Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Abstract

Serebellar granül nöronlar (CGNs) bol bir homojen nüfus beyincik içinde şekillendirme bir sık kullanılan nöronal model vardır. Onların doğum sonrası gelişim, bereket ve erişilebilirlik ışığında CGNs nöronal süreçler, nöronal gelişim, nöronal göç ve fizyolojik nöronal aktivite stimülasyon gibi eğitim için ideal bir model vardır. Ayrıca, CGN kültürler hücre ölümü excitotoxicity ve Apoptozis dahil olmak üzere farklı modları eğitim için mükemmel bir model sağlar. Kültür bir hafta içinde CGNs N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptörleri, birçok kritik işlevleri nöronal sağlığı ve hastalıkları ile belirli ionotropic Glutamat reseptör hızlı. NMDA düşük konsantrasyonlarda membran depolarizasyon kemirgen birincil CGN kültürleri ile birlikte ek NMDA yüksek konsantrasyonda ilavesi modellemek için istihdam edilebilir iken fizyolojik nöronal aktivite stimülasyon model oluşturmak için kullanılan excitotoxic nöronal yaralanma. Burada, bir yöntem tecrit ve 6 gün eski pups yanı sıra CGNs genetik manipülasyon adenovirüse bakın ve lentiviruses tarafından CGNs kültür açıklanmıştır. Biz aynı zamanda NMDA kaynaklı excitotoxicity, düşük potasyum indüklenen apoptosis, oksidatif stres ve bu nöronların iletim takip DNA hasarı teşvik konusunda mevcut en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları.

Introduction

Serebellar granül nöronlar (CGNs) de kültür karakterize edilmektedir ve nöronal ölüm ve geliştirme 1,2,3,4,5, çalışmaya etkili bir model olarak hizmet etmiş 6. CGN kültürler vitro N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptörlerinin erken ifade onları NMDA kaynaklı sinyalizasyon eğitim için çekici bir model yapar. Etkinleştirme membran depolarizasyon ile birlikte NMDA ile bu reseptörlerinin fizyolojik nöronal aktivite stimülasyon model oluşturmak için kullanılan ve sinaptik plastisite 7,8mekanizmaları araştırma için izin verdi. Aksine, bu reseptörler NMDA ligand tarafından aşırı uyarılması excitotoxicity, akut beyin hasarı ve nörodejeneratif hastalıklar 9nöronal kaybın büyük bir mekanizma modellemek için kullanılabilir. Excitotoxicity indüksiyon için bir mekanizma ATP açlık düşük oksijen ile akut nöronal yaralanma ile görüldüğü gibi geçer. Bu membran depolarizasyon sonuçlanır ve Glutamat yüksek seviyede sinaps bırakın. NMDA reseptör Ca2 +dahil olmak üzere çeşitli yollar teslim etkinleştiren aşırı Ca2 + akını bu reseptörler yoluyla yükseltilmiş Glutamat sonuçlarına göre sonraki uyarım-proteaz, phospholipases, harekete geçirmek ve endonucleases, kritik hücresel bileşenleri ve hücre ölümü kontrolsüz bozulması sonucu. Ayrıca, yüksek intrasellüler Ca2 + oksijen serbest radikallerin ve mitokondrial hasar 10,11nesil açar.

Nöronal kayıp nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı takip çoğunluğu kalsiyum akını nedeniyle ve Bax/Bak bağımsız iken, diğer mekanizmaları hücre ölümü bu modelden dışarıda bırakılamaz. Nekrotik her ikisi de görünümünü ve apoptotik hücre ölümü excitotoxicity nedeniyle kısmen nedeniyle üretimiyüksek intrasellüler Ca 2 + düzeyleri 12tarafından neden olduğu DNA hasar Reaktif oksijen türleri (ROS) ve sanki. DNA hasarı apoptotik mekanizmalarıyla, apoptotik hücre ölümü, Kromatin kitleler ve apoptotik organları görünümünü gibi işaretlerinden ile ilişkili nöronal ölümle sonuçlanır. Apoptozis indüksiyon mitokondri sitokrom c sürümünden üzerinden aracılı ve Bax/Bak Oligomerizasyonda 13tarihinde bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bax/Bak Oligomerizasyonda sitokrom c yayın ve hafif iskemik yaralanma 14ile görüldüğü gibi pro-apoptotik düzenleyicileri aktivasyonu sonuçlanan dış mitokondrial membran gözenek oluşumu teşvik etmektedir.

ROS nesil endojen antioksidanlar, nöronal işleyen 15büyük oksijen gereksinimini ile birleştiğinde seviyesinin düşük nedeniyle beyinde önemli bir konudur. İskemik olay olarak maruz, nitrik oksit sentaz nitrik oksit üreten ve Reaktif oksijen türleri 14artan upregulated olur. Oksijen radikalleri artan konsantrasyon DNA zarar görmesine neden ve dolaylı olarak neden enerji açlık. DNA çift iplikçikli sonları yüksek düzeyde Poli ADP-riboz polimeraz-1 (PARP-1), bir ökaryotik Kromatin bağlı protein ADP-riboz birimleri transferi NAD+bir işlemi için ayrılmaz kataliz için sorumlu aktivasyonu tarafından giderildiği DNA onarım 16. Ancak, oksidatif stres nedeniyle aşırı hasar ile PARP-1 etkinleştirme enerji açlık nedeniyle artan drenaj NAD+, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi için gerekli bir substrat neden olabilir. Sonuçta, oksidatif stres apoptosis mitokondrial sitokrom c serbest bırakmak için önde gelen bir Bax/Bak bağımlı şekilde tetikler ve mitokondriyal CGNs 17' remodeling neden olduğu gösterilmiştir.

Son olarak, Potasyum klorür (KCl) CGN kültürlerde konsantrasyon değişiklikleri düşük potasyum/depolarizasyon aracılı apoptosis 18,19,20modellemek için kullanılabilir. K+düşük düzeylere maruz kaldığında, CGNs mitokondrial solunum ve azalan hücresel talep 21' e, atfedilen Glikoliz, indirim yanı sıra düzeyde azalma sonuçlanan farklı fizyolojik değişiklikleri meydana Nükleer faktör-hareket enflamasyon ve sinaptik iletimi 22dahil düzenleyen κB (NFκB). Hücre ölümü nöronal gelişim sırasında çalışma için özel ilgi bu modeldir. Düşük K+ ortamı daha yakından fizyolojik şartlarda benzer ve hücre ölümü nöronal gelişim 23sırasında görülen işaretlerinden neden olur.

Özetle, CGNs nöronal ölüm ve dejenerasyon temel moleküler mekanizmaları incelemek için uzun süredir devam eden bir model sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralı yalıtım ve CGNs, ifade veya virüs ve nöronal ölüm nöronal yaralanma ve dejenerasyon gösteren farklı mekanizmalar aracılığıyla indüksiyon kullanarak belirli bir genetik yolu bir baskı kültür sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokole dayanarak değişiklikler olmuştur yordamlardan açıklandığı daha önce 18 , 24 , 25 , 26 , 27. bu protokol McGill Üniversitesi'nde hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış.

1. deneysel hazırlık

Not: aşağıdaki hisse senedi çözümleri hazırlanan ve kullanım kadar devam.

  1. Diseksiyon çözüm
    1. erime 3,62 g sodyum klorür (NaCl), Potasyum klorür (KCl), sodyum fosfat 0,069 g 0.2 g (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O) ve D-(+) 1.306 g-glikoz 500 ml distile H 2 O. O zaman HEPES tampon, fenol red çözüm 450 µL ve BSA kesir V 20 mL 12,5 mL ekleyin. PH 7.4 1 N sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak ayarlamak.
    2. Sterilize 0,22 µm filtre ve mağaza 4 ° C'de Bu çözüm için bir hafta 10 gün için kararlı kalır.
  2. Tripsin
    1. 25 g/L % 0,9 Sodyum Klorür tripsin bir konsantrasyon hisse senedi bir çözüme hazır olun. Saklamak belgili tanımlık eriyik vasıl -20 ° c
  3. Tripsin inhibitörü
    1. 10 mg/mL bir konsantrasyon ile bir hisse senedi 1 g tavuk yumurta akı tripsin inhibitörü 1 mM HCl. deposunun 100 ml çözülerek -20 bu çözüm hazırlamak ° C.
  4. Dnaz
    1. Dnaz 1 100 mg 10 mL 10 mg/mL stok oluşturmak için steril su içinde çözülür. Saklamak belgili tanımlık eriyik vasıl -20 ° c
  5. MgSO 4
    1. 6.02 g Magnezyum sülfat (MgSO 4) 50 mL distile su (H 2 O) 1 M stok oluşturmak için ekleyin. Saat 4'te çözüm depolamak ° C.
  6. CaCl 2
    1. Kalsiyum klorür 0.735 g dağıtılması (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) 50 ml distile H 2 O hisse senedi toplama 100 mm için. Saat 4'te çözüm depolamak ° C.
  7. KCl
    1. KCl çözülür 3.7275 g 50 ml distile H 2 O 1 M. mağaza çözüm bir hisse senedi konsantrasyonu 4 ° C.
  8. D-(+)-glikoz
    1. D-(+)'ın 1.802 gram Dissolve-glikoz 50 ml distile H 2 O hisse senedi toplama 100 mm için. Saat 4'te çözüm depolamak ° C.
  9. Hücre kültür medya
    1. aşağıdaki gibi hücre kültür ortamı hazırlamak: ısı 5 mL inaktive diyaliz Fetal sığır Serum, 200 mm L-glutamin, 50 mg/ml viomisin ve 1 mL 100 µL 1,0 M KCL 500 µL 45 mL ekledi Kartal filtre sterilize ' Bu D 1,125 g/L ile desteklenmiş s en az temel medya (E-MEM)-50 mL serebellar granül nöron kültürü medya oluşturmak için glikoz. Saat 4'te medya saklamak ° C.
  10. Sitozin Beta-D-Arabino Furanoside
    1. 48 mg sitozin beta-D-arabino furanoside 10 ml 20 mM bir hisse senedi konsantrasyon için büyüme ortamının dağıtılması. Depolama çözümü -20 ° c
  11. Poli-D-lizin
    1. 2 mg/mL Poli D-lizin stok oluşturmak için 10 mL steril H 2 O 20 mg Poli D-lizin ekleyin. Hisse senedi Poli D-lizin-80 ° c 100 µL aliquots içinde depolanması gereken.
  12. Not: aşağıdaki çözümleri diseksiyon önce hazırlanan ve kadar kullanmak 4 ° C'de tutulan.
  13. MgSO 4 Supplemented diseksiyon çözüm
    1. ekleyin 300 µL hisse senedi MgSO 4 diseksiyon çözüm 250 ml.
  14. Tripsin diseksiyon çözüm
    1. hisse senedi tripsin ve hisse senedi MgSO 4 10 mL diseksiyon çözeltisi için 12 µL eklemek 100 µL.
  15. Tripsin inhibitörü çözüm 1
    1. ekleyin 164 µL hisse senedi tripsin inhibitörü, 250 µL stokunun Dnaz 1 ve stok MgSO 4 10 mL diseksiyon çözeltisi için 12 µL.
  16. Tripsin inhibitörü çözüm 2
    1. ekleyin 1040 µL hisse senedi tripsin inhibitörü, 750 µL stokunun Dnaz 1 ve stok MgSO4 diseksiyon çözüm 10 ml 12 µL.
  17. CaCl 2 diseksiyon çözüm takıma
    1. eklemek 10 µL hisse senedi CaCl 2 ve 25 µL hisse senedi MgSO 4 diseksiyon çözüm 10 ml.
  18. Poli D-lizin kaplı kültür yemekleri
    1. kültür yemekleri kat için hisse senedi Poli D-lizin 40 ml steril H 2 o 100 µL sulandırmak 35 mm Nunc kültür yemekleri için 2 mL sulandırılmış Poli D-lizin çözüm ekleyin. 4 de Tabaklar için her şey için seyreltilmiş Poli D-lizin 300 µL ekle.
    2. İzin alıyorum ve her yıkama önce Poli D-lizin sit 1 h için iyi 4 mL veya 600 µL (35 mm kültür yemekleri veya 4 de levhalar, sırasıyla için) steril H 2 O. O zaman H 2 O Aspire edin ve 1 h için Kuru yemekler hava girsin

2. Çıkarma ve yalıtım beyincik beyin

  1. Decapitate 6-7 günde eski fare yavru işten çıkarma makas kullanarak. Beyin diseksiyon steril doku kültürü mahallede gerçekleştirmek.
  2. Beyin kaldırmak için forseps bir çift kullanarak başından kavramak ve deri ön şekil 1 ' de gösterildiği gibi mikrodiseksiyon makas kullanarak baş doğru kesti. Sonra bulaşma riskini en aza indirmek için yeni bir çift makas kullanarak kafatası kemik ile kesti. Forseps kullanarak beyin kapsayan kafatasını ve forseps veya bir spatula kullanarak beyin tease.
    1. Gerektiği gibi bir bütün olarak beyin çıkmasını kolaylaştırmak için optik sinir kesti.
  3. MgSO 4 ile desteklenmiş diseksiyon çözüm beyin yerleştirin. Çözüm ve beyin buz üzerinde tutmak
  4. Şu beyin kaldırma, diseksiyon mikroskop altında beyin MgSO takıma 4 diseksiyon çözüm hala süre beyincik dışarı teşrih ve iyi forseps kullanarak meninkslerde kaldırmak. Ventral yan için beyincik açmak ve choroid plexus kaldırılması sigorta.
  5. ~ 1 mL MgSO takıma 4 diseksiyon çözeltisi içeren bir 35 mm çanak içine cerebella havuz.
  6. Doku küçük parçalar halinde doğrayın ve 30 mL MgSO arabelleğe alınmış 4 diseksiyon çözeltisi içeren bir 50 mL tüp içine transfer.

3. Fare serebellar granül nöron yalıtım ve Culturing

  1. 644 g x ve 4 5 min için kıyılmış beyin dokusu içeren 50 mL tüp santrifüj kapasitesi ° C.
  2. Süpernatant kaldırın ve 10 mL tripsin diseksiyon çözeltisi ekleyin. Sonra 15 dk 37 için yüksek hızda tüp sallamak ° C.
  3. Tripsin inhibitörü çözüm 1 tüp ve rock 2 dakika süreyle yavaşça ekleyin 10 mL
  4. Tüp 644 g x ve 4 5 dk santrifüj kapasitesi ° C.
  5. Süpernatant kaldırmak ve 2 mL ekleyin Tripsin inhibitörü çözüm 2 ve 15 mL tüp sonra transfer.
    6. Çözüm karanlık olana kadar
  6. 15 mL tüp dokuda triturate. O zaman için 5 dk. yerleşmek izin
  7. Net süpernatant kaldırmak ve süpernatant 1 mL CaCl takıma 2 diseksiyon çözeltisi içeren yeni bir tüp transfer.
  8. Başka bir mL tripsin inhibitörü çözüm 2 adım 3.6 Pelet içeren tüp altına ekleyin. Tekrar triturate ve 5 dk. süpernatant kaldırmak ve süpernatant adım 3.7 (Bu adımları 3.6-3.7 tekrarı) içeren tüp eklemek için yerleşmek izin. Dokusunun en mekanik ayrışmış kadar bu işlemi yineleyin.
  9. Ekle CaCl 2 0.3 mL takıma koleksiyonuna süpernatant her mL için süpernatant diseksiyon çözüm.
  10. Tüp içeriğini karıştırmak ve 644 x g., 5 min için santrifüj kapasitesi
  11. Süpernatant kaldırmak ve 10 mL taze medya için Pelet ekleyip karıştırın.
  12. Hücreler o zaman sayılır ve 1.5 x 10 6 hücre/mL konsantrasyonu seyreltilmiş. Genel olarak 10 milyon hücre--dan her disseke beyin, trypsinization zaman ve diseksiyon verimliliğini bağımlı bekleniyor olduğunu unutmayın. Hücreleri daha önce yapılan Poli D-lizin plakalar üzerinde plaka. 4-şey plakalar için iyi başına 10 5 hücre x 7,5 vererek 0.5 mL, plaka. 35-mm yemekleri için plaka başına 6 x 10 6 hücre veren 4 mL, plaka.
  13. Sonra 24 h, gliyal kirliliği azaltmak için tabak sitozin-β-arabino furanoside (araç) ekleyin. Beher ml'de medya için 20 mm araç 0.5 µL gereklidir. Araç eklenmesi bir medya değişiklik gerektirmez. 7-8 gün boyunca devam etmesine hücreler varsa, bu tedavi günde 3 yineleyin.
  14. 37 ° C'de % 5 CO 2 kuluçka kültürleri korumak ve kültür ortamının her 2 mL için 2 günde 5 gündür eklenen 100 mM glikoz 100 µL ile beslemek. Tam ortam değişikliği gerekli değildir.

4. Lentivirus ambalaj, arıtma ve titrasyon

Not: Ambalaj, toplama, arıtma ve lentivirus titrasyon için protokol daha önce ayrıntılı bir kit kullanımı olmadan tarif edilmiştir 28, titrasyon, Akış Sitometresi 29 gibi için alternatif yöntemler de dahil olmak üzere. Burada kısa bir süre bizim laboratuarımızda nöronal yaralanma hızlı virüs arıtma çözümü ve qPCR lentiviral titrasyon seti kullanarak çalışmaya lentivirus üretimi için kullanılan iletişim kuralı mevcut.

  1. 10 cm kültür yemekleri Dulbecco ile plaka Hek293T hücrelerde ' s modifiye kartal ' % 10 ile desteklenmiş s en az gerekli orta (DMEM) FBS. Yüksek viral titresi elde etmek için en az 5 tabak her transfection için Hek293T hücrelerin büyümek. % 70 birleşmesi olduğundan transfection hücreleri gününde emin olun. Üç saat transfection önce medya değiştirmek.
  2. Her transfection için iki tüp hazırlayın. Tüpe 1 1,5 mL serum MEM azaltılmış medya ve transfection reaktif, 41 µL mix de ekleyin. 2 tüpte 1,5 mL serum MEM azaltılmış medya ve transfer plazmid 6 µg, pCMV-dR8.2 vektör (ambalaj plazmid) 6 µg, 3 µg pCMV-VSV-G vektör (zarf plazmid) ve 35 µL p3000 artırıcı reaktif (lipofectamine ile birlikte) ekleyin. Mix iyi ve birleştirme tüpler 1 ve 2, girdap ve 15 dk. için kuluçkaya
  3. Medya % 50'si Hek293T plakalar kaldırmak ve DNA-lipid kompleksleri hücrelere ekleme. 6 h 37 ° c, % 5 CO 2 için kuluçkaya. Medyayı çıkarın ve taze DMEM 5 mL ile değiştirin, gecede kuluçkaya.
  4. , 24 s sonrası transfection, viral süpernatant ilk toplu her tabaktan toplamak. Viral medya 4 ° C'de tutmak ve taze medya 5 mL Hek293T hücreleri her plaka ekleyin. Gecede kuluçkaya.
  5. 48 saat sonrası transfection, viral süpernatant ikinci parti toplamak, o ilk toplu iş ile birleşmek ve kombine viral süpernatant 600 x g., 10 dk santrifüj kapasitesi
  6. 45 µm gözenek boyutu olan bir filtre aracılığıyla süpernatant filtre.
  7. Hızlı virüs arıtma çözüm kullanarak virüs arındırmak. Her 45 mL için viral süpernatant, 5 mL lentiviral bağlama çözüm, mix ve santrifüj 10 min için de ekleyin > 5000 x g ve 4 ° C.
  8. Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın Pelet rahatsız etmek.
  9. 20-40 µL orta ekleyin ve Pelet yeniden askıya alma. Aliquot ve-80 mağazasında ° C.
  10. Bir qPCR lentiviral titrasyon kiti lentiviral titresi elde etmek için kullanılır. PBS 500 µL arıtılmış şunun 2 µL sulandırmak. 2 µL seyreltilmiş virüs virüs lizis arabelleği (kit ile sağlanan) 18 µL ekleyin.
  11. Set üç farklı RT-q-PCR reaksiyonları içinde triplicates ve etiket olarak, viral lysate, pozitif kontrol 1 (STD1) ve olumlu denetim 2 (STD2). Her reaksiyon için eklemek, 2 x qPCR MasterMix, ya 2.5 µL 12.5 µL viral lysate veya STD1 (kit ile sağlanan) veya STD2 (kit ile sağlanan) ve reaktif (kit ile sağlanan) Mix-0.2 mL PCR tüpleri içinde 10 µL.
  12. PCR programı aşağıdaki gibi ayarlayın: ters transkripsiyon, enzim aktivasyonu, 15 40 döngüleri için 95 ° C'de 10 dakika için 42 ° C'de 20 dk s 95 ° c denatürasyon ve tavlama/uzatma için 60 ° C'de 1 dak.
  13. Hesaplamak bu formülü kullanarak viral titresi:
    Titresi, viral lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = ortalama Ct değeri bilinmeyen örnek, Ct1 STD1, Ct2 ortalama değeri = STD2 ortalama değeri =.
    Not: CGNs olmak en iyi lentiviruses ile transduced veya yaralanma okudu moduna bağlı olarak adenovirüse bakın ile enfekte. Lentiviruses 2-3 hücre kültür çözümü için bir MOI, eklenmesi kaplama zamanda NMDA indüklenen kültür 7 gün sinyalizasyon incelemek için kullanılır. Bu % 80'den fazla sonuç iletim ve bu nöronların ( Şekil 2) biyokimyasal analizler ile sürdürmeye uygundur. Adenovirüse bakın eklenmesi, kültür (at MOI 50) ve gün 7-8'de sinyal indüklenen NMDA eğitim 5 gün görüntüleme gibi diğer teknikleri kullanılır. Bu tedavi daha az % 10'luk sonuçları enfeksiyon nöronların, görüntüleme ve proteinlerin co yerelleştirme için idealdir. Adenovirüse bakın kaplama anda DNA hasarı indüklenen hücre ölümü incelemek için buna ek olarak camptothecin gün 2-3 veya oksidatif stres tarafından hidrojen peroksit eklenmesi tarafından kullanılabilir. Floresans proteinler (GFP, RFP, CFP veya YFP) varlığı için faiz gen öğesini yüzde iletim ve potansiyel toksisitesi tahmin etmek için kullanılabilir. Önerilen MOI ile gördüğümüz en az toksisite ve maksimum iletim ( şekil 3).

5. Nöronal yaralanma modelleme

    NMDA ikna etmek için
  1. indüklenen nöronal excitotoxicity, 7 gün vitro takip, 1 h. değiştirmek için tüm Orta hiçbir paralel kültürlerden şartına orta ile CGNs 100 µM NMDA ve 10 µM glisin ile tedavi tedavi. Bu konsantrasyonu % 50 hücre ölümüne 24 saat sonrası tedavi ( şekil 3 c) sonuçlanır. 6-8 h post tedavisi (bkz: Jahani-Asl vd. mitokondrial parçalanma belirgindir 26 , 27).
  2. ROS indüklenen hücre ölümü (oksidatif stres) ikna etmek için nörolojik tedaviNS 75-100 µM hidrojen peroksit (H 2 O 2) ve geçiş ile paralel kültürlerden H 2 O 2 5 dk maruz aşağıdaki medya şartına. Dikkat, H 2 O 2, istikrarsızlık nedeniyle en iyi duruma getirme konsantrasyonu % 50-70 hücre ölümü tedavinin 24 saat takip kültür indükler bir düzeye.
    3. DNA ikna etmek için
  3. zarar indüklenen hücre ölümü, CGNs 10 µM camptothecin ile tedavi. Bu konsantrasyon 24 h mitokondrial parçalanma % 50 hücre ölümü daha fazla neden olmaktadır ve erken apoptotik sinyal ilavesi bu konsantrasyon (bkz: Jahani-Asl vd., camptothecin sonra 2-3 h oluşur 18)
  4. düşük K + indüklenen nöronal apoptoz CGNs içinde ikna etmek için 25 7 gün vitro takip mM K + 5 mM K ile düşük potasyum medya + için içeren medya değiştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dikkatli diseksiyon ile olduğu gibi beyin en az hasarla şekil 1A-Bgörüldüğü gibi çıkarılmalıdır. Çaba temizleme sırasında beyin hasarı en aza indirmek, özellikle için beyincik zarar için alınmalıdır. Beyincik zarar daha zor kimlik ve meninkslerde tamamen kaldırılması için yapar ve nöronal kültür bulaşma olasılığını artırır. Bir kez meninkslerde çıkarmak, beyincik şekil 1 c içinde görüldüğü gibi kalan dokudan disseke ve ayrılma için hazır.

Önce kaplama, CGNs lentivirus ile transduced veya Şekil 2' de açıklandığı gibi adenovirus ile enfekte. Kaplama gün lentivirus (şekil 3) için maksimum verimlilik ve adenovirus enfeksiyonu için MOI 50 ile en az toksisite ve 2-3 bir MOI bulmak.

Transduced sağlıklı CGN kültürler 7 DIV, şekil 3Aiçinde sunulmaktadır. Glia çok sayıda kültüründe mevcut kalırsa, saf nöronal nüfus sağlamak için araç konsantrasyonu artırılabilir. Ayrıca gliyal hücreler bu virüsü sinir hücreleri daha kolay al ve bu transductions 5 gün gerçekleştirilmesi durumunda kritik hale gelir. Şekil 3 ciçinde görüldüğü gibi hücre ölümü gören nöronların varlığı pyknotic çekirdek oluşumu ile tespit edilebilir. Tüm konsantrasyonlarda NMDA H2O2ve Camptothecin % 50 hücre ölümüne 24 saat sonra ikna etmek için optimize edilmiştir. Bu nöronal kaybı mitokondrial parçalanma gibi koyun diğer erken olayları çalışmak için sağlar.

Figure 1
Şekil 1: fare beyin ve beyincik diseksiyon. (Bir çift forseps kullanarak bir 6-7 gün eski fare beyni ayıklamak, başından kavramak ve mikrodiseksiyon makas kullanarak noktalı çizgiler boyunca anteriorly deriyi kesmeA). Sadece cilt ve bağ dokusu kesmeye dikkat et, çok derin bir kesik kestiği kafatası ve beyin zarar. Bu üç kesik, orta hat ve iki yanal, eğri boyunca düz basılması cilt için izin kafatası açığa geri. Bir kez maruz, kafatası olabilir makas ucu ile nüfuz ve anteriorly kesti. Büyük kimlik ve meninkslerde kaldırılmasını kolaylaştırmak için beyincik zarar vermemeye özen göstermelidir. Bir kez kesmek, forseps geri sonra teased olabilir beyin forseps veya spatula bir çift kullanarak serin diseksiyon çözümde açığa kafatası, soyma için kullanılabilir. Beyin kaldırmak için optik sinir kopmuş gerekebilir. (B) bir kez kafatasından çıkarmak, ince uçlu forseps bir çift kullanarak beyincik meninkslerde kaldırılmalıdır. İnce uçlu forseps, beyincik çifti kalan dokudan disseke ve meninkslerde tümüyle kaldırılmasını sağlamak için teftiş (C) kullanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: serebellar granül nöronlar nöronal yaralanma modelleme. 6-7 fare aşağıdaki yordamı tek hücrelere ayrışmış günden itibaren izole cerebella Bölüm 3 sundu. Ayrılma, hücreler dikkate alınır ve 1.5 x 106 cells/mL.For oluşturmak için kültür ortamının birimindeki 35 mm yemekler resuspended, 4 mL plaka başına 6 x 106 hücre veren kaplama. Slayt görüntüleme için 0.5 mL, 7.5 x 105 hücreleri/iyi veren kaplama. CGNs lentivirus ile transduced veya adenovirus ile enfekte. Adenovirus (0 gün vitro (DIV)) verir % 90 transfection verimliliği büyük kaplama gün kullanılması ve oksidatif stres ve DNA hasarı nöronal yaralanma incelenmesi için izin verir. 75-100 µM hidrojen peroksit (H2O2) oksidatif stres neden iken 10 µM camptothecin (CPT) yanı sıra DNA hasarı, neden. H2O2 konsantrasyonu % 50 hücre ölümüne 24 saat sonra ikna etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Adenovirüse bakın, 5 DIV ile bulaşmasını az % 10 daha düşük bir iletim verimliliği sağlar. Ne zaman NMDA reseptörleri kültüründe, zenginleştirilmiş 7 DIV nöronlar 100 µM NMDA ve excitotoxicity ikna etmek için 10 µM glisin ile tedavi edilebilir. Bu sonraki analiz görüntüleme veya tek bir nöron izleme için idealdir. Son olarak, 0 DIV, 100 µM NMDA ve 10 µM glycine adlı 7 DIV ile tedavisi ile takip, lentivirus ile transducing yeterince yüksek iletim verimliliği verir (> % 80) sıralama, inceleyerek ChIP dahil olmak üzere kültür biyokimyasal analiz için izin vermek için protein ifade ve canlı/ölü deneyleri gerçekleştirme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: serebellar granül nöronlar. (A)nöronlar kaplama, zamanda bir MOI 3, RFP için lentiviruses ile transduced ve sabit ve 7 gün içinde vitro lekeli. Colocalization RFP sinyal, MAP2 ve Höchst tam olarak lentiviruses tarafından transduced sağlıklı sinir hücreleri göstermek için gösterilir. (B) görüntüleri canlı ölü tahlil analiz toksisite ölçmek için farklı MOI ile enfekte nöronlar temsil eder. Adenovirus LacZ 25 ile 50 arasında bir MOI, ifade ile enfekte CGNs maksimal verim için en az toksisite koruyarak sağlar. Denetimine göre hücre sağkalım % 1 farklılığı bu MOI hastalık görülür daha az. (C) Höchst kontrol CGNs ve CGNs boyama tedavi NMDA ile hücre ölümü ikna etmek için. Pyknotic çekirdeği NMDA tedavi ile oluşumu unutmayın. Bu hücre ölümü göstergesidir ve kültür 24 h 100 µM NMDA ile tedavi sonrası ve 10 µM yaklaşık % 50 görülebilir glisin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada biz birincil fare serebellar granül nöronlar (CGNs), kar ve zarar işlevi çalışmalar Kültür ve hücre ölümü farklı mekanizmaları modelleme için basit bir yöntem sağlar. Çeşitli faktörler yakın izleme gerektiren bu yordamı kullanarak sonuçları tekrarlanabilirlik etkiler. Bu kültür, kültür, izdiham gliyal hücrelerini ortadan kaldırılması da dahil olmak üzere ve sağlıklı hücrelerin Bakımı kültür saflığı içerir. Bu faktörler değişkenlik tanıtan sonuçları önyargı ve tekrarlanabilirlik meydan. Aşağıda olumsuz sonuçları etkileyen faktörleri en aza indirmek nasıl açıklar.

CGNs kültür gliyal hücrelerini ortadan kaldırmak ve saf nöronal Vaha'da kurmak için sitozin-β-arabino furanoside (araç), DNA sentezi engelleyerek Proliferasyona hücrelerini öldürür pirimidin antimetabolite 10 µM kullanın. Eğer hala gliyal hücreler mevcut nüfusu, araç konsantrasyon için 15 µM artırılabilir. Bu da çok bağımlı olduğunu. Buna ek olarak, 7-8 güne kadar sürdürülür kültürler için ikinci bir araç tedavi 3 günde gerçekleştirilebilir. Saf nöronal Vaha'da elde edilir ve hücre ölümü önlemek için doku trypsinization tarafından takip parçalara kesme önce beyincik kapalı tüm meninkslerde soymak önemlidir. Zaman (7-10 min serebellum başına daha uzun olmayan) makul kısa bir süre içinde yapılması gerekir. Meninkslerde nöronal kültür varlığı sağlıksız kültür ve sonunda hücre ölümü ile sonuçlanır. Ölüm nöronların önce tedavi neden olabilir başka bir faktör trypsinization zamanı geldi. Bu hücreler aşırı trypsinized değildir önemlidir. Öte yandan, trypsinization altında daha fazla mekanik ayrışma onlara zarar ya da düşük bir verim neden hücre gerektirir. Bu nedenle, en iyi duruma getirme trypsinization zaman gerektirir ve çok bağımlı.

Dikkate alınması gereken sonraki hücreleri izdiham kullanım zaman faktördür. Farklı confluency değişkenlik sonuçlar oluşturabilir. Bu deneylerde okuma bağlı olarak özellikle önemlidir. Bir düşük izdiham durumuyla nöronlar 2-3 gün sonra yığın başlar. Nöronlar çok düşük veya çok yüksek izdiham durumunu sinyalizasyon bozar. Doğru kaplama için canlı hücreleri saymak önemlidir.

Diğer yöntemler CGN kültürlerin tarif var, özellikle temel kodlamayla yordamlar bakarak bir Papain ayrılma sistemi kullanarak kit 30 de kadar sonrası kodlamayla yordamlar ve CGN manipülasyon nöronal göç çalışma için ve Morfoloji 31. Lee ve ark. tarafından sunulan Protokolü Papain ayrılma sistemi kiti kullanımını açıklar. Onlar izole CGNs saflığı artırmak için kullanabileceğiniz iki yöntem tavsiye: hücreleri Percoll degrade ayırma ile çalışan yanı sıra 20 dk için Poli-D-lizin tabakta Pre-Kaplama. CGNs ayrılması gliyal kirleticiler içinde yardım etmek için her iki yöntem vardır. Bu araç yalnız ile tedavi için saf nöronal kültürü zenginleştirmek için yeterli değil önerilir. Bu Nöronal Farklılaşma incelenmesi için etkili bir model hizmet vermektedir Ayrıca, Lee 4-6 gün eski fare pups, kullanır; CGNs 6-7 gün eski fare pups kullanarak nöronal yaralanma çalışma için daha uygun olduğunu bulmak. Holubowska ve ark. Kalsiyum fosfat yöntemi vitro ve elektroporasyon içinde vivokullanarak sonrası Mitotik serebellar nöronların transfection için bir protokol sunar. Bunlar tek bir nöron izlenebilmektedir nöronların genetik manipülasyon için mükemmel yöntemlerdir. Kalsiyum fosfat yöntemini kullanarak transfection verimliliği 0.1-5 dan değişebilir %. Bu nedenle, ChIP-Seq analizleri, Co-immunoprecipitation ve immunoblotting gibi biyokimyasal analizler için lentiviruses kullanımı % 80'den fazla sonuç daha uygun bulabilirsiniz kaplama anda transduced zaman hedefidirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada tarafından desteklenir ve Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri AJ-A. için verir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Tags

Neuroscience sayı: 129 beyincik serebellar granül nöronlar (CGN) Adenovirus Lentiviral iletim Excitotoxicity N-metil-D-Aspartat (NMDA) Apoptozis Potasyum klorür (KCl) Camptothecin hidrojen peroksit (H2O2)
Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., … More

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter