus jeder Endosom gezählt (z. B. primäre Filamente). Ebenso wurden Actinfilamente aus primären Filamente (d.h. sekundäre Filamente) gezählt und die Anzahl der anderen Actinfilamente in den Netzwerken identifiziert werden konnte und das stammt nicht aus Endosomen (, d. h., andere Filamente) (Abbildung 4-E. Sobald die Actinfilamente aufgezeichnet wurden, andere Parameter, berechnet wie z. B. Länge der einzelnen Actinfilamente und Anzahl der Endosomen verbunden mit der gleichen Actinfilamente könnte leicht (Abbildung 4F).
Abbildung 1: Phase Kontrast Schliffbild der eine HeLa-Zelle Homogenat. Nach der Homogenisierung wurde der Extrakt von mikroskopisch kleinen Rutsche und einem Deckgläschen montiert. Für die Veröffentlichung wurden Mikrographen ein 100 X Objektiv nach Ölimmersion gefangen genommen. Für Routine-Inspektion war jedoch der Zelle Extrakt unter 20 X oder einem 40 X Objektiv ohne Ölimmersion visualisiert. Zwei Beispiele für hohe Vergrößerung Blick auf das Homogenat sind (A-B). Kerne (Stern) erscheinen als Runde Strukturen dunkel grau in der Farbe, ohne angehängte Zelle Reste. Pfeile zeigen auf die charakteristischen Granulat von unterschiedlicher Größe, Form und Lichtdurchlässigkeit, die bei der Homogenisierung der Zelle freigesetzt und intrazellulären Materialien (d. h. Organellen) entsprechen. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Protokolls. Schematische Darstellung der Protokolle, die Endosomal Extrakte (A) und Zytosol Extrakte (B) vorzubereiten und Aktin-Polymerisation von Endosomen in Vitro (C) zu überwachen. Überstand (SN), Homogenisierung Puffer (HB), postnukleare überstand (PNS), nukleare Pellet (NP) und Paraformaldehyd (PFA). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen In Vitro. (A) Endosomen gereinigt von Hela-Zellen mit dem Ausdruck ihrer GFP-Rab5 (grün) und HeLa Zytosol wurden separat vorbereitet. In der Probe waren frühe Endosomen (EBS) mit Zytosol gemischt und das Gemisch wurde inkubiert für die angegebenen Zeiten. Die Mischung wurde dann behoben, mit Phalloidin Label F-Aktin (rot) gekennzeichnet und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Bars: 10 µm (Oberseite) und 5 µm (Bodenplatte). (B) EBS gereinigt von Hela-Zellen mit dem Ausdruck GFP-Rab5 (grün) und HeLa Zytosol separat vorbereitet wurden. Diese Zellextrakte inkubiert mit gereinigtem Rhodamin-Aktin (rot) für den angegebenen Zeiten im Mikroskop Kammern und analysiert wurden durch konfokale Mikroskopie. Maßstabsleiste = 10 µm. (C) der Versuch wurde durchgeführt, wie in A. HeLa Zytosol (ohne EBS) und HeLa Endosomen (grün) mit GFP-Rab5 (ohne Zytosol) gekennzeichnet wurden separat inkubiert (linken und mittleren Platten) oder zusammen (rechte Abbildung) für 30 min behoben, beschriftet mit Phalloidin (rot) Label F-Aktin und analysiert konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Analyse des Netzwerks Aktin. (A) Workflow der CellProfiler Analyse. (B) Anzahl der polymerisierte Actin wurden quantifiziert, bezogen auf die Zahl der Endosomen mit Hilfe der CellProfiler Software. Daten sind Median ± s.e.m (n = 3). Daten sind Mittel ± s.d. (n = 3). 5 min im Vergleich zu 15 min (ns P= 0.0736), 5 min im Vergleich zu 30 min (* P = 0.0195), und 15 min im Vergleich zu 30 min (ns P = 0.3129). (C)Frühe Endosomen (EBS) von Hela-Zellen mit dem Ausdruck GFP-Rab5 und HeLa Zytosol gereinigt separat vorbereitet wurden, und der Test wurde durchgeführt, wie in Abbildung 2A. Proben wurden nach 7 min fixiert. Der mittleren Spalte zeigt die gleichen Schliffbild mit der Überlappung von den Spuren der F-Aktin-Strukturen mit NeuronJ Plugin13 der ImageJ Software gezeichnet. Im Rechte Bereich zeigt die Spuren nur. Maßstabsleiste = 10 µm. (D) Darstellung der F-Aktin strukturieren Nummerierung in der Quantifizierung mit ImageJ-Software verwendet. (E) Quantifizierung der Anzahl der Actinfilamente, wie in C-Ddefiniert. Daten sind Mittel ± s.d. (n = 3). Primäre Zweige versus sekundäre Zweige (ns P = 0.5262), sekundäre Zweige im Vergleich zu anderen Branchen (ns P = 0.6815), und primäre Zweige im Vergleich zu anderen Branchen (ns P = 0.2254). (F) die Länge des F-Aktin-Strukturen und die Anzahl der EBS pro Aktin Struktur werden als Beispiele für andere Parameter angezeigt, als mit der Quantifizierung im C-Ddefinierten analysiert werden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Aktin spielt eine entscheidende Rolle im Endosom Membran Dynamik4,14. Wir berichteten bereits, dass Aktin Nukleation und Polymerisation auf frühen Endosomen auftreten bilden kleine F-Aktin Patches oder Netzwerke. Diese F-Aktin-Netzwerke sind absolut erforderlich für Membrantransport über frühen Endosomen den Abbau Weg. Eingriffe bei jedem Schritt dieses Prozesses Keimbildung und Polymerisation verhindert Endosom Reifung und somit nachgelagerten Transport zur späten Endosomen Andlysosomes9,11,15. Insbesondere haben wir den Assay beschriebenen, die aufeinander folgenden Schritten der F-Aktin-Polymerisation auf frühen Endosomen zu analysieren und den Prozess auf molekularer Ebene zu charakterisieren.
In diesen Experimenten sind frühen Endosomen beschriftet mit GFP-RAB5 in Vivodurch subzellulären Fraktionierung gereinigt und inkubiert in einem Reagenzglas in Anwesenheit von Zytosol, um F-Aktin-Polymerisation in Vitrozu ermöglichen. Zum gewünschten Zeitpunkt die Reaktion gestoppt und das Reaktionsgemisch auf einer mikroskopischen Folie für die Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie, Phalloidin, F-Aktin beschriften mit übertragen wird. Diese experimentelle Strategie zeigten wir, dass annexin A2 für die Keimbildung der F-Aktin auf frühen Endosomen, zusammen mit SPIRE1, notwendig ist, während ARP2/3 F-Aktin Verzweigung, vermittelt, wie erwartet. Wir zeigten auch, dass Moesin und Cortactin für die Bildung der F-Aktin Netzwerke erforderlich sind, die ECV/MVB Biogenese und Reifung den Abbau Weg von Säugerzellen9,11vermitteln.
Es ist wichtig zu beachten, dass zwar geringe Mengen an ectopically ausgedrückte RAB5 Endosomen nennenswert10nicht verändern, diese kleine GTPase Schlüsselregulator der frühen Endosom Membran Dynamik16,17 . In einigen Experimenten kann es daher angebracht, Label Endosomen in der Probe unter Verwendung von alternativen Protokollen sein. Beispielsweise können mit Endocytosed Fluoreszenz Tracer, wie epidermalen Wachstumsfaktor oder Transferrin4,14frühen Endosomen bequem beschriftet werden.
Anzumerken ist, dass es technisch schwierig zu Bild einzelne Actinfilamente mit konventionellen konfokalen Mikroskopie. Daher verweisen wir auf F-Aktin Strukturen im gesamten Text, Aktin Netzwerke auf Endosomen zu beschreiben. Infolgedessen fühlen wir uns, dass die Bildung eines F-Aktin-Netzwerks genauer quantifiziert werden kann, durch die Messung der Fluoreszenz Fläche von den Netzen, anstatt ihre Intensität.
Es ist nicht leicht zu völlig ausschließen, dass die Aktin Nukleation Aktivität beobachtet, dass in Vitro vermittelt wird, von einem anderen Struktur oder Organellen, die während der Reinigung an RAB5 Endosomen gebunden bleibt. Solche Verunreinigungen ist jedoch höchst unwahrscheinlich. Während einige Organellen auf Steigungen wegen ähnlichen physikalischen Eigenschaften Co reinigen, neigen sie nicht nach der Reinigung quantitativ verpflichtet bleiben. Darüber hinaus hängt die Aktin Nukleation Aktivität streng von annexin A24,14, die auf frühen Endosomen mit RAB514vorhanden ist. Schließlich finden wir, dass F-Aktin-Strukturen zugeordnet selektiv RAB5 Endosomen in Vivo sind und sich nicht auf andere Endosomen oder andere Zellmembranen4,14 finden. Zusammenfassend ist Aktin Nukleation Aktivität am ehesten RAB5 Endosomen zugeordnet, da diese Tätigkeit Co reinigt und Co mit RAB5 Endosomen lokalisiert.
In diesem Assay unbedingt viel wie in anderen Tests, die den komplexen biochemischen Reaktionen, dass die Kontrolle wiederherzustellen, die die Dynamik der Endosomen16 oder anderen Membranen18 und dass in einem Reagenzglas durchgeführt werden um sicherzustellen, dass die Vorbereitung von die Zellextrakten ist optimal. Zellen sollten unter schonenden Bedingungen zur Schadensbegrenzung Endosomen und anderen Organellen, besonders Kerne und Lysosomen homogenisiert werden. Außerdem sollte Endosom Brüche auf Eis unter Bedingungen gehalten werden, die ionische und osmotischen Stress sowie spontane Aktin-Polymerisation zu minimieren. In zusätzlichen, relativ hohe Konzentrationen von Endosom Bruchteil (≥0.1 mg/mL) und Zytosol (≥3 mg/mL) sind bzw. für ausreichende F-Aktin-Polymerisation auf Endosomen und Erkennung, wie in den Schritten 3.13 und 4.4, erforderlich. Ebenso ist es wichtig für die Durchführung des Tests mit einer 01:10 Verhältnis von Endosom zum Zytosol (Protein: Protein), wie in Schritt 5.1.1 angegeben. Schließlich sollte nach der Aktin-Polymerisation (z. B. hinzufügen von PFA und Phalloidin) pipettieren sehr sanft durchgeführt werden um zu vermeiden, reduzieren oder brechen die Aktin-Netzwerk.
Bei Bedarf kann der in-vitro- Actin Polymerisierung Test auch direkt in einem Mikroskop imaging Kammer, nachdem der Assay-Mischung, mechanische Störungen der Aktin-Netze polymerisiert begrenzen gereinigten Rhodamin-Aktin hinzugefügt durchgeführt werden auf Endosomen (siehe Schritt 5.2.3 und Abbildung 2). In diesem Fall ist es am besten, um den Extrakt um 26,5 % (0,85 M) Saccharose (refractive Index von 1,375), begrenzende Diffusion anpassen und Brownsche-wie Bewegung (Schritt 5.2.3), und entfernen möglich Aggregate von Rhodamin-Aktin durch Ultrazentrifugation vor Gebrauch gereinigt. Unsere Beobachtungen, dass die Moesin steuert die Bildung von F-Aktin-Netzwerken auf Endosomen waren voll rekapitulierte diese alternative Version von unserem Assay4,14verwenden.
Beide Versionen unserer Protokoll, im Reagenzglas oder in der bildgebenden Kammer ist optimal für eine Gesamtanalyse der F-Aktin Nukleation und Polymerisation auf Endosomen. Es ist jedoch nicht leicht zu folgen der Aktin-Polymerisation durch die Zeit mit diesem Ansatz, teilweise weil Endosomen nicht unbeweglich sind. Infolgedessen ist es nicht leicht zu überwachen, das Wachstum der Einzelfilamente und damit die Geschichte des Aktin-Netzwerks zu bestimmen. Zum Beispiel ist es schwierig, F-Aktin Verzweigung von Vernetzung zu unterscheiden kann. Wir sind jedoch zuversichtlich, dass Bedingungen, F-Aktin-Polymerisation in Echtzeit zu überwachen in der bildgebenden Kammer verbessert werden können, durch die Optimierung der Bedingungen, Endosomen zu immobilisieren. Ebenso ist es interessant, F-Aktin-Polymerisation von künstlichen Membranen mit gereinigten Komponenten überwachen wird. In der Tat haben wir zuvor gezeigt, dass F-Aktin Nukleation und Polymerisation auf Liposomen nach verbindlichen t auftreten könnenHe Keimbildung Faktor annexin A2 auf der Liposomen Bilayer11. Diese Strategie wird weiter die Rolle von bestimmten Lipiden und Proteinen im F-Aktin Nukleation und Polymerisation zu sezieren und zu charakterisieren die minimalen Komponenten notwendig, ein F-Aktin-Netzwerk auf Endosomal Membranen bilden nützlich. Schließlich glauben wir, dass diese Strategie sehr nützlich, um andere F-Aktin-abhängigen Prozesse zu studieren, die auf Endosom Membranen, insbesondere die Rekrutierung und Mobilisierung von Retromer/Waschen Maschinen auftreten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Von der Swiss National Science Foundation unterstützt wurde; Das Schweizer Sinergia-Programm; die polnisch-schweizerischen Forschungsprogramm (PSPB-094/2010); die NFS in der chemischen Biologie; und LipidX von der Schweizer SystemsX.ch Initiative, durch den Schweizerischen Nationalfonds (, J. G.) ausgewertet. O. M. wurde durch eine EMBO langfristige Fellowship (ALTF-516-2012) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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