Summary
Tidig endosome funktioner är beroende av F-aktin polymerisation. Här, beskriver vi en mikroskopi-baserade in vitro- test som omformulerar den kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig endosomal membran i provrör, vilket gör detta komplex serie av reaktioner biokemiska och genetiska manipulationer.
Abstract
Många tidiga endosome funktioner, särskilt Last protein sortering och membran deformation, beror på fläckar av kort F-aktin filament nucleated på det endosomal membranet. Vi har etablerat en mikroskopi-baserade in vitro- test som omformulerar den kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig endosomal membran i provrör, vilket gör detta komplex serie av reaktioner kan bli föremål för genetiska och biokemiska manipulationer. Endosomal fraktioner förbereds av flyttankar i sackaros övertoningar från celler som uttrycker det tidiga endosomal proteinet GFP-RAB5. Cytosoliska fraktioner är beredda från separata satser av celler. Både endosomal och cytosoliska fraktioner kan förvaras frysta i flytande kväve, om det behövs. I analysen, den endosomal och cytosoliska fraktioner blandas och blandningen är inkuberas vid 37 ° C under lämpliga förhållanden (t.ex. jonstyrka, minska miljö). Vid önskad tid, reaktionsblandningen är fast, och F-actin avslöjas med phalloidin. Aktin kärnbildning och polymerisation analyseras sedan av fluorescensmikroskopi. Vi rapporterar här, att denna analys kan användas för att undersöka betydelsen av faktorer som är inblandade i aktin kärnbildning på membranet, eller i efterföljande töjning, förgrening eller tvärbindning av F-aktin filament.
Introduction
I högre eukaryota celler, är proteiner och lipider internaliserad i tidigt endosomes där sortering sker. Vissa proteiner och lipider, som är avsedda att vara reutilized, är införlivad med tubulär regioner i den tidiga endosomes och transporteras sedan till plasmamembranet eller till trans-Golgi nätverk (TGN)1,2. Däremot paketeras andra proteiner och lipider selektivt till regioner i de tidiga endosomes som uppvisar ett multivesicular utseende. Dessa regioner expandera och, vid lösgörande från tidig endosomal membran, så småningom mogen i gratis endosomal carrier blåsor eller multivesicular organ (ECV/MVBs), som ansvarar för frakttransporter mot sena endosomes1, 2.
Aktin spelar en avgörande roll i den membran remodeling process som är associerad med endosomal sortering kapacitet och endosome biogenes. Protein sortering längs de återvinning vägarna till plasmamembranet eller TGN beror på den komplexa retromer och de associera proteinerna. Denna sortering maskiner verkar vara kopplat till bildandet av återvinning tubuli via samspelet mellan retromer som är komplexa, med WASP och Scar homologt (WASH) komplexa och förgrenade aktin3,4,5 . Däremot molekyler avsedda för nedbrytning, särskilt aktiveras signalering receptorer, sorteras i intraluminal blåsor (ILVs) av den endosomal sortering komplex krävs för transport (ESCRT)2,6, 7. Medan den eventuella betydelsen av aktin i processen ESCRT-beroende sortering inte är känt, spelar F-aktin en viktig roll i biogenes av ECV/MVBs och transport bortom tidig endosomes. Vi fann särskilt att annexin A2 binder kolesterol-berikade regioner av tidig endosome, och tillsammans med spire1, kärnbildas F-aktin polymerisation. Bildandet av förgrenade aktin nätverket observerats på endosomes kräver aktiviteten förgrening av proteinet aktin-relaterade (ARP) 2/3 komplex, liksom den ERM protein moesin och aktin-bindande protein cortactin8,9.
Här beskriver vi en mikroskopi-baserade in vitro- test som omformulerar den kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig endosomal membran i provrör. Denna analys har använts tidigare för att undersöka betydelsen av annexin A2 i F-aktin kärnbildning och moesin och cortactin i bildandet av endosomal aktin nätverk8,9. Med in vitro- protokollet bli en komplex serie av reaktioner som uppstår på endosomes under aktin polymerisation mottaglig för biokemiska och molekylära analysen av de sekventiella steg av processen, inklusive aktin nukleation, linjär polymerisation, förgrening och crosslinking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lösningar och preparat
Obs: alla buffrar och lösningar bör förberedas i dubbeldestillerat (dd) H 2 O. Eftersom tillståndet återfuktning av sackaros varierar, den slutliga koncentrationen av alla sackaros lösningar måste bestämmas med hjälp av en refraktometer.
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning utan divalenta katjoner (PBS-): 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 och 6,5 mM Na 2 HPO 4. Justera pH till 7,4. Sterilisera i autoklav (1 cykel vid 121 ° C i 15 min) och förvara i rumstemperatur.
- Förbereda stamlösning av 300 mM Imidazol: 0,204 g av Imidazol i 10 mL ddH 2 O.Adjust pH till 7,4 vid 4 ° C med HCl. Filter-sterilisera använder en 0,22 μm porstorlek storlek filter och förvaras vid 4 ° C.
- Förbered homogenisering buffert (HB; förbereda ca 100 mL): 250 mM sackaros i 3 mM Imidazol. Justera pH till 7,4 vid 4 ° C med hjälp av en pH-mätare. Filter-sterilisera med 0,22 μm porstorlek storlek filter och förvaras vid 4 ° C. komplement HB strax före användningen med en cocktail av proteashämmare på slutliga koncentrationer motsvarande 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A och 10 ng/mL aprotinin.
- För steg floatation Övertoningarna, förbereda 62%, 39% och 35% sackaros lösningar i 3 mM Imidazol, pH 7,4, som beskrivs nedan. Exakt bestämma den slutliga koncentrationen av alla sackaros lösningar med hjälp av en refraktometer.
- Förbereda 100 mL 62% sackaroslösning i 3 mM Imidazol, pH 7,4. Lös upp genom omrörning 80,4 g sackaros i ddH 2 O har pre värmas till 35 ° C. Add 1 mL 300 mM Imidazol stamlösning och fyll till 100 mL med ddH 2 O. Justera pH till 7,4 vid 4 ° C. Filter-sterilisera med en 0,22 μm porstorlek storlek filter och butik vid 4 ° C.
- Bereda 100 mL 35% sackaroslösning i 3 mM Imidazol, pH 7,4. Lös upp genom omrörning 40,6 g sackaros i ddH 2 O. Add 1 mL 300 mM Imidazol stamlösning och fyll till 100 mL med ddH 2 O. Justera pH till 7,4 vid 4 ° C. Filter-sterilisera använder en 0,22 μm porstorlek storlek filter och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda 50 mL 39% sackaros i 3 mM Imidazol, pH 7,4. Späd den 62% sackaroslösning med 35% sackaros lösningen. Förvaras vid 4 ° C.
- Lös upp 3 g PARAFORMALDEHYD (PFA) under omrörning i 100 mL PBS-pre-warmed till 60 ° C samtidigt lägga 1 M NaOH droppvis; justera slutliga pH till 7,4 med NaOH. Filter-sterilisera med 0,22-μm porstorlek storlek filter och förvaras vid -20 ° C.
FÖRSIKTIGHET: 3% PFA är ett giftigt reagens. - Förbereda 1 M KCl stamlösning. Lös 3,73 g KCl under omrörning i 50 mL ddH 2 O. Filter-sterilisera med 0,22-μm porstorlek storlek filter och förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 50 X koncentrerad stamlösning innehållande 0,625 M Hepes pH 7,0 och 75 mm MgOAc 2 i ddH 2 O. alikvot och butik vid -20 ° C.
- Förbered monteringsmedium. Blanda genom omrörning 2.4 g poly(vinylalkohol) M w ~ 31,000 (PVA) med 6 g glycerol. Tillsätt 6 mL ddH 2 O och låt verka i minst 2 timmar i rumstemperatur. Tillsätt 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) och Värm till cirka 53 ° C med enstaka under omrörning tills PVA har upplöst.
- Klargöra lösningen genom centrifugering på 5 000 x g i 20 min i rumstemperatur. Samla in supernatanten och lägga till 2,5% (w/v) 1,4 - diazabicyklo-[2.2.2] oktan (DABCO) för att förhindra fotoblekning under fluorescens identifiering. Virvel för ca 30 s att upplösa. Alikvotens i 1,5 mL plaströr och förvaras vid -20 ° C.
2. Cellodling
- kultur HeLa cells i Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 10% icke-essentiella aminosyror, 10% L-glutamin, och 1% penicillin-streptomycin. Bibehålla dem vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Transfect cellerna 24 h innan experimentet med GFP-RAB5 10, använda kommersiella transfection reagens enligt tillverkaren ' anvisningar.
- När det behövs, förbereda endosomal fraktioner och cytosolen från celler utarmat av ett protein av intresse (dvs. med hjälp av RNAi eller CRISPR/Cas9) eller överuttryck en vildtyp eller mutant form av proteinet av intresse.
3. Endosomal fraktion förberedelse
Obs: det här protokollet beskriver enkel beredning av subcellulär fraktioner som innehåller endosomes och andra lätta membran. Om det behövs kan renat endosome fraktioner används 11. Förbered 2 petriskålar (10-cm ytterdiameter; 57 cm 2) av konfluenta celler som uttrycker GFP-RAB5 som utgångsmaterial. Det totala antalet konfluenta HeLa cells i 2 petriskålar motsvarar ungefär 2,5 x 10 7 celler. När behövs, endosomes kan också framställas från celler utarmat av ett protein av intresse (dvs. med hjälp av RNAi eller CRISPR/Cas9) eller överuttryck en vildtyp eller mutant form av proteinet av intresse, alltid uttrycker GFP-RAB5.
försiktighet: alla steg av fraktionering protokollet bör utföras på ice.
- Placera Petriskålarna på en våt metallplatta i en platt ishink och omedelbart tvätta cellerna två gånger med 5 mL iskallt PBS-.
- Bort alla PBS - från den sista tvättningen och tillsätt 3 mL iskallt PBS-per maträtt. Cellerna bör inte torka under hantering: vid behov, placera ishink på en gungande plattform att tillräckligt täcka celler med fluid.
- Mekaniskt bort cellerna i PBS i petriskålar med en flexibel gummi polis (dvs hemmagjord cell skrapan). Skrapa cellerna av rätterna först i en snabb, cirkulär rörelse runt utsidan av skålen, följt av en nedåtgående rörelse i mitten av skålen. Skrapa försiktigt för att få " ark " av kopplade celler. Försiktigt överföra cellerna med en plast Pasteur-pipett med en bred öppning i en 15 mL koniska polypropylen rör på ice.
- Centrifugera under 5 minuter på 175 x g och 4 ° C.
- Försiktigt avlägsna supernatanten (SN) och Lägg till 1-3 mL HB pelleten. Försiktigt med en plast Pasteur-pipett med en bred öppning, Pipettera upp och ner en gång för att resuspendera cellerna.
- Centrifugera under 7-10 minuter på 1 355 x g och 4 ° C. försiktigt ta bort SN.
- Utföra cell homogenisering.
Obs: Villkoren bör vara varsam så att plasma membran av cellerna bryts men endosomerna förbli intakt.- Lägg till en känd volym HB med proteashämmare på varje cellpelleten (ca 100 μl per cellpelleten). Använder en 1.000-µL mikropipett, Pipettera försiktigt upp och ner tills cellerna är resuspended. Gör inte införa luftbubblor.
- Förbereda en 1 mL tuberkulin spruta med en 22G nål pre sköljda med HB och gratis luft eller bubblor.
- Fylla sprutan med cellsuspensionen relativt långsamt (för att undvika att skapa luftbubblor), placera avfasade spetsen på nålen mot väggen av röret och utvisa cellsuspensionen snabbt vill skeva av plasma membran av kopplade celler.
- Ta en liten alikvot av Homogenatet (cirka 3 µL) och späd till 50 µL av HB på en glasskiva. Mix och täck med ett täckglas. Inspektera Homogenatet under ett faskontrastmikroskop utrustad med en 20 X eller 40 X objektiv.
Obs: Under optimala förhållanden, de flesta celler är trasiga, men kärnor, som visas som mörkgrå och runda strukturer, är inte ( figur 1). - Upprepa steg 3.7.3 och 3.7.4 tills de flesta celler bryts; vanligen 3-6 up-and-down stroke genom nålen är nödvändiga. Hålla en liten alikvot (10-30 µL) av Homogenatet för bestämning av protein.
- Centrifug Homogenatet för 7 min på 1 355 x g och 4 ° C.
Obs: efter centrifugeringen, pelleten (definierat som den nukleära pelleten; NP) innehåller atomkärnor och supernatanten (definieras som postnuclear supernatanten; PNS) innehåller cytosolen och organeller släppt vid homogenisering och gratis Suspenderande. - Omsorgsfullt samla PNS. Hålla små delprover (10-30 µL) av PNS och NP för bestämning av protein och kassera NP.
- Justera PNS till 40,6% sackaros genom att späda 62% sackaros lösningen med PNS med förhållandet 1:1.1 PNS:62% sackaros. Blanda försiktigt men grundligt, utan att skapa luftbubblor. Kontrollera sackaroshalten med refraktometern.
- Placera PNS i 40,6% sackaros på botten av en ultracentrifugering röret. Overlay noggrant med 2,5 mL 35% sackaroslösning och fylla centrifugröret med HB.
Obs: Sackaros lösningarna bör appliceras så att gränssnitt är klart synliga. - Ultracentrifugen Övertoningarna för 1 h på ̴165, 000 x g och 4 ° C.
- Ta försiktigt bort det vita lagret av lipider ovanpå övertoningen. Nästa, samla gränssnittet som innehåller endosomes, mellan HB och 35% sackaros, använder en 200-μL mikropipett med en skuren spets.
Obs: De endosomal fraktionerna kan användas direkt i in vitro- aktin polymerisation analysen eller kan vara aliquoted på is, flash-frysta i flytande kväve, och lagras vid -80 ° C. - Att bestämma proteinkoncentration PNS och endosomal fraktioner.
Obs: Denna koncentration bör vara minst 100 µg/mL. 2,5 x 10 7 celler odlas i 2 petriskålar behövs för att erhålla en PNS med minst 100 µg/mL (se noten ovan).
4. Cytosol förberedelse
Obs: förbereda 2 petriskålar (diameter 10 cm, 57 cm 2) av konfluenta HeLa cells som utgångsmaterial. När det behövs, kan cytosolen också framställas från celler utarmat av ett protein av intresse (dvs. med hjälp av RNAi eller CRISPR/Cas9) eller överuttryck en vildtyp eller muterade formen av proteinet av intresse. När det gäller protokollet endosome fraktionering, alla åtgärder ska utföras på ice.
- Upprepa steg 3.1-3.8.
- Placera PNS i ett centrifugrör och ultracentrifugen för 45 min på ̴250, 000 x g och 4 ° C.
- Försiktigt bort det vita lagret på toppen och samla SN (cytosol fraktion) utan att störa pelleten levermikrosom. Hålla en alikvot av det cytosol bråket för bestämning av protein.
Obs: Cytosolen kan användas direkt i in vitro- aktin polymerisation analysen eller kan vara aliquoted på is, flash-frysta i flytande kväve, och lagras vid -80 ° C. - Att bestämma proteinkoncentration cytosolen.
Obs: Det ska vara minst 3 mg/mL.
5. Assay mäta Endosome-beroende aktin polymerisation In Vitro
Obs: Endosome-beroende aktin polymerisation kan utföras med hjälp av två alternativa metoder. Den första metoden, material blandas i ett provrör, fast, och överföras till ett täckglas och analyseras. I den andra metoden, som beskrivs här, kan analysen utföras direkt i imaging kammaren kan vara fast och analyseras utan mekanisk störning ( figur 2 c). I denna andra metod, assay blandningen överförs inte från ett provrör till ett täckglas och därmed förblir oberörd, minskar risken för F-aktin nätverk att vara fysiskt orolig under överföringen. Denna andra metod är dessutom kompatibel med en time-lapse analys av F-aktin polymerisation. Det bör noteras att ingen skillnad i analysen av F-aktin polymerisation observerades med antingen tillvägagångssätt.
Obs: Använd skär tips i hela protokollet.
- i ett provrör
- försiktigt blanda iskall renad GFP-RAB5 endosomes (steg 3) med cytosol (steg 4) i förhållandet 1:10 (proteinkoncentration) i en iskall 1,5 mL koniska provrör.
Obs: En typisk experiment utförs med ca 40-50 µL. - Justera iskall reaktionsblandningen att slutliga koncentrationer av 125 mM KCl (med 1 M KCl stamlösning), 12,5 mM Hepes och 1,5 mM MgOAc 2 (med 50 x stamlösning). Justera sedan blandningen med proteashämmare för slutliga koncentrationer av 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A och 10 ng/mL aprotinin. Blanda försiktigt alla komponenter.
- Placera provröret som innehåller reaktionsblandningen vid 37 ° C, utan att skaka, och Inkubera under önskad tid.
Typiskt, det kommer att ta cirka 3 min att upptäcka aktin polymerisation på endosomes och 30 min för bildandet av ett omfattande nätverk. - Vid önskad tid (dvs. 3 min eller 30 min), stoppa reaktionen genom att placera provröret på is och Lägg till 1/10 (VOL:VOL)(2)) av förhandskyld 3% PFA lösningen.
- Lägga till 0.3:10 (VOL:VOL)(2)) av 200 enheter/mL (~6.6 μM) phalloidin konjugerat till röd-orange färg att färga polymeriserat actin.
- Plats 12 μL av blandningen på 12 μl PVA monteringsmedium på en mikro glasskiva. Sätta en 18 x 18 mm 2 glasskiva coverslipon.
- Analysera provet med konfokalmikroskopi.
- försiktigt blanda iskall renad GFP-RAB5 endosomes (steg 3) med cytosol (steg 4) i förhållandet 1:10 (proteinkoncentration) i en iskall 1,5 mL koniska provrör.
- i imaging kammaren
- för att göra mikroskopiska imaging chambers, använda plasma renare för 1 min att rengöra ett täckglas runda 18-mm diameter och en rund 35 mm diameter petriskål utrustad med en 20 mm glas botten (0,16-0,19 mm).
- Inkubera rengjorda ytorna med 1% β-kasein för 20 min att minimera Proteinbindningen av glas. Tvätta två gånger med 3 mM Imidazol.
- Lägg till endosome och cytosolen, i samma assay blandning som i steg 5.1.1 och 5.1.2, till en förhandskyld 1,5 mL provrör och komplettera assay blandningen med 0,1 μg/μL rodamin-aktin.
- Justera slutliga brytningsindex för blandningen till 1,375 (26,5% sackaros) med 39% sackaroslösning.
Obs: Vanligtvis samma volym är adderat; Detta har dock att justeras empiriskt beroende på sackaroshalten i det insamlade bråk, som fastställs med hjälp av en refractomer, eftersom sackaroshalten ändras något från experiment till experimentet. - Placera blandningen på förbehandlade 35 mm skålen (steg 5.2.1) och täck den med det förbehandlade 18-mm täckglaset (steg 5.2.1).
- Placera kammaren vid 37 ° C, utan att skaka.
- Analysera provet med hjälp av fluorescens konfokalmikroskopi.
6. Bild Acquisition och analys av aktin nätverk
- Bild Förvärvandet
- förvärva bilderna på en inverterad skanning confocal mikroskopet.
Obs: Förvärv bildinställningar var optimerad för en inverterad skanning confocal Mikroskop med en 63 X 1,25 NA olja mål. Justera laser kraften (vanligtvis runt 50%) att uppnå en bra signal-brusförhållande.
- förvärva bilderna på en inverterad skanning confocal mikroskopet.
- Kvantifiering av aktin nätverket
- analysera de fluorescerande micrographs. Använda opensource programvara CellProfiler (v2.1.1) 12 för att mäta mängden aktin per endosome (alternativ programvara kan användas).
- Först, identifiera endosomes som det primära objektet med av GFP-RAB5. Sedan kvantifiera F-actin associerade med enskilda endosomes med hjälp av förökningen av aktin signalen (röd-orange färg konjugerat Phalloidin) som ett sekundärt objekt.
- Genomsnittliga och normalisera antalet associerade material för varje objekt i villkoret kontroll.
- analysera de fluorescerande micrographs. Använda opensource programvara CellProfiler (v2.1.1) 12 för att mäta mängden aktin per endosome (alternativ programvara kan användas).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att få insikter i bildandet av F-aktin fläckar på tidig endosome membran, följde vi protokollet beskrivs i figur 2. Kortfattat, celler var transfekterade med GFP-RAB5 och sedan tidig endosomes utarbetades av subcellulär fraktionering. Dessa renat tidigt endosomes inkuberades med cytosol för att ge aktin själv samt andra faktorer som kan tänkas vara inblandade i reaktionen. I slutet av inkubationstiden stoppades reaktionen av fixering av blandningen. Ett prov sedan samlades in och deponeras i en mikroskopisk bild. F-aktin avslöjades slutligen med phalloidin (figur 3A). Kärnbildning av F-aktin på tidig endosomal membran samt den efterföljande polymerisation processen uppstod snabbt. F-aktin kunde faktiskt redan visualiseras på endosomes inom 1min efter början av reaktionen (figur 3A). Dessa aktin strukturer, som var ursprungligen kort, blev snabbt längre, grenade och länkade till en annan leder till bildandet av ett sammanvävda nätverk av aktin filament (figur 3A), förmodligen återspeglar obalanserad aktin dynamics in vitro. Liknande kärnbildning och polymerisation priser observerades när analysen utfördes med renat rodamin-märkt aktin förutom cell cytosol. Detta gjordes i glasbotten rätter så att strukturer kunde avbildas direkt, i avsaknad av någon störning (figur 3B). I analysen beskrivs här, kärnbildas tidigt endosomes de novo aktin polymerisation selektivt. Verkligen, aktin polymerisation inträffar inte när in vitro- reaktionen utfördes i avsaknad av antingen endosomes eller cytosol. Det kan således konstateras att tidig endosomes ha grundläggande förmåga att stödja kärnbildning och efterföljande polymerisation av aktin filament9,11.
För att analysera mängden aktin polymeriseras från endosomes, analyserades bilder som förvärvats vid olika tidpunkter med hjälp av CellProfiler (figur 4A). Mängden aktin polymeriseras per endosome mättes som området av aktin kring en enda tidiga endosome. Aktin polymerisation var högre i början av processen och minskade med tiden (figur 4B). Aktin nätverket kunde analyseras mer i detalj på tidiga tidpunkter efter början av reaktionen. På dessa tidiga tidpunkter, kunde enskilda aktin-innehållande strukturer fortfarande vara skiljas från varandra. För att utvärdera komplexa organisationen av aktin nätverk, räknades antalet aktin filament som härrör från varje endosome (dvs. primära glödtrådar). Likaså räknades antalet aktin filament med ursprung från primära filament (dvs, sekundära filament), samt alla andra aktin filament som kunde identifieras i nätverk och som inte har sitt ursprung från endosomes (antal dvs, andra filament) (figur 4 c-E. När aktin filament spårades, beräknas andra parametrar, såsom längd av enskilda aktin filament och antal endosomes ansluten till de samma aktin filament, kunde vara enkelt (figur 4F).
Figur 1: fas kontrast Mikrograf av en HeLa cellen Homogenatet. Efter homogenisering, var extraktet monterad mellan en mikroskopisk bild och ett täckglas. För publicering fångades micrographs med en 100 X mål efter oljeimmersion. För rutinmässig inspektion, dock var cell extraktet visualiserat under en 20 X eller ett 40 X-objektiv utan oljeimmersion. Två exempel på hög förstoring utsikt över Homogenatet visas (A-B). Atomkärnor (star) visas som runda strukturer mörkgrå färg, utan bifogade cell rester. Pilarna pekar på de karakteristiska granulerna av varierande storlek, form och genomskinlighet, som frigörs vid cell homogenisering och motsvarar intracellulära material (dvs organeller). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk Representation av protokollet. Schematisk beskrivning av de protokoll som används för att förbereda endosomal extrakt (A) och cytosolen extrakt (B) och att övervaka aktin polymerisation från endosomes in vitro- (C). Supernatanten (SN), homogenisering buffert (HB), postnuclear supernatanten (PNS), nukleära pellet (NP) och paraformaldehyd (PFA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kärnbildning och polymerisation av F-aktin på tidig Endosomes In Vitro. (A) Endosomes renas från Hela celler uttrycker GFP-Rab5 (grön) och HeLa cytosol upprättats separat. I analysen, tidig endosomes (EEs) blandades med cytosol, och blandningen var inkuberas för den angivna tider. Blandningen var sedan fast, märkt med phalloidin (röd) till etikett F-aktin och analyseras av fluorescens konfokalmikroskopi. Barer: 10 µm (övre panelen) och 5 µm (nedre panelen). (B)-europeiska sysselsättningsstrategin renats från Hela celler som uttrycker GFP-Rab5 (grön) och HeLa cytosol upprättats separat. Dessa cell extrakt inkuberades med renat rodamin-aktin (röd) för den angivna tider i mikroskopet chambers och analyserades av konfokalmikroskopi. Skalstapeln = 10 µm. (C) experimentet utfördes som i A. HeLa cytosol (utan EEs) och HeLa endosomes (grön) märkt med GFP-Rab5 (utan cytosol) inkuberades separat (panelerna vänster och mitten) eller tillsammans (höger panel) för 30 min, fast, märkt med phalloidin (röd) till etikett F-aktin och analyseras av fluorescens konfokalmikroskopi. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: analys av nätverkets aktin. (A) arbetsflöde för CellProfiler analys. (B) antal polymeriserat aktin kvantifierades i förhållande till antalet endosomes med programvaran CellProfiler. Data är medianvärdet ± s.e.m. (n = 3). Data är medel ± s.d. (n = 3). 5 min jämfört med 15 min (ns P= 0.0736), 5 min jämfört med 30 min (* P = 0,0195), och 15 minuter jämfört med 30 min (ns P = 0.3129). (C)Tidig endosomes (EEs) renas från Hela celler uttrycker GFP-Rab5 och HeLa cytosol utarbetades separat, och analysen genomfördes som i figur 2A. Prover har korrigerats efter 7 min. Den mellersta panelen visar den samma Mikrograf, med överlappningen av tracesna av F-aktin strukturer ritats med den NeuronJ plugin13 i programmet ImageJ. Den högra panelen visar spår endast. Skalstapeln = 10 µm. (D) Representation av F-actin struktur nummerserien som används i kvantifiering med ImageJ programvara. (E) kvantifiering av numrera av aktin filament, enligt definitionen i C-D. Data är medel ± s.d. (n = 3). Primära grenar kontra sekundära grenar (ns P = 0.5262), sekundära grenar kontra andra grenar (ns P = 0.6815), och primära grenar kontra andra grenar (ns P = 0.2254). (F), längden på F-aktin strukturer och antalet anställda per aktin strukturen visas som exempel på andra parametrar än kan analyseras med kvantifiering definieras i C-D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktin spelar en avgörande roll i endosome membran dynamics4,14. Tidigare rapporterade vi att aktin kärnbildning och polymerisation inträffar på tidig endosomes, bildar små F-aktin patchar eller nätverk. Dessa F-aktin nätverk krävs absolut för membran transport bortom tidig endosomes längs nedbrytningsvägen. Störande vid varje steg av denna kärnbildning och polymerisation process förhindrar endosome mognad och därmed nedströms transport mot sena endosomes andlysosomes9,11,15. I synnerhet använde vi analysen ovan att analysera de sekventiella steg av F-aktin polymerisation på tidig endosomes och kännetecknar processen på molekylär nivå.
I dessa experiment, är tidig endosomes märkt med GFP-RAB5 i vivorenas genom subcellulär fraktionering och inkuberas i ett provrör i närvaro av cytosol för F-aktin polymerisation i vitro. Vid önskad tid, reaktionen stoppas och reaktionsblandningen överförs till en mikroskopisk bild för analys av fluorescensmikroskopi, använder phalloidin för att märka den F-aktin. Använda denna experimentella strategi, visade vi att annexin A2 är nödvändigt för kärnbildning av F-aktin på tidig endosomes, tillsammans med SPIRE1, medan ARP2/3 förmedlar F-aktin förgreningar, som förväntat. Vi visade också att moesin och cortactin är nödvändiga för bildandet av de F-aktin nätverk som förmedlar ECV/MVB biogenes och mognad längs nedbrytningsvägen däggdjursceller9,11.
Det är viktigt att komma ihåg att även om låga nivåer av ectopically uttryckta RAB5 inte ändrar endosomes till någon betydande omfattning10, denna lilla GTPase är en nyckelroll i regulering av tidig endosome membran dynamics16,17 . I några experiment, kan det därför vara lämpligt att etiketten endosomes i analysen använda alternativa protokoll. Till exempel kan tidiga endosomes bekvämt märkas med endocytosed fluorescerande spårämnen såsom epidermal tillväxtfaktor eller transferrin4,14.
Det bör också noteras att det är tekniskt svårt att bilden enskilda aktin filament med konventionella konfokalmikroskopi. Därför hänvisar vi till F-aktin strukturer i hela texten att beskriva aktin nätverk på endosomes. Följaktligen anser vi att bildandet av ett F-aktin nätverk kan kvantifieras mer exakt genom att mäta fluorescens yta nätverk i stället för deras intensitet.
Det är inte lätt att helt utesluta möjligheten att aktin kärnbildning aktivitet observerades i vitro medieras av någon annan struktur eller organell som förblir bunden till RAB5 endosomes under reningen. Sådan kontaminering är dock högst osannolikt. Medan vissa organeller rena Co på övertoningar på grund av liknande fysiska egenskaper, tenderar de inte att vara kvantitativt bundna till varandra efter rening. Aktin kärnbildning aktiviteten beror dessutom strängt på annexin A24,14, som är närvarande på tidig endosomes som innehåller RAB514. Slutligen finner vi att F-aktin strukturer är associerade selektivt med RAB5 endosomes i vivo och finns inte på andra endosomes eller andra cellulära membran4,14. Sammanfattningsvis, sannolikt aktin kärnbildning aktivitet associerade med RAB5 endosomes, eftersom denna verksamhet tillsammans renar och samtidig lokaliserar med RAB5 endosomes.
I denna analys är mycket som i andra analyser som rekonstruera de komplexa biokemiska reaktionerna som styr dynamiken i endosomes16 eller andra membran18 och som utförs i ett provrör, det viktigt att säkerställa att preparatet av de cellulära extrakt är optimal. Cellerna bör homogeniseras under milda förhållanden att begränsa skador på endosomes och andra organeller, särskilt kärnor och lysosomer. Endosome fraktioner bör också hållas på is under förhållanden som minimerar osmotisk och Joniska stress, samt spontana aktin polymerisation. I ytterligare, relativt höga koncentrationer av endosome fraktion (≥0.1 mg/mL) och cytosolen (≥ 3 mg/mL) som krävs för adekvat F-aktin polymerisation på endosomes och upptäckt, som anges i steg 3.13 och 4.4, respektive. Likaså är det viktigt att genomföra analysen med en 1:10 andelen endosome till cytosolen (protein: protein), som anges i steg 5.1.1. Slutligen, pipettering efter aktin polymerisation (dvs lägga till PFA och phalloidin) bör ske mycket försiktigt för att undvika kollapsa eller bryta aktin nätverket.
Om nödvändigt, kan in vitro- aktin polymerisation analysen också utföras direkt i Mikroskop imaging avdelningen, efter att renat rodamin-aktin till assay blandningen, för att begränsa mekaniska störningar av aktin nätverken polymeriseras på endosomes (se steg 5.2.3 och figur 2). I detta fall är det bäst att justera utdraget till 26,5% (0.85 M) sackaros (refractive index av 1,375), begränsande diffusion och Brownian-liknande motion (steg 5.2.3) och ta bort eventuella aggregat av renat rodamin-aktin av ultracentrifugering före användning. Våra observationer att moesin styr bildandet av F-aktin nätverk på endosomes var fullt återgetts använder denna alternativa version av vår analys4,14.
Antingen version av våra protokoll, i provröret eller i imaging kammaren, är optimal för en global analys av F-aktin kärnbildning och polymerisation på endosomes. Det är dock inte lätt att följa den aktin polymerisation processen genom tiden med detta synsätt, delvis eftersom endosomes inte är orörlig. Följaktligen är det inte lätt att övervaka tillväxten av enskilda filament och därmed avgöra historien av aktin nätverket. Exempelvis kan det vara svårt att diskriminera F-aktin förgrening från crosslinking. Vi är dock övertygade om att villkoren för att övervaka F-aktin polymerisation i realtid kan förbättras i imaging kammaren genom att optimera villkoren för att immobilisera endosomes. På samma sätt, det ska bli intressant att övervaka F-aktin polymerisation från konstgjort membran med renade komponenter. I själva verket visade vi tidigare att F-aktin kärnbildning och polymerisation kan uppstå på liposomer efter bindande tHan kärnbildning faktor annexin A2 på Liposom lipidens11. Denna strategi kommer att vara användbart till ytterligare analysera specifika lipider och proteiner i F-aktin kärnbildning och polymerisation roll och att karakterisera de minimal komponenterna som är nödvändiga att bilda ett F-aktin nätverk på endosomal membran. Slutligen anser vi att denna strategi kommer att vara mycket användbart för att studera andra F-aktin-beroende processer på endosome membran, särskilt rekrytering och mobilisering av retromer/tvätt maskiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Fick stöd från schweiziska National Science Foundation; Schweiziska Sinergia programmet; Polska-schweiziska forskningsprogrammet (PSPB-094-2010); NCCR i kemisk biologi; och LipidX från det schweiziska SystemsX.ch initiativet, utvärderas av schweiziska National Science Foundation (till J. G.). O. M. stöddes av ett långsiktigt EMBO-stipendium (2012-ALTF-516).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
