Summary
פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.
Abstract
פונקציות רבות אנדוזום מוקדם, במיוחד מטען החלבון ומיון ממברנה דפורמציה, תלויים כתמים של חוטים F-אקטין קצרים nucleated על גבי קרום endosomal. הקמנו מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה גנטי וביוכימי מניפולציות. שברים Endosomal מוכנות על ידי ציפה במעברי צבע סוכרוז מתאי לבטא את החלבון endosomal מוקדם GFP-RAB5. שברים cytosolic מוכנות של קבוצות נפרדות של תאים. הן endosomal והן cytosolic שברים ניתן לאחסן קפוא חנקן נוזלי, במידת הצורך. ב וזמינותו, endosomal ואת cytosolic שברים מעורבים, התערובת מודגרת ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים המתאימים (למשל, יונית כוח, להפחית את הסביבה). בזמן הנסיעה, תערובת התגובה הוא קבוע, F-אקטין מתגלה עם phalloidin. התגרענות אקטין, הפילמור מכן נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. כאן, אנחנו מדווחים כי assay זה יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של הגורמים המעורבים או אקטין התגרענות על הקרום, או התארכות עוקבות, מ., או crosslinking של F-אקטין חוטים.
Introduction
התאים האיקריוטים גבוה יותר, חלבונים ושומנים הם הפנימו לתוך מוקדם endosomes איפה המיון מתבצע. כמה חלבונים ושומנים, שנועד להיות reutilized, שולבו צינורי מחוזות endosomes מוקדמת, ואז מועברים קרום פלזמה או טרנס-גולג'י רשת (TGN)1,2. לעומת זאת, חלבונים ושומנים אחרים ארוזים באופן סלקטיבי לתוך מחוזות endosomes מוקדמת כי התערוכה מראה multivesicular. אזורים אלה הרחב, על ניתוק ממברנות endosomal מוקדם, בסופו של דבר בוגרת לתוך שלפוחית המוביל endosomal חינם או גופים multivesicular (ECV/MVBs), אשר אחראים על תובלת המטענים לעבר המנוח endosomes1, 2.
אקטין ממלא תפקיד מכריע בתהליך שיפוץ ממברנה המשויכים להן אנדוזום והיכולת מיון endosomal. חלבון מיון לאורך המסלולים מיחזור קרום פלזמה או את TGN תלוי את retromer קומפלקס החלבונים הקשורים. מכונות מיון זה נראה להיות מצמידים את היווצרות של מיחזור בקוריאנית באמצעות האינטראקציות של retromer מתחם עם צרעה והצלקת homologue (שטיפה) מורכב, מסועף אקטין3,4,5 . לעומת זאת, מולקולות המיועדים השפלה, במיוחד הפעלת קולטנים איתות, מסודרים לתוך שלפוחית intraluminal (ILVs) על ידי endosomal מיון מתחמי הדרושים עבור תחבורה (ESCRT)2,6, 7. בעוד תפקיד אפשרי של אקטין בתהליך מיון תלוי-ESCRT אינו ידוע, F-אקטין ממלא תפקיד חשוב להן של ECV/MVBs, תחבורה מעבר endosomes המוקדמות. בפרט, מצאנו כי annexin A2 נקשר מועשרת כולסטרול אזורים של אנדוזום מוקדם, ויחד עם spire1, nucleates פלמור אקטין-F. היווצרות של הרשת אקטין מסועף מובחנים endosomes דורשת את הפעילות הסתעפות של החלבון אקטין הקשורות (ARP) 2/3 מורכבים, כמו גם את moesin חלבון ERM ו-8,9cortactin חלבון מחייב אקטין.
כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות. Assay הזה שימש בעבר כדי לחקור את התפקיד של annexin A2 ב- F-אקטין התגרענות ואת moesin ואת cortactin על היווצרות endosomal אקטין רשתות8,9. עם זה פרוטוקול במבחנה , הסדרה מורכבת של התגובות המתרחשות על endosomes במהלך פלמור אקטין הופכים לבצע ניתוח הביוכימי והמולקולרי של השלבים רציפים של התהליך, לרבות התגרענות אקטין, ליניארי פלמור, מסעף ו crosslinking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-פתרונות, ההכנות
הערה: כל מאגרי ופתרונות צריכה להיות מוכנה מזוקק פעמיים (dd) H 2 O. מכיוון המדינה הידרציה של סוכרוז משתנה, הריכוז הסופי של כל הפתרונות סוכרוז להיקבע באמצעות משאבות-מעבדות של.
- הכן באגירה פוספט תמיסת מלח ללא קטיונים דו ערכיים (נולד ב- PBS): 137 מ מ נז'י, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 1.5 מ מ ח' 2 PO 4 ו- 6.5 מ מ נה 2 HPO 4. להתאים את ה-pH ל 7.4. לחטא מאת autoclaving (1 מחזור ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות) ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- להכין פתרון מניות של 300 מ"מ imidazole: 0.204 גר' imidazole ב- 10 מ"ל של ddH 2 O.Adjust ה-pH ל 7.4 ב 4 ° C באמצעות שימוש של μm 0.22 לחטא HCl. מסנן מסנן גודל הנקבוביות ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס מאגר
- הכן המגון (HB; להכין כ 100 מ ל): 250 מ מ סוכרוז ב- 3 מ מ imidazole. להתאים את ה-pH ל 7.4 ב 4 ° C באמצעות מד pH. מסנן-לעקר באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22 μm ולאחסן ב-4 ° ג המשלים HB לפני השימוש עם קוקטייל של מעכבי פרוטאז בריכוזים הסופית המתאימה 10 מ מ leupeptin, A pepstatin 1 מ"מ ו- 10 ננוגרם למ"ל aprotinin.
- למעברי ציפה שלב ', להכין את 62%, 39% ו- 35% סוכרוז פתרונות ב- 3 מ מ imidazole, pH 7.4, כמתואר להלן. לקבוע במדויק את הריכוז הסופי של כל הפתרונות סוכרוז באמצעות משאבות-מעבדות של.
- להכין 100 מ של 62% סוכרוז פתרון 3 מ מ imidazole, pH 7.4. להמיס על ידי ערבוב 80.4 גרם סוכרוז ddH 2 O מראש חימם עד 35 ° C. להוסיף 1 מ"ל של 300 מ"מ imidazole פתרון מלאי ומילוי 100 מ ב- ddH 2 O. התאם את ה-pH ל 7.4 ב-4 ° C. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות μm 0.22 חנות ב 4 º C
- להכין 100 מ של 35% סוכרוז פתרון 3 מ מ imidazole, pH 7.4. לפזר על ידי ערבוב 40.6 גר' סוכרוז ב- ddH 2 O. להוסיף 1 מ"ל של 300 מ"מ imidazole מניות פתרון ולמלא עד 100 מ"ל עם ddH 2 O. התאם את ה-pH ל 7.4-4 ° C. מסנן לחטא בעזרת μm 0.22 הנקבוביות גודל מסנן ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
- להכין 50 מ של 39% סוכרוז ב- 3 מ מ imidazole, pH 7.4. לדלל את הפתרון סוכרוז 62% עם הפתרון 35% סוכרוז. חנות ב 4 º C
- לפזר דור 3 של paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב ב- 100 מ של PBS-טרום-warmed עד 60 ° צלזיוס תוך הוספת 1 M NaOH dropwise; להתאים את רמת ה-pH הסופי כדי 7.4 באמצעות NaOH. מסנן-לעקר באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-μm ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס
התראה: 3% כדורגלן הוא ריאגנט רעיל. - פתרון מניות להכין 1 מ' אשלגן כלורי. להמיס 3.73 g של אשלגן כלורי על ידי ערבוב ב 50 מ של ddH 2 באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-μm לחטא או מסנן ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- פתרון מניות הכן 50 X מרוכז המכיל 0.625 Hepes M ב- pH 7.0 ו- 75 מ מ MgOAc 2 ב- ddH 2 O. Aliquot וחנות ב-20 מעלות צלזיוס
- הכן הרכבה בינונית. מערבבים על ידי ערבוב 2.4 g של poly(vinyl alcohol) M w ~ 31,000 (PVA) עם 6 גרם של גליצרול. להוסיף 6 מ של ddH 2 O והשאר כבר לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר. להוסיף 12 מ של 0.2 מ' טריס-קלרנית (pH 8.5) ומחממים עד כ 53 ° C עם תוך ערבוב מדי פעם עד PVA יש התפרקה.
- להבהיר את הפתרון על ידי צנטריפוגה ב x 5,000 g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את תגובת שיקוע והוסף 2.5% (w/v) 1, 4 - diazabicyclo-[2.2.2] אוקטן (DABCO) כדי למנוע photobleaching במהלך זיהוי קרינה פלואורסצנטית. מערבולת כ 30 s להתמוסס. Aliquot לתוך צינורות פלסטיק 1.5-mL, חנות ב-20 מעלות צלזיוס
2. תרבית תאים
- תרבות הלה בתאים Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני עם סרום עגל עוברית 10%, 10% שאינם חיוניים חומצות אמינו, 10%-גלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. לשמור אותם ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה 2 5% CO.
- Transfect התאים 24 שעות לפני הניסוי עם GFP-RAB5 10, שימוש מסחרי תרביות תאים מגיב לדברי היצרן ' הוראות s.
- בעת הצורך, להכין endosomal שברים ומספרים ציטוזול מתאי מדולדל של חלבון של הריבית (כלומר, שימוש RNAi או CRISPR/Cas9) ו/או overexpressing טופס wildtype או מוטציה של החלבון עניין.
3. הכנה שבר Endosomal
הערה: פרוטוקול זה מתאר ההכנה פשוטה של שברים subcellular המכיל endosomes וממברנות אור אחרים. אם יש צורך, שברים אנדוזום מטוהרים ניתן גם בשימוש 11. להכין 2 צלחות פטרי (הקוטר החיצוני ס מ-10; 57 ס מ 2) של תאים confluent לבטא GFP-RAB5 כמתחילה חומר. המספר הכולל של הלה confluent, בתאים 2 צלחות פטרי מקביל בערך 2.5 x 10 7 תאים. בעת הצורך, endosomes וניתן גם להכין מתאי מדולדל של חלבון של הריבית (כלומר, שימוש RNAi או CRISPR/Cas9) ו/או overexpressing טופס wildtype או מוטציה של החלבון עניין, תמיד ביטוי GFP-RAB5.
שים לב: כל השלבים של פרוטוקול fractionation צריכה להתבצע על קרח
- למקם את צלחות פטרי על צלחת מתכת רטובה בתוך דלי קרח שטוחים, מיד לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של PBS קר כקרח-.
- PBS כל - להסיר בכביסה האחרונה ולהוסיף 3 מ"ל של PBS קר כקרח-לכל תבשיל. תאים לא צריך לייבש במהלך הטיפול: אם יש צורך, במקום דלי קרח על פלטפורמה נדנדה לכסות שלמאחה תאים עם נוזל.
- להסיר באופן מכני התאים ב- PBS צלחות פטרי באמצעות שוטר גומי גמיש (קרי, המגרד תא תוצרת בית). לגרד את התאים את הכלים קודם בתנועה מהירה, מעגלית סביב החלק החיצוני של המנה, ולאחריו תנועה כלפי מטה באמצע המנה. מגרדים בעדינות כדי לקבל " גליונות " של תאים המצורפת. להעביר בעדינות את התאים באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק עם פתח רחב כדי צינור חרוטי 15-mL פוליפרופילן על קרח
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 175 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- בעדינות להסיר את תגובת שיקוע (SN) ולהוסיף 1-3 מ"ל של HB בגדר. באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק עם פתח רחב, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי resuspend את התאים.
- צנטריפוגה למשך 7-10 דקות ב 1,355 x g ו- 4 ° C. בעדינות הסרה SN.
- לבצע המגון תא.
הערה: תנאים צריך להיות עדין כך פלזמה הממברנות של התאים שבורות אבל endosomes נשארים בעינם.- הוסף נפח ידוע של HB עם מעכבי פרוטאז על גבי כל גלולה תא (כ-100 μL לכל תא גלולה). שימוש של micropipette 1,000-µL, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה עד התאים הם resuspended. אל להציג את בועות האוויר.
- להכין מזרק טוברקולין 1-mL עם מחט 22 גרם שטופים מראש עם HB, ללא אוויר או בועות.
- למלא את המזרק עם התליה תא יחסית לאט (כדי למנוע יצירת בועות אוויר), המקום משופע קצה המחט הקיר של הצינור, לגרש את המתלים תא במהירות כדי להטות את הממברנות פלזמה של התאים המצורפת.
- Aliquot קטן של homogenate (כ 3 µL) ואין למהול אותו לתוך µL 50 של HB על משטח זכוכית. לערבב, לכסות עם coverslip זכוכית. בדוק את homogenate במיקרוסקופ ניגוד שלב מצויד 20 X או המטרה X 40.
הערה: בתנאים אופטימליים, רוב התאים שבור, אבל גרעינים, אשר מופיעים אפור כהה סביב מבנים, אינם ( איור 1). - שלב חוזר 3.7.3 3.7.4 עד רוב התאים שבורות; בדרך כלל, 3-6 קווים שיהיה דרך המחט נחוצים. שמור של aliquot קטנים (10-30 µL) של homogenate לקביעת חלבון.
- Homogenate צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 1,355 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
הערה: לאחר צנטריפוגה, בגדר (כהגדרתו בגדר גרעינית; NP) מכיל הגרעינים, את תגובת שיקוע (כהגדרתו של תגובת שיקוע postnuclear; מערכת העצבים ההיקפית) מכיל את ציטוזול והן את organelles שוחרר על המגון, ההשעיה חינם. - בזהירות לאסוף את מערכת העצבים ההיקפית. לשמור aliquots קטנים (10-30 µL) של מערכת העצבים ההיקפית, NP לקביעת חלבון ולמחוק את NP.
- להתאים את מערכת העצבים ההיקפית כדי 40.6% סוכרוז באמצעות דילול הפתרון סוכרוז 62% עם מערכת העצבים ההיקפית באמצעות יחס 1:1.1 של PNS:62% סוכרוז. מערבבים בעדינות אך ביסודיות, ללא יצירת בועות אוויר. בדוק את הריכוז סוכרוז באמצעות משאבות-מעבדות את.
- למקם את מערכת העצבים ההיקפית 40.6% סוכרוז בתחתית התחתית ultracentrifugation. כיסוי בזהירות עם 2.5 מ של הפתרון 35% סוכרוז ולמלא את הצינור צנטריפוגה HB.
הערה: הפתרונות סוכרוז צריך להיות שכבות כך ממשקים הם נראים בבירור. - Ultracentrifuge מעברי הצבע עבור h 1 ̴165, 000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
- הסר בזהירות את השכבה הלבנה של שומנים על גבי המילוי ההדרגתי. בשלב הבא, לאסוף את הממשק המכיל endosomes, בין HB 35% סוכרוז, באמצעות micropipette 200-μL עם טיפ לחתוך.
הערה: שברים endosomal יכול לשמש ישירות בבמבחנה אקטין הפילמור וזמינותו או יכול להיות aliquoted בקרח, קפואה של חנקן נוזלי, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס - לקבוע ריכוז חלבון של שברים מערכת העצבים ההיקפית, endosomal.
הערה: במכלול זה צריך להיות לפחות 100 µg/mL. כ 2.5 x 10 7 תאים גדלו ב 2 צלחות פטרי נדרשים להשיג את מערכת העצבים ההיקפית לפחות 100 µg/mL (ראה לעיל בהערה).
4. ציטוזול הכנה
הערה: להכין 2 פטרי (בקוטר 10 ס מ; 57 ס מ 2) של תאים confluent הלה כמתחילה חומר. בעת הצורך, ניתן ציטוזול גם להכין מתאי מדולדל של חלבון של הריבית (כלומר, שימוש RNAi או CRISPR/Cas9) ו/או overexpressing של wildtype או הטופס mutant של החלבון עניין. לגבי פרוטוקול fractionation אנדוזום, כל הצעדים צריכה להתבצע על קרח
- חזור על השלבים 3.1-3.8.
- למקם את מערכת העצבים ההיקפית צנטריפוגה שפופרת ultracentrifuge למשך 45 דקות ב̴250, 000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
- בזהירות להסיר את שכבת לבן על גבי ולאסוף את SN (ציטוזול שבר) מבלי להפריע בגדר microsome. לשמור על aliquot של השבר ציטוזול לקביעת חלבון.
הערה: ציטוזול יכול לשמש ישירות בבמבחנה אקטין הפילמור וזמינותו או יכול להיות aliquoted בקרח, קפואה של חנקן נוזלי, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס - לקבוע ריכוז חלבון ציטוזול.
הערה: זה צריך להיות לפחות 3 מ"ג/מ"ל.
5. שיטת מדידה אנדוזום תלוית פלמור אקטין ב חוץ גופית
הערה: פלמור אקטין אנדוזום תלוית יכול להתבצע באמצעות שתי גישות אלטרנטיביות. בגישה הראשונה, החומרים הם מעורבים במבחנה, קבוע, הועבר coverslip, ניתח. בגישה השנייה, המתוארים כאן, וזמינותו יכולה להתבצע ישירות בבית הבליעה הדמיה, יכול להיות קבוע וניתח ללא ההפרעות מכני ( איור 2C). בגישה זו השנייה, התערובת assay לא מועבר ממבחנות coverslip, וכך נשאר בשלוות נפש, הפחתת הסכנה של רשתות F-אקטין להיות מוטרד פיזית במהלך ההעברה. בנוסף, גישה זו השנייה היא תואמת לניתוח בצילום מואץ של F-אקטין הפילמור. יצוין כי אין הבדל בניתוח פלמור אקטין-F נצפתה גם גישה.
הערה: השתמש לחתוך טיפים לאורך כל הפרוטוקול.
- במבחנה
- בעדינות לערבב כקרח מטוהרים GFP-RAB5 endosomes (שלב 3) עם ציטוזול (שלב 4) ביחס של 1:10 (ריכוז חלבון) הקר 1.5-mL חרוט מבחן צינור.
הערה: ניסוי טיפוסי מתבצע עם 40-50 µL. - להתאים את תערובת התגובה כקרח ריכוזי הסופי של 125 מ מ אשלגן כלורי (באמצעות הפתרון מניות של אשלגן כלורי 1 מ'), 12.5 מ מ Hepes ו- 1.5 מ מ MgOAc 2 (באמצעות 50 x פתרון מניות). לאחר מכן, התאם את התערובת עם מעכבי פרוטאז ריכוזי הסופי של 10 מ מ leupeptin, pepstatin 1 מ א 10 ננוגרם למ"ל aprotinin. מערבבים בעדינות את כל הרכיבים.
- המקום בו מום המכיל תערובת התגובה ב 37 ° C, ללא רועד, ואת תקופת דגירה של הזמן המבוקש.
הערה: בדרך כלל, זה ייקח בערך 3 דקות כדי לזהות פלמור אקטין endosomes ו 30 דקות של הקמת רשת נרחבת. - הזמן הרצוי (קרי, 3 דקות או 30 דקות), לעצור את התגובה על ידי הצבת את מבחנה על קרח ולהוסיף 1/10 (vol:vol) של הפתרון מחברים 3% precooled.
- להוסיף 0.3:10 (vol:vol) של 200 יחידות/mL (~6.6 μM) phalloidin מצומדת כדי צבען אדום כתום כתם של אקטין polymerized. ΜL
- μL מקום 12 של התערובת על 12 PVA בינוני גובר על משטח זכוכית מיקרו. לשים על 18 פרק 18 מ מ 2 זכוכית למעלה coverslipon.
- לנתח את הדגימה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית-
- בעדינות לערבב כקרח מטוהרים GFP-RAB5 endosomes (שלב 3) עם ציטוזול (שלב 4) ביחס של 1:10 (ריכוז חלבון) הקר 1.5-mL חרוט מבחן צינור.
- בבית הבליעה הדמיה
- כדי להפוך צ'יימברס הדמיה מיקרוסקופיים, השתמש פלזמה מנקה עבור 1 דקות כדי לנקות coverslip עגול קוטר 18 מ מ, קוטר 35 מ מ עגול פטרי מצויד עם חלק תחתון זכוכית 20 מ מ (0.16-0.19 מ מ)-
- תדגור על משטחים נקי עם 1% β-קזאין במשך 20 דקות למזער את חלבון מחייב אל הזכוכית תשטוף פעמיים עם 3 מ מ imidazole.
- הוסף אנדוזום, ציטוזול, באותו assay תערובת כמו שלבים 5.1.1 ו- 5.1.2, כדי precooled 1.5 mL מבחנה, משלימים את התערובת assay עם 0.1 μg/μL rhodamine-אקטין.
- להתאים את הסופי מקדם שבירה של התערובת כדי 1.375 (26.5% סוכרוז) באמצעות 39% סוכרוז פתרון.
הערה: בדרך כלל, באותו אמצעי אחסון נוסף; עם זאת, זה חייב להיות מדעית מחדש שהותאם בהתאם ריכוז סוכרוז של השבר שנאספו, נקבע באמצעות של refractomer, שכן ריכוז סוכרוז עשוי להשתנות מעט ניסוי כדי ניסוי. - מניחים את התערובת על המנה pretreated 35 מ מ (שלב 5.2.1) ומכסים אותו עם coverslip 18 מ מ pretreated (שלב 5.2.1).
- במקום התא בגיל 37 ° C, מבלי לרעוד.
- לנתח את הדגימה באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית-
6. התמונה Acquisition, ניתוח של אקטין ברשת
- ייבוא תמונות
- לרכוש את התמונות במיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוך.
הערה: הגדרות רכישת תמונה אופטימציה להצגה מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוך עם יעד שמן נה 63 X 1.25. התאם את עוצמת הלייזר (בדרך כלל סביב 50%) כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.
- לרכוש את התמונות במיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוך.
- כימות של הרשת אקטין
- לנתח את micrographs פלורסנט. להשתמש בתוכנה בקוד פתוח CellProfiler (v2.1.1) 12 כדי למדוד את כמות אקטין לכל אנדוזום (תוכנה חלופית יכולה לשמש).
- ראשית, עליך לזהות endosomes כמו של האובייקט העיקרי באמצעות האות ה-GFP-RAB5. לאחר מכן, לכמת את F-אקטין המשויך endosomes בודדים באמצעות התפשטות של האות אקטין (צבען אדום כתום מצומדת Phalloidin) כאובייקט משני.
- הממוצע, לנרמל את המספר של חומר המשויך עבור כל אובייקט למצב שליטה.
- לנתח את micrographs פלורסנט. להשתמש בתוכנה בקוד פתוח CellProfiler (v2.1.1) 12 כדי למדוד את כמות אקטין לכל אנדוזום (תוכנה חלופית יכולה לשמש).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבל תובנות לגבי היווצרות של F-אקטין תיקונים הקרומים אנדוזום מוקדם, עקבנו פרוטוקול המתוארים באיור2. בקצרה, התאים היו transfected עם GFP-RAB5, ואז endosomes מוקדם הוכנו על ידי subcellular fractionation. אלה endosomes מוקדם מטוהרים היו מודגרות עם ציטוזול על מנת לספק אקטין עצמה, כמו גם גורמים אחרים שייתכן ומעורבים התגובה. בסוף תקופת הדגירה, התגובה נעצר על ידי קיבוע של התערובת. לאחר מכן, מדגם היה אסף, שהופקדו על שקופית מיקרוסקופיים. לבסוף, F-אקטין נחשף עם phalloidin (איור 3 א). התגרענות של F-אקטין על גבי ממברנות endosomal מוקדם, כמו גם את תהליך הפילמור הבאים התרחש במהירות. אכן, F-אקטין יכולים כבר ניתן לאבחן על endosomes בתוך 1 דקות לאחר תחילת התגובה (איור 3 א). מבנים אלה אקטין, שהיו בתחילה קצר, הפך במהירות יותר, מסועף, מקושרים אחד לשני שמוביל להיווצרות רשת שזור של אקטין חוטים (איור 3 א), ככל הנראה משקף דינמיקה אקטין לא מאוזן במבחנה. התגרענות דומה וקצבי הפילמור נצפו כאשר וזמינותו בוצע עם מטוהרים אקטין התווית על-ידי rhodamine בנוסף ציטוזול תא. זה נעשה במנות תת כך מבנים יכול לדימות ישירות, בהעדר כל ההפרעות (איור 3B). ב וזמינותו המתוארים כאן, endosomes מוקדמת nucleate de novo פלמור אקטין באופן סלקטיבי. אכן, פלמור אקטין לא התרחשה כאשר התגובה במבחנה בוצע בהיעדרו של endosomes או ציטוזול. ניתן לפיכך להסיק שמקדם כי מוקדם endosomes להחזיק את היכולת הבסיסית תומכת התגרענות עוקבות פלמור אקטין-חוטים-9,-11.
כדי לנתח את הכמות של אקטין polymerized מן endosomes, תמונות רכשה במועדים שונים נותחו באמצעות CellProfiler (איור 4A). הכמות של אקטין polymerized לכל אנדוזום נמדדה כאזור של אקטין המקיפים של אנדוזום מוקדם יחיד. הקצב פלמור אקטין היה גבוה יותר בתחילת התהליך, פחתה עם הזמן (איור 4B). הרשת אקטין ניתן לנתח בפירוט רב יותר בנקודות זמן מוקדם לאחר תחילת התגובה. בנקודות אלו בתחילת הזמן-, מבנים המכילים אקטין בודדים יכול להיות עדיין ניתן להבחין אחד מהשני. על מנת להעריך מורכבות הארגון של רשתות אקטין, נספר מספר חוטים אקטין שמקורם כל אנדוזום (קרי, ראשי חוטים). באופן דומה, נמנו מספר חוטים אקטין שמקורם העיקרי חוטים (קרי, חוטים משני), כמו גם המספר של כל חוטים אחרים של אקטין זה יכול להיות מזוהה בהרשתות, אשר מקורן אינו endosomes ( כלומר, חוטים אחרים) (איור 4C-E. ברגע חוטים אקטין שנקשרו, פרמטרים אחרים, כגון אורך חוטים אקטין בודדים ומספר endosomes מחובר על חוטים אקטין אותו, יכול להיות בקלות לחשב (איור 4F).
איור 1: שלב החדות Micrograph של Homogenate הלה תא. לאחר המגון, התמצית היה רכוב בין שקופית מיקרוסקופיים של coverslip. לפרסום, נלכדו micrographs עם יעד X 100 לאחר טבילה שמן. לבדיקה שגרתית, עם זאת, תמצית תא היה מדמיין תחת 20 X או מטרה X 40 ללא שמן טבילה. שתי דוגמאות ההגדלה גבוהה נוף של homogenate מוצגים (A-B). גרעינים (סטאר) מופיעים מבנים עגולים בצבע אפור כהה בצבע, ללא שאריות תא המצורפת. חצים הצבע גרגרי האופיינית של בגדלים, צורה, טבלתי, אשר משתחררים על התא המגון ומתייחסים אליהם חומרים תאיים (קרי: organelles). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. תיאור סכמטי של הפרוטוקולים הנמצאים בשימוש כדי להכין תמציות endosomal (א) ואת ציטוזול תמציות (B) וכדי לפקח פלמור אקטין endosomes במבחנה (C). תגובת שיקוע (SN), מאגר המגון (HB), תגובת שיקוע postnuclear (מערכת העצבים ההיקפית), הגרעין גלולה (NP) ו paraformaldehyde (PFA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: התגרענות, פלמור של F-אקטין ב מוקדם Endosomes במבחנה. Endosomes (א) מכל הלה תאים לביטוי GFP-Rab5 (ירוק), הלה ציטוזול הוכנו בנפרד. ב וזמינותו, endosomes מוקדמת (אייתה) היו מעורבבים עם ציטוזול ולאחר התערובת, נדגרה על הצביעו פעמים. התערובת היה קבוע, המסומנת phalloidin (אדום) לתווית F-אקטין, ואז נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית. ברים: 10 מיקרומטר (החלונית העליונה), 5 מיקרומטר (פאנל התחתונה). (B) אייתה מכל הלה תאים המבטאים GFP-Rab5 (ירוק), הלה ציטוזול הוכנו בנפרד. תמציות תא אלו היו מודגרות עם מטוהרים rhodamine-אקטין (אדום) עבור הצביעו פעמים בתאי מיקרוסקופ, נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) הניסוי בוצע כמו A. ציטוזול הלה (ללא אייתה), הלה endosomes (ירוק) המסומנת GFP-Rab5 (ללא ציטוזול) היו מודגרות בנפרד (לוחות הימנית והאמצעית) או ביחד (לוח נכון) במשך 30 דקות, קבוע, המסומנת phalloidin (אדום) לתווית F-אקטין, נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוח של הרשת אקטין. זרימת עבודה של ניתוח CellProfiler (א). (B) מספר אקטין polymerized היו לכמת באופן יחסי מספר endosomes באמצעות התוכנה CellProfiler. הנתונים הם s.e.m. ± החציוני (n = 3). הנתונים הם אמצעי ± ש (n = 3). 5 דקות לעומת 15 דקות (ns P= 0.0736), 5 דקות לעומת 30 דקות (* P = 0.0195), ו- 15 דקות לעומת 30 דקות (ns P = 0.3129). (ג)Endosomes מוקדם (אייתה) מטוהרים מתאי הלה לבטא ציטוזול GFP-Rab5 והלה הוכנו בנפרד, וזמינותו התבצע כמו דמות 2A. דוגמאות תוקנו לאחר 7 דקות. הלוח האמצעי מציג את micrograph אותו, עם החפיפה של שרידי מבנים F-אקטין שצויר באמצעות תוסף NeuronJ13 של התוכנה ImageJ. בחלונית ' נכון ' מציג רק את העקבות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. ייצוג (D) F-אקטין מבנה רצף המספור בשימוש כימות עם תוכנת ImageJ. כימות (E) של המספר של אקטין חוטים, כפי שמוגדר ב- C-D. הנתונים הם אמצעי ± ש (n = 3). ראשי סניפים לעומת ענפים משניים (ns P = 0.5262), ענפים משניים לעומת ענפים אחרים (ns P = 0.6815), ראשי סניפים לעומת ענפים אחרים (ns P = 0.2254). (F) האורך של F-אקטין מבנים ואת המספר של EEs לכל מבנה אקטין מוצגות דוגמאות של פרמטרים אחרים מאשר ניתן לנתח עם כימות המוגדרים ב- C-D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אקטין ממלא תפקיד מכריע אנדוזום ממברנה dynamics4,14. בעבר דיווחנו כי אקטין התגרענות הפילמור מתרחשים על endosomes מוקדם, ויוצרים F-אקטין תיקונים קטנים או רשתות. רשתות אלה F-אקטין נדרשים לחלוטין להעברה ממברנה מעבר endosomes מוקדמת לאורך השביל השפלה. הפרעה בשלב כלשהו של תהליך הפילמור התגרענות הזה מונע אנדוזום ההבשלה ובכך תחבורה במורד לעבר המנוח endosomes andlysosomes9,11,15. בפרט, השתמשנו וזמינותו שתוארו לעיל כדי לנתח את השלבים רציפים של פלמור אקטין-F על endosomes מוקדם, כדי לאפיין את התהליך ברמה המולקולרית.
בניסויים אלה, endosomes מוקדמת עם GFP-RAB5 ויוותוויות, מטוהרת על-ידי subcellular fractionation, מודגרות במבחנה בנוכחות ציטוזול כדי לאפשר F-אקטין פלמור במבחנה. בזמן הנסיעה, תגובת הופסקה, תערובת התגובה מועברים לשקופית מיקרוסקופית לצורך ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, שימוש phalloidin כדי לתייג את F-אקטין. באמצעות אסטרטגיה זו ניסיוני, הראינו כי annexin A2 הוא צורך התגרענות של F-אקטין-endosomes מוקדם, יחד עם SPIRE1, בעוד ARP2/3 שמתווכת F-אקטין הסתעפות, כצפוי. גם הראנו כי moesin ו- cortactin נדרשים להיווצרות הרשתות F-אקטין המתווכות ECV/MVB להן ועם בגרות לאורך השביל השפלה של תאים בתרבית של9,11.
חשוב לזכור כי, למרות רמות נמוכות של RAB5 ectopically ביטוי לא תשנה את endosomes בכל מידה משמעותי10, GTPase קטן זה הוא מווסת מפתח בתחילת אנדוזום ממברנה dynamics16,17 . בניסויים מסוימים, לכן ייתכן המתאים תווית endosomes ב וזמינותו באמצעות פרוטוקולי חלופי. לדוגמה, endosomes מוקדמת ניתן בנוחות שכותרתו באמצעות המשדרים פלורסנט endocytosed, כגון עוריות פקטורי גדילה או transferrin4,14.
יש גם לציין כי קשה מבחינה טכנית כדי התמונה חוטים אקטין בודדים עם קונפוקלית קונבנציונלי. לכן, אנו להפנות למבנים F-אקטין לאורך כל הטקסט לתיאור אקטין רשתות על endosomes. כתוצאה מכך, אנו חשים כי היווצרות של רשת F-אקטין ניתן לכמת באופן מדויק יותר על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית שטח הפנים של הרשתות ולא עצמתם.
לא קל לשלול לחלוטין את האפשרות כי הפעילות התגרענות אקטין נצפתה במבחנה מתווך על ידי מבנה או אברון זה כבולים כדי RAB5 endosomes במהלך טיהור מסוימים אחרים. עם זאת, זיהום כזה מאוד לא סביר. בעוד כמה organelles לטהר במשותף על מעברי צבע בגלל מאפיינים פיזיים דומים, הם אינם נוטים להישאר מאוגדים באופן כמותי אחד לשני לאחר טיהור. יתר על כן, הפעילות התגרענות אקטין תלויה אך ורק annexin A24,14, אשר קיים, endosomes מוקדמת המכילה RAB514. בסופו של דבר, אנו מוצאים כי F-אקטין מבנים הקשורים באופן סלקטיבי RAB5 endosomes ויוו , לא יימצאו על אחרים endosomes או על אחרים ממברנות הסלולר4,14. לסיכום, פעילות התגרענות אקטין היא ככל הנראה המשויך RAB5 endosomes, שכן פעילות זו משותפת מטהרת במשותף. רגישה עם RAB5 endosomes.
ב הזה assay, הרבה כמו שאר מבחני זה לשקם תגובות ביוכימיות מורכבים אותו פקד שהדינמיקה של endosomes16 או אחרים ממברנות18 וכי מבוצעות במבחנה, חשוב להבטיח כי ההכנה של תמציות הסלולר הוא אופטימלי. צריך להיות הומוגני תאים בתנאים עדין כדי להגביל את הנזק endosomes organelles אחרים, בעיקר גרעינים ו lysosomes. בנוסף, יש לשמור אנדוזום שברים בקרח בתנאים למזער מתח osmotic, יוניים, וכן פלמור אקטין ספונטנית. ריכוזים נוספים, גבוהה יחסית של שבר אנדוזום (≥0.1 mg/mL) ו ציטוזול (≥ 3 מ"ג/מ"ל) נדרשים עבור פלמור אקטין-F נאותה על endosomes ועל זיהוי, כפי שמצוין שלבים 3.13 ו- 4.4, בהתאמה. בדומה לכך, חשוב לבצע את הבדיקה עם 1:10 יחס של אנדוזום כדי ציטוזול (חלבון: חלבון), כפי שמצוין בשלב 5.1.1. לבסוף, pipetting לאחר פלמור אקטין (קרי, כדי להוסיף כדורגלן ו phalloidin) צריך להיעשות בעדינות כדי למנוע קריסתו או שבירת הרשת אקטין.
במידת הצורך, במבחנה אקטין הפילמור וזמינותו יכול גם להתבצע ישירות במיקרוסקופ הדמיה קאמרית, לאחר הוספת rhodamine מטוהרים-אקטין לתערובת assay, להגבלת לפליטת מכני של הרשתות אקטין polymerized אל endosomes (ראה צעד 5.2.3 ו איור 2). במקרה זה, הוא הטוב ביותר להתאים את התמצית ל 26.5% (0.85 M) סוכרוז (אינדקס השבירה של 1.375), הגבלת דיפוזיה בראונית דמוי תנועה (שלב 5.2.3) וטיהרו להוציא אגרגטים אפשרי של אקטין rhodamine על ידי ultracentrifugation לפני השימוש. התצפיות ש-moesin הזה שולט היווצרות של F-אקטין רשתות על endosomes היו recapitulated באופן מלא באמצעות גירסה חלופית זו שלנו4,assay14.
גם גירסת פרוטוקול שלנו, בו מום או בבית הבליעה הדמיה, הוא אופטימלי עבור ניתוח גלובלית של F-אקטין התגרענות ו פלמור ב- endosomes. עם זאת, לא קל לעקוב אחר תהליך פלמור אקטין בזמן שימוש בגישה זו באופן חלקי, מאחר endosomes אינם משותק. כתוצאה מכך, זה לא קל לעקוב אחר הגידול של חוטים בודדים ובכך לקבוע את ההיסטוריה של הרשת אקטין. לדוגמה, זה יכול להיות קשה להפלות מ מ crosslinking F-אקטין. עם זאת, אנו בטוחים כי תנאים לפיקוח פלמור אקטין-F בזמן אמת יכול להשתפר בבית הבליעה הדמיה ולמצות את התנאים על מנת לשתק endosomes. באופן דומה, יהיה מעניין לעקוב אחר פלמור אקטין-F של ממברנות מלאכותיות באמצעות רכיבי מטוהרים. למעשה, אנחנו בעבר הראו כי F-אקטין התגרענות הפילמור יכולים להתרחש על ליפוזומים לאחר איגוד tהוא פקטור התגרענות annexin A2 על גבי ה bilayer ליפוזום11. אסטרטגיה זו יהיה שימושי לנתח עוד יותר את תפקיד ספציפי שומנים וחלבונים ב התגרענות F-אקטין את תהליך הפילמור לאפיין מינימלי הרכיבים הדרושים ליצירת רשת F-אקטין על ממברנות endosomal. לבסוף, אנו מאמינים כי אסטרטגיה זו תהיה שימושית מאוד ללמוד תהליכים אחרים תלויי-אקטין-F המתרחשות על ממברנות אנדוזום, במיוחד הגיוס והתגייסות של מכונות שטיפה/retromer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
תמיכה נתקבל שוויצרי הקרן הלאומית למדע; התוכנית Sinergia שוויצרי; הפולנית-השוויצרי מחקר תוכנית (PSPB-094/2010); NCCR בביולוגיה כימיים; LipidX מן היוזמה SystemsX.ch שוויצרי, מוערכים על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (כדי ג'יי ג'י). O. מ נתמכה על ידי התחברות לטווח ארוך EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
