Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Denne protokollen beskriver en enkel metode for å isolere og dyrking hovedknappen på musen cerebral granule neurons (CGNs) fra 6-7 dag gammel pups, effektiv Albin på CGNs for tap og gevinst på funksjon studier, og modellering NMDA-indusert neuronal excitotoxicity, lav-kalium-indusert celledød, DNA-skader og oksidativt stress ved hjelp av samme kultur-modellen.

Abstract

Lillehjernen granule neurons (CGNs) er en vanlig neuronal modell, danner en rikelig homogen befolkning i lillehjernen. I lys av deres postnatal utvikling, overflod og tilgjengelighet er CGNs en ideell modell å studere neuronal prosesser, inkludert neuronal utvikling, neuronal migrasjon og fysiologiske neuronal aktivitet stimulering. I tillegg gir CGN kulturer en utmerket modell for å studere forskjellige moduser inkluderer excitotoxicity og apoptose-programmert celledød. Innen en uke i kultur uttrykke CGNs N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptorer, en bestemt ionotropic glutamat reseptor med mange viktige funksjoner i nevrale helse og sykdom. Tillegg av lave konsentrasjoner av NMDA sammen med membran depolarization gnager primære CGN kulturer har blitt brukt til å modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulering mens tillegg av NMDA kan brukes til å modellere excitotoxic neuronal skade. Her, er en metode for isolasjon og dyrking av CGNs fra 6 dagers gammel pups samt genetisk manipulering av CGNs av adenoviruses og lentiviruses beskrevet. Vi også tilstede optimalisert protokoller på hvordan å stimulere NMDA-indusert excitotoxicity, lav-kalium-indusert apoptose, oksidativt stress og DNA skade etter signaltransduksjon disse neurons.

Introduction

Lillehjernen granule neurons (CGNs) blir godt preget på kultur og har fungert som en effektiv modell neuronal død og utvikling 1,2,3,4,5, 6. tidlig uttrykk for N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptorer i CGN kulturer i vitro gjør dem en attraktiv modell å studere NMDA-indusert signalisere. Aktivering av disse reseptorene med NMDA sammen med membran depolarization brukes til å modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulering, og har tillatt for forskning i mekanismer for synaptiske plastisitet 7,8. Tvert imot, kan over stimulering av disse reseptorene av NMDA ligand brukes til å modellere excitotoxicity, en viktig mekanisme for neuronal tap i akutt hjerneskade og nevrodegenerative sykdommer 9. En mekanisme for induksjon av excitotoxicity er gjennom ATP sult med redusert oksygen, sett med akutt neuronal skade. Dette resulterer i membran depolarization og forhøyede nivåer av glutamat slipp på synapse. Den påfølgende overstimulering av NMDA reseptor av opphøyet glutamat resultater i overdreven Ca2 + tilstrømningen via disse reseptorene, som igjen aktiverer flere veier inkludert Ca2 +-aktivert proteaser, phospholipases, og endonucleases, som resulterer i ukontrollert nedbrytning av kritiske cellulære komponenter og celledød. I tillegg fører høy intracellulær Ca2 + til generering av oksygen frie radikaler og mitokondrie skade 10,11.

Mens flertallet av neuronal tap etter NMDA-indusert neuronal excitotoxicity av kalsium tilstrømningen og er Bax/Bak uavhengige, kan ikke andre mekanismer av celledød ekskluderes fra denne modellen. Utseendet på begge necrotic og apoptotisk som celledød på grunn av excitotoxicity er delvis på grunn av generasjonen av reaktive oksygen arter (ROS) og DNA skade forårsaket avhøye intracellulær Ca 2 + nivåer 12. DNA skade resulterer i neuronal døden gjennom apoptotisk mekanismer å være korrelert med kjennetegner apoptotisk celledød, som chromatin massene og apoptotisk organer. Induksjon av apoptose er formidlet gjennom utgivelsen av cytochrome c fra mitokondrier og har vist seg å være avhengig av Bax/Bak oligomerization 13. Bax/Bak oligomerization fremmer pore formasjon i den ytre mitokondrie membranen, som resulterer i cytochrome c utgivelsen og aktivering av pro-apoptotisk regulatorer sett med mild iskemiske skader 14.

Generasjon av ROS er et betydelig problem i hjernen som følge av lav endogene antioksidanter, kombinert med store oksygen kravet for neuronal fungerende 15. Når utsatt for iskemiske hendelse, er nitrogenoksid syntase upregulated, produsere nitrogenoksid og øke reaktive oksygen arter 14. Økt konsentrasjonen av oksygen radikaler kan resultere i DNA skader og indirekte føre energi sult. Høye nivåer av DNA double-strandet bryter er avhjulpet av aktivering av poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), en eukaryote chromatin-bundet protein ansvarlig for katalyserende overføring av ADP-ribose enheter fra NAD+, en prosess integrert DNA-reparasjon 16. Men med overdreven skade forårsaket av oksidativt stress, kan PARP-1 aktivisering forårsake energi sult på grunn av økt avløpet på NAD+, en nødvendig substrat for ATP produksjonen gjennom oxidative fosforylering. Til slutt, oksidativt stress vil utløse apoptose på en Bax/Bak avhengig måte fører til mitokondrie cytochrome c utgivelsen, og har vist seg å indusere mitokondrie ombygging i CGNs 17.

Endelig, endringer i konsentrasjon av kalium klorid (KCl) i CGN kulturer kan brukes til å modellere lavt kalium/depolarization mediert apoptose 18,19,20. Når de utsettes for lave nivåer av K+, gjennomgå CGNs distinkte fysiologisk endringer, som resulterer i reduksjon av både mitokondrie åndedrett og Glykolysen, tilskrevet redusert mobilnettet etterspørsel 21, samt reduksjon i nivåene av kjernefysiske faktor-κB (NFκB) som regulerer aktiviteter inkludert betennelse og synaptic overføring 22. Denne modellen er av spesiell interesse for studiet av celledød under neuronal utvikling. Lav K+ miljøet nærmere ligner fysiologiske forhold, og fører kjennetegner celledød under neuronal utvikling 23.

Oppsummert gir CGNs en langvarig modell for å undersøke de underliggende molekylære mekanismene neuronal død og degenerasjon. Følgende protokollen tillater isolasjon og dyrking av CGNs, uttrykk eller undertrykkelse av en bestemt genetiske veien med virus og induksjon av neuronal død via ulike mekanismer som representerer neuronal skade og degenerasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

denne protokollen er basert på modifikasjoner av prosedyrene som er beskrevet tidligere 18 , 24 , 25 , 26 , 27. denne protokollen er godkjent av dyr omsorg komiteen ved McGill University.

1. eksperimentelle forberedelse

Merk: følgende lager løsninger kan være forberedt og vedlikeholdes til bruk.

  1. Disseksjon løsning
    1. oppløsning 3.62 g av natriumklorid (NaCl), 0.2 g kalium klorid (KCl), 0.069 g av natrium fosfat (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O), og 1.306 g av D-(+)-glukose i 500 mL destillert H 2 O. Deretter legge til 12,5 mL HEPES Buffer, 450 µL av fenol rød løsning og 20 mL BSA brøkdel V løsningen. Justere pH 7.4 bruker 1 N natriumhydroksid (NaOH).
    2. Sterilize 0.22 µm filter og butikk på 4 ° C. Denne løsningen vil forbli stabil i opptil en uke til 10 dager.
  2. Trypsin
    1. forberede en lagerløsning i en konsentrasjon av 25 g/L av trypsin i 0,9% natriumklorid. Lagre løsningen på -20 ° C.
  3. Trypsin hemmer
    1. forberede en aksje med en konsentrasjon av 10 mg/mL av oppløsende 1 g av kylling egg hvit trypsin inhibitor i 100 mL 1 mM HCl. Store denne løsningen på -20 ° C.
  4. DNase
    1. oppløse 100 mg av DNase 1 i 10 mL av sterilt vann til å generere en 10 mg/mL lager. Lagre løsningen på -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. legge til 6.02 g magnesium sulfat (MgSO 4) 50 mL destillert vann (H 2 O) til å generere en 1 M lager. Lagre løsningen på 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. oppløse 0.735 g veisalt (CaCl 2 ∙ 2t 2 O) i 50 mL destillert H 2 O å en lager konsentrasjon av 100 mM. Lagre løsning på 4 ° C.
  7. KCl
    1. oppløse 3.7275 g KCl i 50 mL destillert H 2 O å en lager konsentrasjon av 1 M. Store løsning på 4 ° C.
  8. D-(+)-glukose
    1. oppløse 1.802 g D-(+)-glukose i 50 mL destillert H 2 O å en lager konsentrasjon av 100 mM. Lagre løsning på 4 ° C.
  9. Celle kultur medier
    1. forberede celle kultur medier som følger: 5 mL av varme inaktivert dialyzed fosterets Bovine Serum, 500 µL 200 mm L-glutamin, 100 µL av 50 mg/mL Gentamycin og 1 mL 1,0 M KCL bør legges til 45 mL filter sterilisert Eagle ' s minimal viktige medier (E-MEM) som er supplert med 1.125 g/L D-glukose å generere 50 mL av lillehjernen granule Nevron kultur medier. Lagre media på 4 ° C.
  10. Cytosine Beta-D-Arabino Furanoside
    1. oppløse 48 mg cytosine beta-D-arabino furanoside i 10 mL vekst medier å en lager konsentrasjon av 20 mM. Lagre løsning på -20 ° C.
  11. Poly-D-Lysine
    1. vil generere en 2 mg/mL poly D-lysine lager, legge 10 mL steril H 2 O til 20 mg av poly D-lysine. Lager poly D-lysine bør lagres på-80 ° C i 100 µL dele.
  12. Merk: følgende løsninger skal være forberedt før disseksjon og opprettholdt på 4 ° C før bruk.
  13. MgSO 4 Supplemented disseksjon løsning
    1. legger 300 µL av lager MgSO 4 til 250 mL disseksjon løsning.
  14. Trypsin disseksjon løsning
    1. legge 100 µL av lager trypsin og 12 µL av lager MgSO 4 til 10 mL disseksjon løsning.
  15. Trypsin Inhibitor løsning 1
    1. legge 164 µL av lager trypsin hemmer, 250 µL av lager DNase 1 og 12 µL av lager MgSO 4 til 10 mL disseksjon løsning.
  16. Trypsin Inhibitor løsning 2
    1. legge 1040 µL av lager trypsin hemmer, 750 µL av lager DNase 1 og 12 µL av lager MgSO4 til 10 mL disseksjon løsning.
  17. CaCl 2 supplert disseksjon løsning
    1. legge 10 µL av lager CaCl 2 og 25 µL av lager MgSO 4 til 10 mL disseksjon løsning.
  18. Poly D-Lysine belagt kultur retter
    1. for å coat kultur retter, fortynne 100 µL av lager poly D-lysin i 40 mL steril H 2 O. For 35 mm Nunc kultur retter, legge 2 mL utvannet poly D-Lysine løsning. For 4 vel plater, legge 300 µL av utvannet poly D-lysin i hver brønn.
    2. La poly D-lysine sit 1t før aspirating og vaske hver godt med 4 mL eller 600 µL (for 35 mm kultur retter eller 4 plater Vel, henholdsvis) av sterile H 2 O. Deretter Sug opp den H 2 O og la retter luften tørr for 1 h.

2. Hjernen utvinning og isolasjon av lillehjernen

  1. Decapitate en 6-7 dag gamle musen pup med halshogging saks. Utføre Disseksjon av hjernen i sterilt vev kultur hette.
  2. For å fjerne hjernen, ta tak i hodet med en tang og skjære gjennom huden mot det fremre hodet med microdissection saks som vist i figur 1. Deretter skjære gjennom hodeskallen bein med en ny saks for å minimere risiko for kontaminering. Fjerne skallen dekker hjernen ved hjelp av pinsett og tease ut hjernen ved hjelp av Tang eller spatula.
    1. Etter behov, skjære gjennom den optiske nerven til rette for å få hjernen ut som helhet.
  3. Sette hjernen i disseksjon løsningen som er supplert med MgSO 4. Holde løsningen og hjernen på ice.
  4. Følgende hjernen fjerning, under disseksjon mikroskop, dissekere ut lillehjernen fra hjernen samtidig i MgSO 4 supplert disseksjon løsning og fjerne meninges med fine tang. Slå lillehjernen sin ventral side og sørge for fjerning av choroid plexus.
  5. Pool av cerebella i en 35 mm fat som inneholder ~ 1 mL MgSO 4 supplert disseksjon løsning.
  6. Hogge vevet i små biter og overføre til en 50 mL tube inneholder 30 mL av MgSO 4 bufret disseksjon løsning.

3. Musen lillehjernen Granule Nevron isolasjon og Culturing

  1. sentrifuge 50 mL tube med hakket cerebral vevet i 5 min på 644 x g og 4 ° C.
  2. Fjern nedbryting og tilsett 10 mL av trypsin disseksjon løsning. Deretter riste røret i høy hastighet i 15 min på 37 ° C.
  3. Legge til 10 mL trypsin inhibitor løsning 1 til rør og rock forsiktig i 2 min.
  4. Sentrifuge røret i 5 min på 644 x g og 4 ° C.
  5. Fjerner nedbryting og legger 2 mL Trypsin inhibitor løsning 2, og deretter overføre til en 15 mL tube.
  6. Triturate vev i 15 mL tube til løsningen blir grumsete. La deretter betale for 5 min.
  7. Fjerne klart nedbryting og overføre nedbryting til et nytt rør som inneholder 1 mL av CaCl 2 supplert disseksjon løsning.
  8. Legge til en annen mL trypsin inhibitor løsning 2 til bunnen av røret som inneholder pellet fra trinn 3.6. Triturate igjen og la betale for 5 min. fjerner nedbryting og legge den til røret som inneholder nedbryting fra trinn 3.7 (det er en gjentakelse av trinnene 3.6-3,7). Gjenta denne prosessen til de fleste av vev er mekanisk dissosiert.
  9. Legg til 0,3 mL CaCl 2 supplert disseksjon løsning supernatant samlingen for hver mL av nedbryting.
  10. Bland innholdet av rør og deretter virvel i 5 min på 644 x g.
  11. Fjerne nedbryting og legge 10 mL av fersk media til pellet og bland.
  12. Celler kan deretter regnet og utvannet til en konsentrasjon på 1,5 x 10 6 celler/mL. Vær oppmerksom på at generelt 10 millioner celler forventes fra hver dissekert hjernen, avhengig av trypsinization tid og effektiviteten av disseksjon. Plate celler i tidligere utført poly D-lysine plater. For 4-vel plater, plate 0,5 mL, gi 7.5 x 10 5 celler per brønn. For 35 mm retter, plate 4 mL, gir 6 x 10 6 celler per plate.
  13. Etter 24 h, legge til cytosine-β-arabino furanoside (AraC) plater å redusere glial forurensning. Hver mL av media er 0,5 µL 20 mm AraC nødvendig. Tillegg av AraC krever ikke en media-endring. Hvis cellene skal opprettholdes for 7-8 dager, gjenta denne behandlingen på dag 3.
  14. Opprettholde kulturer i en 5% CO 2 inkubator på 37 ° C og mate med 100 µL av 100 mM glukose lagt til kultur for hver 2 mL media hver 2 dager siste 5 dager. En komplett endring kreves ikke.

4. Lentivirus emballasje, rensing og titrering

Merk: protokollen for emballasje, konsentrasjon, rensing og titrering av lentivirus har tidligere blitt beskrevet i detalj uten bruk av en kit 28, inkludert alternative metoder for titrering, som flyt cytometri 29. Her presenterer vi kort protokollen som brukes i vår lab for produksjon av lentivirus for å studere neuronal skade rask virus rensing løsning og en qPCR lentiviral titrering kit.

  1. Plate Hek293T celler i 10 cm kultur retter med Dulbecco ' s endret Eagle ' s minimal viktig middels (DMEM) med 10% FBS. For å oppnå en høy viral titer, vokse minst 5 plater av Hek293T celler for hver transfection. Kontroller at ved transfection celler er 70% confluent. Endre media tre timer før transfection.
  2. For hver transfection, forberede to rør. 1 Legg i rør 1,5 mL MEM-redusert serum media og 41 µL av transfection reagens, bland godt. I rør 2, legger du til 1,5 mL MEM-redusert serum media og 6 µg av overføring plasmider, 6 µg av pCMV-dR8.2 vektor (emballasje plasmider), 3 µg pCMV-VSV-G vektor (konvolutt plasmider) og 35 µL av p3000 enhancer reagensen (følger med lipofectamine). Bland godt og kombinere rør 1 og 2, vortex og ruge i 15 min.
  3. Fjerne 50% av media fra Hek293T plater og legge til DNA-lipid komplekser i celler. Inkuber for 6 h 37 ° C, 5% CO 2. Fjerne media og erstatte med 5 mL av frisk DMEM, ruge over natten.
  4. På 24 h etter transfection, samle den første gruppen av viral nedbryting fra hver plate. Holde viral media på 4 ° C og Legg 5 mL av fersk media i hver plate av Hek293T celler. Ruge over natten.
  5. 48 timer etter transfection, samle den andre gruppen av viral nedbryting, sammen med den første gruppen og sentrifuge kombinert viral nedbryting for 10 min på 600 x g.
  6. Filtrerer nedbryting gjennom et filter med 45 µm porestørrelse.
  7. Renser viruset benytter en rask virus rensing løsning. For hver 45 mL av viral nedbryting, legge 5 mL av lentiviral forpliktende løsning, mix og sentrifuge for 10 min på > 5000 x g og 4 ° C.
  8. Fjerne nedbryting forsiktig for ikke å forstyrre pellet.
  9. Legge til 20-40 µL av medium og re suspendere pellet. Aliquot og butikk på-80 ° C.
  10. å få den lentiviral titer, en qPCR lentiviral titrering kit brukes. Fortynne 2 µL av renset virus i 500 µL av PBS. Legg 2 µL av utvannet viruset til 18 µL av virus lyseringsbuffer (følger med i pakken).
  11. Sett opp tre forskjellige RT-q-PCR reaksjoner i triplicates og merke dem som, viral lysate, positiv kontroll 1 (STD1) og positiv kontroll 2 (STD2). For hver reaksjon legge, 12.5 µL av 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µL av viral lysate eller STD1 (følger med i pakken) eller STD2 (følger med i pakken), og 10 µL av reagens-mix (forutsatt i kit) i 0,2 mL PCR rør.
  12. Sette PCR-programmet som følger: 20 min på 42 ° C i omvendt transkripsjon, 10 minutter til 95 ° C for enzym aktivisering, 40 sykluser av 15 s på 95 ° C for rødsprit og 1 min på 60 ° C for avspenning/filtypen.
  13. Beregner viral titer bruker denne formelen:
    Titer på viral lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    Ctx = Ct gjennomsnittsverdien av ukjent eksempel Ct1 = gjennomsnittlig verdi av STD1, Ct2 = gjennomsnittlig verdi av STD2.
    Merk: CGNs kan være best transduced med lentiviruses eller infisert adenoviruses avhengig av modus for skade blir studert. Tillegg av lentiviruses på en MOI 2-3 til celle kultur løsning ved plating brukes til å studere NMDA indusert signalisere på dag 7 av kulturen. Dette resulterer i mer enn 80% signaltransduksjon og er passende å forfølge med biokjemiske analyser av disse neurons ( figur 2). Tillegg av adenoviruses på dag 5 av kultur (på MOI 50) og studere NMDA indusert signalisere på dag 7-8 brukes for andre teknikker som bildebehandling. Denne behandlingen resulterer i mindre enn 10% infeksjon av neurons, gjør det ideelt for bildebehandling og co lokalisering av proteiner. Adenoviruses kan brukes ved plating for å studere DNA skade indusert celledød av tillegg av camptothecin på dag 2-3 eller Oksidativt stress ved tillegg av hydrogenperoksid. Tilstedeværelsen av fluorescens proteiner (GFP, RFP, CFP eller YFP) merket med genet av interesse kan brukes til å beregne prosent signaltransduksjon og potensielle toksisitet. Med den anbefalte MOI, ser vi minimal giftighet og maksimal signaltransduksjon ( Figur 3).

5. Modellering Neuronal skade

  1. å indusere NMDA indusert neuronal excitotoxicity, 7 dager i vitro, behandle CGNs med 100 µM NMDA og 10 µM glysin for 1 h. erstatte alle mediet med betinget medium fra parallell kulturer uten behandling. Denne konsentrasjonen resulterer i 50% celledød 24 h innlegg behandling ( Figur 3 c). Mitokondrielt fragmentering er tydelig på 6-8 h innlegg behandling (se Jahani-oh et al. 26 , 27).
  2. for å indusere ROS-indusert celledød (oksidativt stress), behandle NevroNS med 75-100 µM hydrogenperoksid (H 2 O 2) og bytte til betinget media fra parallell kulturer etter 5 min eksponering for H 2 O 2. Note, på grunn av ustabilitet i H 2 O 2, optimalisere konsentrasjonen til et nivå som induserer 50-70% celledød i kultur etter 24 h behandling.
  3. å indusere DNA skade indusert celledød, behandle CGNs med 10 µM camptothecin. Denne konsentrasjonen induserer mer enn 50% celledød i 24 h. mitokondrie fragmentering og tidlig apoptotisk signalisere oppstår 2-3 h etter tillegg av camptothecin på denne konsentrasjonen (se Jahani-oh et al. 18)
  4. for å indusere lav K + indusert neuronal apoptose i CGNs, endre mediet som inneholder 25 mM K + til lavt kalium media med 5 mM K + etter 7 dager i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med forsiktig disseksjon, bør intakt hjernen fjernes med minimal skade som vist i figur 1A-B. Innsats bør tas til minimere hjernen under fjerning, spesielt skader lillehjernen. Skade lillehjernen gjør vanskeligere identifikasjon og fullstendig fjerning av meninges, og øker sannsynligheten for forurensning av neuronal kultur. Når meninges er fjernet, kan lillehjernen dissekert fra gjenværende vevet som vist i figur 1 c og forberedte dissosiasjon.

Før plating, kan CGNs transduced med lentivirus eller infisert med adenovirus som beskrevet i figur 2. Vi finne maksimal effektivitet og minimale toksisitet med MOI 50 infisert med adenovirus, og en MOI 2-3 på dagen i plating for lentivirus (Figur 3).

Transduced sunn CGN kulturer på 7 DIV presenteres i figur 3A. Hvis et stort antall glia forblir i kultur, kan du øke konsentrasjonen av AraC for å sikre en ren neuronal befolkning. Også gliacellene ta opp viruset lettere enn nevroner og som blir kritiske hvis transductions utføres på dag 5. Tilstedeværelsen av neurons gjennomgår celledød kan vurderes ved dannelsen av pyknotic kjerner som vist i Figur 3 c. Alle konsentrasjoner av NMDA, H2O2og Camptothecin er optimalisert for å indusere celledød for 50% etter 24 timer. Dette gir studere andre tidlige hendelser som kommer foran neuronal tap som mitokondrie fragmentering.

Figure 1
Figur 1: fjerning av musen hjernen og Disseksjon av lillehjernen. (A) å trekke hjernen til en 6-7 dag gammel mus, med en tang og forstå hodet kuttet huden peke langs de prikkede linjene med en microdissection saks. Pass på å klippe bare hud og bindevev, for dypt et snitt kan punktering skallen og skade hjernen. Disse tre incisions, direkte langs midtlinjen, og to buede lateralt, tillater huden å bli skjøvet tilbake avslørende skallen. Når utsatt, kan skallen være gjennomsyret med spissen av saksen og kuttet peke. Stor forsiktighet må tas ikke å skade lillehjernen til rette for identifisering og fjerning av meninges. Når kuttet, kan tang brukes å skrelle tilbake skallen, utsette hjernen som deretter kan være teased i kule disseksjon løsning med en tang eller spatula. For å fjerne hjernen, må synsnerven fjernes. (B) når fjernet fra skallen, meninges bør fjernes fra lillehjernen med en fin tippet tang. (C) bruke et par fine tippet tang, lillehjernen er dissekert fra gjenværende vevet og kontrollert for å sikre fullstendig fjerning av meninges. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: modellering neuronal skade i lillehjernen granule neurons. Isolerte cerebella fra dag 6-7 mus er atskilt i enkeltceller følge fremgangsmåten presentert i del 3. Etter dissosiasjon, celler telles og resuspended i et volum på kultur medier å generere 1,5 x 106 cells/mL.For 35 mm retter, 4 mL er belagt, gir 6 x 106 celler per plate. For bildebehandling lysbilder, er 0,5 mL belagt, gi 7.5 x 105 celler/godt. CGNs kan deretter transduced med lentivirus eller infisert med adenovirus. Bruke adenovirus ved plating (0 dager i vitro (DIV)) gir større enn 90% hva effektivitet og muliggjør studiet av neuronal skade gjennom oksidativt stress og DNA skade. Tillegg av 10 µM camptothecin (CPT) vil indusere DNA-skader, mens 75-100 µM hydrogenperoksid (H2O2) vil indusere oksidativt stress. Konsentrasjonen av H2O2 må være optimalisert for å indusere celledød for 50% etter 24 timer. Infeksjon med adenoviruses på 5 DIV gir en lavere signaltransduksjon effektivitet på mindre enn 10%. På 7 DIV når NMDA reseptorer er beriket i kultur, kan Neurons behandles med 100 µM NMDA og 10 µM glysin å indusere excitotoxicity. Dette er ideelt for påfølgende imaging analyse eller sporing en enkelt Nevron. Til slutt, transducing med lentivirus på 0 DIV, etterfulgt av behandle med 100 µM NMDA og 10 µM glysin på 7 DIV, gir en tilstrekkelig høy signaltransduksjon effektivitet (> 80%) slik at biokjemiske analyse av kultur, inkludert ChIP sekvensering, undersøker protein uttrykk og utføre live/dead analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: lillehjernen granule neurons. (A) Neurons var transduced med lentiviruses til RFP på en MOI 3 ved plating, og fast og farget på 7 dager i vitro. Colocalization RFP signalet, MAP2 og Hoechst er vist å demonstrere sunn nevroner som er fullstendig transduced av lentiviruses. (B) bildene representerer levende døde analysen analyser av neurons infisert med ulike MOI, måle toksisitet. CGNs infisert med adenovirus uttrykke LacZ på en MOI mellom 25 og 50 gir maksimal effektivitet samtidig opprettholde minimale toksisitet. Mindre enn en 1% forskjell i cellen overlevelse sammenlignet med kontrollen vises når infisere på denne MOI. (C) Hoechst flekker kontroll CGNs og CGNs behandlet med NMDA å indusere celledød. Merk dannelsen av pyknotic kjerner med NMDA behandling. Dette antyder celledød, og kan ses i ca 50% av kultur 24 timer etter behandling med 100 µM NMDA og 10 µM Glycine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en enkel metode for dyrking av hovedknappen på musen lillehjernen granule neurons (CGNs), tap og gevinst på funksjon studier og modellering forskjellige virkningsmekanismer celledød. Flere faktorer som påvirker reproduserbarhet resultatene ved hjelp av denne prosedyren som krever tett oppfølging. Disse inkluderer renheten av kulturen inkludert eliminering av gliacellene i kultur, der kulturen, og opprettholde friske celler. Innføre variasjon i disse faktorene kan påvirke resultatene og utfordre reproduserbarhet. Nedenfor beskriver vi hvordan å minimere faktorene som negativt påvirker resultatene.

For å eliminere gliacellene fra CGNs kulturen og etablere en ren neuronal befolkning, bruker vi 10 µM av cytosine-β-arabino furanoside (AraC), en pyrimidine antimetabolite som dreper voksende celler ved å hemme DNA-syntese. Hvis det er fortsatt en befolkning på gliacellene stede, kan konsentrasjonen av AraC økes til 15 µM. Dette er også mye avhengige. I tillegg til kulturer som vedlikeholdes i opptil 7-8 dager, kan andre AraC behandling utføres på dag 3. For å få en ren neuronal befolkning og unngå celledød, er det viktig å skrelle alle meninges av lillehjernen før kutte vevet i stykker, etterfulgt av trypsinization. Dette bør gjøres på en rimelig kort tid (ikke lenger enn 7-10 min per lillehjernen). Tilstedeværelsen av meninges i neuronal kultur resultater i usunn kultur og til slutt celledød. En annen faktor som kan føre til døden av neurons før behandling er trypsinization tid. Det er viktig at celler ikke er over trypsinized. På den annen side, krever under trypsinization videre mekanisk dissosiasjon cellene som kan skade dem eller resultere i en lav avkastning. Derfor trypsinization tiden krever optimalisering og det er mye avhengige.

Den neste faktoren vurderes er der cellene ved bruk. Forskjellige confluency kan generere variasjon i resultatene. Dette er spesielt viktig avhengig av er avlesning i forsøkene. Med en lav samløpet stat starte neurons å klynge etter 2-3 dager. En for lav eller for høy samløpet tilstand av neurons svekker signalisere. Det er viktig å telle antallet lever celler for nøyaktig plating.

Andre metoder for CGN kulturer har blitt beskrevet, spesielt ser på grunnleggende dyrking prosedyrer bruker Papain dissosiasjon system kit 30 som vel som post dyrking prosedyrer og manipulering av CGN for å studere neuronal migrasjon og morfologi 31. Protokollen presentert av Lee et al. beskriver bruken av Papain dissosiasjon System Kit. De anbefaler to metoder for å øke renheten av de isolerte CGNs: kjører cellene gjennom en Percoll gradient separasjon, samt Pre-Kontaktflate på en poly-D-Lysine plate for 20 min. Begge metodene er til hjelp i separasjon av CGNs fra glial forurensninger. Dette anbefales i tilfelle behandling med AraC alene ikke er tilstrekkelig å berike for ren neuronal kultur. I tillegg bruker Lee 4-6 dag gammel mus pups, mens dette serverer en effektiv modell for å undersøke neuronal forskjell; finner vi bruker CGNs fra 6-7 dag gammel mus pups er mer hensiktsmessig for studiet av neuronal skade. Holubowska et al. presenterer en protokoll for transfection innlegg mitotisk lillehjernen neurons bruker kalsium fosfat metoden i vitro og electroporation i vivo. Dette er gode metoder for genetisk manipulasjon av neurons som en enkelt Nevron kan spores. Hva effektiviteten ved hjelp av kalsium fosfat metoden kan variere fra 0,1-5%. Derfor finner vi at for biokjemiske analyser inkludert ChIP-Seq analyser, Co-immunoprecipitation og immunoblotting, bruk av lentiviruses er mer passende som det resulterer i mer enn 80% signaltransduksjon når transduced ved plating.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada og Canadian institutter for helseforskning tilskudd til AJ-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Tags

Nevrovitenskap problemet 129 lillehjernen lillehjernen Granule Neurons (CGN) Adenovirus Lentiviral signaltransduksjon Excitotoxicity N-methyl-D-aspartate (NMDA) apoptose kalium klorid (KCl) Camptothecin Hydrogen peroxide (H2O2)
Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., … More

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter