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Neuroscience

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Abstract

Las neuronas cerebelosas del gránulo (CGNs) son un modelo neuronal comúnmente utilizado, formando una abundante población homogénea en el cerebelo. A la luz de su desarrollo post-natal, abundancia y accesibilidad, CGNs son un modelo ideal para el estudio de procesos neuronales, incluyendo el desarrollo neuronal, la migración neuronal y estimulación de la actividad neuronal fisiológico. Además, las culturas de la CGN proporcionan un excelente modelo para estudiar modos de muerte celular como excitotoxicidad y apoptosis. Dentro de una semana en cultura, CGNs expresan los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA), un receptor de glutamato ionotrópicos específicos con muchas funciones esenciales en salud neuronal y la enfermedad. La adición de bajas concentraciones de NMDA junto con despolarización de la membrana para roedores cultivos primarios de la CGN se ha utilizado para estimulación de la actividad neuronal fisiológica mientras que la adición de altas concentraciones de NMDA puede ser empleada para modelar lesión neuronal excitotóxicos. Aquí, se describen un método de aislamiento y cultivo de CGNs de cachorros 6 días de edad, así como la manipulación genética de CGNs por adenovirus y lentivirus. Tenemos también presente protocolos optimizados sobre cómo estimular la apoptosis inducida por potasio bajo, estrés oxidativo, excitotoxicidad inducida por NMDA y daño de la DNA después de la transducción de estas neuronas.

Introduction

Las neuronas cerebelosas del gránulo (CGNs) están bien caracterizadas en la cultura y han servido como un modelo eficaz para estudiar la muerte neuronal y desarrollo 1,2,3,4,5, 6. la temprana expresión de los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) en culturas CGN en vitro hace un atractivo modelo para estudiar la señalización inducida por el NMDA. Activación de estos receptores con NMDA junto con despolarización de la membrana se utiliza para modelar la estimulación fisiológica de la actividad neuronal y ha permitido para la investigación en los mecanismos de plasticidad sináptica 7,8. Por el contrario, exceso de estimulación de estos receptores por el ligando NMDA puede utilizarse para modelar la excitotoxicidad, un mecanismo importante de pérdida neuronal en aguda lesiones cerebrales y neurodegenerativas enfermedades 9. Un mecanismo para la inducción de la excitotoxicidad es a través de la inanición de ATP con oxígeno reducido, como se observa en lesión neuronal aguda. Esto se traduce en la despolarización de la membrana y liberan niveles elevados de glutamato en la sinapsis. La subsiguiente estimulación del receptor NMDA de glutamato elevados resultados en exceso Ca2 + afluencia a través de estos receptores, que a su vez activa varias vías incluyendo Ca2 +-activa proteasas, fosfolipasas, y Endonucleasas, dando por resultado la degradación incontrolada de críticos componentes celulares y muerte celular. Además, alta Ca intracelular2 + conduce a la generación de radicales libres de oxígeno y daño mitocondrial 10,11.

Mientras que la mayoría de la pérdida neuronal después de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA es debido a la afluencia del calcio y Bax/Bak independiente, no pueden excluirse otros mecanismos de muerte celular de este modelo. La aparición de ambos necrótico y apoptosis muerte celular por excitotoxicidad es parcialmente debido a la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y daño del ADN causado poralta intracelular Ca 2 + niveles 12. Daño de la DNA resulta en la muerte neuronal a través de mecanismos de apoptosis se correlacionan con señas de identidad de muerte celular por apoptosis, como la aparición de las masas de cromatina y cuerpos apoptóticos. Inducción de la apoptosis es mediada por la liberación de citocromo c desde la mitocondria y se ha demostrado para ser dependiente en la Oligomerización de Bax/Bak 13. Oligomerización de Bax/Bak promueve la formación de poros en la membrana mitocondrial externa, dando por resultado la liberación del citocromo c y la activación de pro-apoptótica reguladores con lesión isquémica leve 14.

Generación de ROS es un problema importante en el cerebro debido a los bajos niveles endógenos de antioxidantes, juntados con la necesidad de oxígeno grande para el funcionamiento neuronal 15. Cuando se expone a un evento isquémico, óxido nítrico sintasa es upregulated, produciendo óxido nítrico y aumento de especies reactivas de oxígeno 14. La mayor concentración de radicales de oxígeno puede causar daño en el ADN e indirectamente causar hambre de energía. Altos niveles de roturas de doble hebra de DNA son evacuados por la activación de la poli ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1), una proteína enlazado a la cromatina eucariota responsable de catalizar a la transferencia de unidades de ADP-ribosa del NAD+, un proceso integral que 16de reparación del ADN. Sin embargo, con excesivo daño por estrés oxidativo, activación de la PARP-1 puede causar hambre de energía debido al creciente drenaje de NAD+, un sustrato necesario para la producción de ATP mediante la fosforilación oxidativa. En última instancia, estrés oxidativo dispara la apoptosis en una manera de dependientes de Bax/Bak conduce a liberación c del citocromo mitocondrial y se ha demostrado para inducir el remodelado mitocondrial en CGNs 17.

Finalmente, cambios en la concentración de cloruro de potasio (KCl) en las culturas de la CGN pueden utilizarse para modelar bajo potasio/despolarización mediada por apoptosis 18,19,20. Cuando está expuesto a bajos niveles de K+, CGNs experimentan cambios fisiológicos distintos, dando por resultado la reducción de la respiración mitocondrial y la glicolisis, atribuido a disminución demanda celular 21, así como reducción en los niveles de nuclear factor-KB (NFκB) que regula las actividades incluyendo inflamación y transmisión sináptica 22. Este modelo es de particular interés para el estudio de la muerte celular durante el desarrollo neuronal. El ambiente K+ bajo más de cerca se asemeja a las condiciones fisiológicas y hace señas de identidad de muerte celular durante el desarrollo neuronal 23.

En Resumen, CGNs proporcionan un modelo de larga data para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de degeneración y muerte neuronal. El siguiente protocolo permitirá aislamiento y cultivo de CGNs, expresión o represión de una particular vía genética con el virus y la inducción de la muerte neuronal por mecanismos diferentes que representan la degeneración y lesión neuronal.

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Protocol

este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han describen previamente 18 , 24 , 25 , 26 , 27. este protocolo es aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la Universidad McGill.

1. preparación experimental

Nota: las siguientes soluciones stock pueden ser preparadas y mantenidas hasta su utilización.

  1. Disección solución
    1. disolver 3,62 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,069 g de fosfato de sodio (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O) y 1,306 g de D-(+)-glucosa en 500 mL de destilada de H 2 O. Luego, añadir 12,5 mL de tampón HEPES, 450 μl de solución de rojo de fenol y 20 mL de la fracción V de la BSA a la solución. Ajustar a pH 7,4 con 1 N de hidróxido de sodio (NaOH).
    2. Esterilizar con un 0,22 μm filtro y almacenar a 4 ° C. Esta solución seguirá siendo estable por hasta una semana a 10 días.
  2. Tripsina
    1. preparar una solución stock a una concentración de 25 g/L de tripsina en cloruro de sodio 0.9%. La solución a -20 ° C.
  3. Inhibidor de la tripsina
    1. Prepare un caldo con una concentración de 10 mg/mL disolviendo 1 g de inhibidor de la tripsina de pollo clara de huevo en 100 mL de 1 m m HCl. almacenar esta solución en -20 ° C.
  4. DNasa
    1. disolver 100 mg de la DNasa 1 en 10 mL de agua estéril para generar un stock de 10 mg/mL. La solución a -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. añadir a 50 mL de agua destilada (H 2 O) para generar un stock de 1 M 6,02 g de sulfato de magnesio (MgSO 4). Almacene la solución a 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. disolver 0,735 g de cloruro de calcio (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) en 50 mL de agua destilada de H 2 O a una concentración stock de 100 mM. Almacene la solución a 4 ° C.
  7. KCl
    1. disolver 3.7275 g de KCl en 50 mL de agua destilada H 2 O a una concentración stock de 1 M. tienda solución a 4 ° C.
  8. D-(+)-glucosa
    1. disolver 1,802 g de D-(+)-glucosa en 50 mL de agua destilada H 2 O a una concentración stock de 100 mM. Almacene la solución a 4 ° C.
  9. Medios de cultivo celular
    1. preparar medios de cultivo celular como sigue: 5 mL de calor inactiva el dializado de suero bovino Fetal, debe agregar 500 μl de 200 mM L-glutamina, 100 μl de 50 mg/mL de gentamicina y 1 mL de KCL de 1,0 M a 45 mL filtro esterilizado águila ' s mínimo esencial los medios de comunicación (E-MEM) que se complementa con 1,125 g/L D-glucosa para generar 50 mL de medios de cultivo de neuronas cerebelosas del gránulo. Almacenar los medios de comunicación de 4 ° C.
  10. Furanoside de Beta-D-Arabino citosina
    1. disolver 48 mg de beta-D-arabino de citosina furanoside en 10 mL de medio de crecimiento a una concentración stock de 20 mM. Solución a -20 ° C.
  11. Poly-D-lisina
    1. para generar un poli de 2 mg/mL valores de D-lisina, añadir 10 mL de estéril de H 2 O a 20 mg de poli D-lisina. Bolsa polietileno D-lisina debe almacenarse a-80 ° C en alícuotas μl 100.
  12. Nota: las siguientes soluciones se deben preparar antes de la disección y mantenidas a 4 ° C hasta su uso.
  13. MgSO 4 enriquecido disección solución
    1. añadir 300 μL del stock de MgSO 4 a 250 mL de solución de disección.
  14. Solución de tripsina disección
    1. Agregar 100 μl del stock tripsina y 12 μl del stock de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
  15. 1 de solución de tripsina inhibidor
    1. Agregar 164 μl de inhibidor de la tripsina stock, 250 μl de caldo de DNasa 1 y 12 μl del stock de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
  16. 2 de solución de tripsina inhibidor
    1. Agregar 1040 μl de inhibidor de la tripsina stock, 750 μl de caldo de DNasa 1 y 12 μl de caldo MgSO4 a 10 mL de solución de disección.
  17. CaCl 2 complementa la solución de disección
    1. añadir 10 μl del stock de CaCl 2 y 25 μl del stock de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.
  18. Poli D-lisina cubrió cultura platos
    1. para cubrir los platos de la cultura, diluir 100 μl del stock poly D-lisina en 40 mL de estéril H 2 O. Para platos de cultura Nunc 35 mm, añadir 2 mL de polivinílico diluido Solución D-lisina. Para 4 placas bien, añadir 300 μL de polivinílico diluido D-lisina a cada pocillo.
    2. Que el poli D-lisina se siente para 1 h antes de la aspiración y lavado cada uno bien con 4 mL o 600 μl (para 35 mm cultura platos o 4 placas bien, respectivamente) de estéril H 2 O. Luego aspirar el H 2 O y deje el aire platos secar durante 1 h.

2. Extracción y aislamiento del cerebelo del cerebro

  1. Decapito al día 6-7 viejo perrito de ratón usando las tijeras de la decapitación. Realizar la disección del cerebro en una campana de cultivo estériles para tejidos.
  2. Para quitar el cerebro, sujete la cabeza con un par de pinzas y cortar a través de la piel hacia la parte anterior de la cabeza usando el microdissection tijeras como se muestra en la figura 1. Cortan a través del hueso del cráneo usando un nuevo par de tijeras para minimizar el riesgo de contaminación. Retire del cráneo que cubren el cerebro con unas pinzas y embromar hacia fuera el cerebro con pinzas o una espátula de.
    1. Según sea necesario, cortar a través del nervio óptico para facilitar sacar el cerebro como un todo.
  3. Lugar del cerebro en la solución de disección que se complementa con MgSO 4. Mantener la solución y el cerebro en hielo.
  4. Siguiente retiro, bajo un microscopio de disección del cerebro, disecar hacia fuera el cerebelo del cerebro mientras que aún en la solución de MgSO 4 complementadas la disección y quitar las meninges con unas pinzas finas. Gire el cerebelo en su parte ventral y asegurar la eliminación del plexo coroides.
  5. Piscina el cerebelo en una placa de 35 mm ~ 1 ml de MgSO 4 complementado disección solución.
  6. Cortar el tejido en trozos pequeños y transferir a un tubo de 50 mL que contenga 30 mL de solución de MgSO 4 intermedia disección.

3. Ratón del gránulo cerebeloso neurona aislamiento y cultivo

  1. centrifugar el tubo de 50 mL que contiene el tejido cerebral picadito durante 5 minutos a 644 x g y 4 ° C.
  2. Quite el sobrenadante y añadir 10 mL de solución de tripsina disección. Luego sacuda el tubo a alta velocidad durante 15 min a 37 ° C.
  3. Añadir 10 mL de solución de inhibidor de tripsina 1 el tubo suavemente durante 2 minutos y
  4. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 644 x g y 4 ° C.
  5. Quite el sobrenadante y añadir 2 mL de solución de tripsina inhibidor 2 y entonces transfiéralo a un tubo de 15 mL.
  6. Triture el tejido en la 15 mL el tubo hasta que la solución se vuelva turbia. Luego deja reposar 5 min
  7. Eliminar el sobrenadante y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo que contiene 1 mL de solución de CaCl 2 suplido disección.
  8. Añadir otro mL de tripsina inhibidor de la solución 2 a la parte inferior del tubo que contiene el precipitado del paso 3.6. Triturate otra vez y dejar que resolver por 5 minutos quite el sobrenadante y agregar al tubo que contiene el sobrenadante del paso 3.7 (que es una repetición de pasos 3.6-3.7). Repita este proceso hasta que la mayoría de los tejidos mecánicamente está disociado.
  9. Agregar 0,3 mL de CaCl 2 complementa la solución de disección a la colección sobrenadante por cada mL del sobrenadante.
  10. Mezclar el contenido del tubo y luego centrifugar durante 5 min a 644 x g.
  11. Quite el sobrenadante y añadir 10 mL de medio fresco a la pastilla y se mezclan.
  12. Células pueden ser contadas y diluidas a una concentración de 1.5 x 10 6 células/mL. Tenga en cuenta que en general se esperan 10 millones de células de cada cerebro disecado, depende del tiempo de tripsinización y eficacia de la disección. Placa de células en las placas anterior poli D-lisina. Para pozo de 4 placas, placa de 0.5 mL, dando 7.5 x 10 5 células por pocillo. Para platos de 35 mm, placa de 4 mL, dando 6 x 10 6 células por placa.
  13. Después de 24 h, añadir furanoside de arabino-β-citosina (AraC) a las placas para reducir la contaminación glial. Cada mL de medio de 0,5 μl de 20 mM AraC se requiere. Además de AraC no requieren un cambio de los medios de comunicación. Si las células han de mantenerse durante 7-8 días, repetir este tratamiento el día 3.
  14. Mantener las culturas en una 5% CO 2 incubadora a 37 ° C y alimentar con 100 μl de 100 mM de glucosa agregado a la cultura por cada 2 mL de medio cada 2 días pasados 5 días. No es necesario un cambio de medios completo.

4. Embalaje de lentivirus, purificación y valoración

Nota: el protocolo para el embalaje, concentración, purificación y valoración de lentivirus se ha descrito previamente en detalle sin el uso de un kit de 28, incluyendo métodos alternativos de valoración, tales como flujo cytometry 29. Aquí presentamos brevemente el protocolo usado en nuestro laboratorio para la producción de lentivirus para estudiar lesiones neuronales utilizando solución de purificación de virus rápida y un kit de regulación lentivirales de qPCR.

  1. Las células Hek293T placa en platos de cultivo de 10 cm con Dulbecco ' s modificado Eagle ' s esencial medio mínimo (DMEM) suplementado con 10% FBS. Para la obtención de un alto título viral, crecer por lo menos 5 placas de células Hek293T para cada transfección. Asegúrese de que el día de las células de la transfección son confluentes de 70%. Cambiar los medios de comunicación tres horas antes de la transfección.
  2. Para cada transfección, prepare dos tubos. En el tubo 1 agregar 1.5 mL Suero reducido MEM medios y 41 μl de reactivo de transfección, mezclar bien. En el tubo 2, agregar 1,5 mL de medio MEM-reducido suero y 6 μg de plásmido de transferencia, 6 μg de pCMV-dR8.2 vector (plásmido de embalaje), 3 μg pCMV-VSV-G vector (plásmido de envolvente) y 35 μl de reactivo de potenciador de p3000 (suministrado con lipofectamine). Mezclar bien y combinar tubos 1 y 2, vortex e Incube por 15 minutos
  3. Retire el 50% de los medios de comunicación de placas Hek293T y añadir complejos lípidos de ADN a las células. Incubar durante 6 h a 37 ° C, 5% CO 2. Medios de quitar y reemplazar con 5 mL de DMEM fresco, incubar durante una noche.
  4. En 24 h transfección después, recoger el primer lote de sobrenadante viral de cada placa. Mantener los medios de comunicación viral a 4 ° C y añadir 5 mL de medio fresco en cada placa de células Hek293T. Incubar durante una noche.
  5. 48 h post-transfección, recoger el segundo lote de sobrenadante viral, combinarlo con la primera tanda y centrifugar sobrenadante viral combinada durante 10 minutos a 600 x g.
  6. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro con tamaño de poro de 45 μm.
  7. Purificar el virus usando una solución de purificación rápida de virus. Por cada 45 mL de sobrenadante viral, añadir 5 mL de solución de enlace lentivirales, mezcle y centrifugue durante 10 minutos a > 5.000 x g y 4 ° C.
  8. Retire el sobrenadante con cuidado para no perturbar el sedimento.
  9. Añadir 20-40 μl del medio y vuelva a suspender el sedimento. Alícuota y conservar a -80 ° C.
    10. Se utiliza
  10. para obtener el título lentivirales, un kit de regulación lentivirales de qPCR. Diluir 2 μl del virus purificado en 500 μl de PBS. Añadir 2 μl del virus diluido a 18 μL de buffer de lisis de virus (incluido en el kit).
  11. Conjunto de tres diferentes reacciones de RT-q-PCR en triplica y etiqueta como control positivo, lisado viral 1 (STD1) y control positivo 2 (STD2). Para cada reacción agregar, 12,5 μl de 2 x qPCR MasterMix, 2.5 μl de cualquiera viral lisado o STD1 (proporcionado en el kit) o STD2 (proporcionado en el kit) y 10 μl de reactivo de mezcla (proporcionado en el kit) en tubos PCR de 0,2 mL.
  12. Establecidas en el programa PCR: 20 min a 42 ° C para transcripción reversa, 10 min a 95 ° C para la activación de la enzima, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C para la desnaturalización y 1 min a 60 ° C para recocer/de la extensión.
  13. Calcular el título viral usando esta fórmula:
    Título viral lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = valor medio de la Ct de la muestra desconocida, Ct1 = valor promedio de STD1, Ct2 = valor promedio de STD2.
    Nota: Puede mejor CGNs transduced con lentivirus o infectados con adenovirus dependiendo del modo de la lesión estudiada. Incorporación de lentiviruses en una MOI de 2-3 a la solución de cultivo celular en el momento de la galjanoplastia se utiliza para estudiar la señalización inducida por NMDA en el día 7 de la cultura. Esto se traduce en más del 80% transducción y es apropiado para proseguir con los análisis bioquímicos de estas neuronas ( figura 2). Además de adenovirus en el día 5 de cultivo (en MOI 50) y estudiar NMDA inducidos por señalización en día 7-8 se utilizan para otras técnicas como la proyección de imagen. Este tratamiento resulta en menos del 10% infección de las neuronas, lo que es ideal para la proyección de imagen y colocalización de proteínas. Adenovirus pueden utilizarse en el momento de la galjanoplastia para estudiar muerte de la célula ADN daño inducido por la adición de la camptotecina en día 2-3 o el estrés oxidativo por la adición de peróxido de hidrógeno. La presencia de proteínas de fluorescencia (GFP y RFP, CFP YFP) etiquetada con el gen de interés puede utilizarse para estimar la transducción por ciento y toxicidad potencial. Con el Ministerio del interior recomendada, vemos toxicidad mínima y máxima transducción ( figura 3).

5. Modelado Neuronal lesión

  1. para inducir NMDA inducidos por excitotoxicidad neuronal, después de 7 días en vitro, tratar CGNs con 100 μm NMDA y la glicina de 10 μm para 1 h. sustituir el medio por medio condicionado de culturas paralelas con no tratamiento. Esta concentración resulta en 50% la muerte celular en el tratamiento post 24 h ( figura 3). La fragmentación mitocondrial es evidente en el tratamiento post 6-8 h (ver Asl Jahani et al. 26 , 27).
  2. para inducir la muerte celular inducida por ROS (estrés oxidativo), tratamiento de neuroNS con 75-100 μm el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y a acondicionado medios de culturas paralelas después de la exposición de 5 min a H 2 O 2. Nota debido a la inestabilidad de H 2 O 2, optimizar la concentración a un nivel que induce la muerte celular, 50-70% en cultura tras 24 h de tratamiento.
  3. Para inducir la DNA daño muerte celular inducida, tratar CGNs con camptotecina μm 10. Esta concentración induce más que muerte celular 50% en 24 h. fragmentación mitocondrial y señalización de apoptosis temprana ocurre 2-3 h después de la adición de la camptotecina en esta concentración (ver Asl Jahani et al. 18)
  4. para inducir la baja K + inducida por apoptosis neuronal en CGNs, cambiar los medios de comunicación que contiene 25 mM K + a medios bajos de potasio con 5 mM K + después de 7 días en vitro.

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Representative Results

Con disección cuidadosa, debe quitarse el cerebro intacto con daño mínimo como se ve en la figura 1A-B. Esfuerzo debe tomarse para minimizar los daños al cerebro durante la extracción, particularmente daños a cerebelo. Daños en el cerebelo hacen de más difícil identificación y eliminación completa de las meninges y aumenta la probabilidad de contaminación de la cultura neuronal. Una vez que se hayan removido las meninges, cerebelo puede disecado desde el tejido restante, como se ve en la figura 1 y preparado para disociación.

Antes de la galjanoplastia, CGNs pueden ser transduced con lentivirus o infectados con adenovirus como se describe en la figura 2. Nos encontramos con máxima eficacia y mínima toxicidad con MOI 50 para la infección con adenovirus y una MOI de 2-3 en el día de la galjanoplastia de lentivirus (figura 3).

Culturas CGN saludables transduced en DIV 7 se presentan en la Figura 3A. Si gran cantidad de glía permanece presentes en la cultura, se puede aumentar la concentración de AraC para asegurar una población neuronal pura. También células gliales toman el virus más fácilmente que las neuronas y que se vuelve crítica si las transducciones se realizan en el día 5. La presencia de neuronas que experimentan la muerte celular puede ser evaluada por la formación de núcleos pyknotic como se ve en la figura 3. Todas las concentraciones de la NMDA, H2O2y camptotecina son optimizadas para inducir la muerte celular de 50% después de 24 h. Esto permite estudiar otros acontecimientos tempranos que preceden a la pérdida como la fragmentación mitocondrial neuronal.

Figure 1
Figura 1: extracción de cerebro de ratón y la disección de cerebelo. (A) para extraer el cerebro de un ratón de 6-7 días, utilizando un par de pinzas, sujete la cabeza y cortar la piel anterior a lo largo de las líneas de puntos usando un par de tijeras de microdissection. Tenga cuidado de cortar solo la piel y del tejido conectivo, demasiado profundo incisión puede perforar el cráneo y dañar el cerebro. Estos tres incisiones, recto a lo largo de la línea media y dos curvas lateralmente, permitir que la piel al ser empujado de nuevo revelar el cráneo. Una vez expuesto, el cráneo puede ser penetrado con la punta de las tijeras y corte anterior. Debe tener gran cuidado no se dañe el cerebelo para facilitar la identificación y eliminación de meninges. Una vez cortadas, fórceps pueden utilizarse para pelar detrás del cráneo, exponiendo el cerebro que luego puede ser burlas hacia fuera en solución fría disección utilizando un par de pinzas o una espátula. Para quitar el cerebro, el nervio óptico puede necesitar ser cortado. (B) una vez retirado el cráneo, las meninges deben ser removidas del cerebelo con un par de pinzas de punta finas. (C) usando un par de pinzas de punta finas, el cerebelo se diseca el tejido restante e inspeccionado para asegurar el retiro completo de las meninges. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: modelado de lesión neuronal en las neuronas cerebelosas del gránulo. Cerebelo aislado desde el día que 6-7 ratones son disociados en las células siguiendo el procedimiento presentado en parte 3. Disociación, las células se cuentan y resuspendió en un volumen de medios de cultivo para generar 1.5 x 106 cells/mL.For 35 platos de mm, se platean 4 mL, dando 6 x 106 células por placa. Para imágenes diapositivas, 0,5 mL es plateado, dando 7.5 x 105 células/pocillo. CGNs pueden transduced con lentivirus o infectadas con adenovirus. Uso de adenovirus en el día de la galjanoplastia (0 días en vitro (DIV)) da mayor que 90% de eficiencia de transfección y permite el estudio de la lesión neuronal a través de estrés oxidativo y daño del ADN. La adición de 10 μm camptotecina (CPT) inducen daño en el ADN, mientras que el 75-100 μm peróxido de hidrógeno (H2O2) inducen estrés oxidativo. La concentración de H2O2 debe ser optimizada para inducir la muerte celular de 50% después de 24 h. Infección con adenovirus en DIV 5 da una menor eficacia de transducción de menos del 10%. En DIV 7 cuando los receptores NMDA se enriquecen en la cultura, las neuronas pueden tratarse con 100 μm NMDA y la glicina de 10 μm para inducir la excitotoxicidad. Esto es ideal para posterior análisis de imágenes o trazado de una sola neurona. Finalmente, transducing con lentivirus en DIV 0, seguido por el tratamiento con 100 μm NMDA y 10 glicina μm en DIV 7, da una eficacia de transducción suficientemente alta (> 80%) para permitir el análisis bioquímico de la cultura, incluyendo ChIP secuenciación, examinar expresión de la proteína y la realización de ensayos en vivo/muerto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: las neuronas cerebelosas del gránulo. (A) las neuronas fueron transduced con lentivirus de RFP en una MOI de 3 en el momento de la galjanoplastia y fijo y manchadas en 7 días in vitro. Colocalización de señal RFP, MAP2 y Hoechst se muestra para demostrar las neuronas sanas que son completamente transduced por lentivirus. (B) las imágenes representan el análisis de ensayo muerto vivo de neuronas infectadas con MOI diferentes, para medir la toxicidad. CGNs infectados con adenovirus que expresan LacZ en un MOI entre 25 y 50 permite máxima eficiencia manteniendo la mínima toxicidad. Menos de un 1% de diferencia en la supervivencia de la célula en comparación con el control es visto cuando infectando en este MOI. (C) Hoechst tinción de control CGNs y CGNs tratados con NMDA para inducir la muerte celular. Tenga en cuenta la formación de núcleos picnóticos con tratamiento de NMDA. Esto es indicativo de la muerte celular y puede verse en aproximadamente el 50% de la cultura 24 h después del tratamiento con NMDA de 100 μm y 10 μm glicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí le ofrecemos un método simple para el cultivo de neuronas cerebelosas del gránulo de primario de ratón (CGNs), pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de diferentes mecanismos de muerte celular. Varios factores afectan la reproducibilidad de los resultados mediante este procedimiento que requieren vigilancia estrecha. Se trata de la pureza de la cultura incluyendo la eliminación de las células gliales en la cultura, la confluencia de la cultura y mantener las células sanas. Presenta variabilidad en estos factores puede sesgar los resultados y desafiar la reproducibilidad. A continuación describimos cómo reducir al mínimo los factores que afectan negativamente los resultados.

Para eliminar las células gliales de la cultura CGNs y establecer una población neuronal pura, utilizamos 10 μm de furanoside arabino-β-citosina (AraC), un antimetabolito de la pirimidina que mata células de la proliferación mediante la inhibición de la síntesis de ADN. Si todavía hay una población de células gliales presentes, se puede aumentar la concentración de AraC a 15 μm. También es dependiente de muchos. Además, para las culturas que se mantienen durante 7-8 días, un segundo tratamiento de AraC se puede realizar en día 3. Para obtener una población neuronal pura y evitar la muerte celular, es importante pelar todas las meninges fuera del cerebelo antes de cortar el tejido en piezas, seguidas por tripsinización. Esto debe hacerse en un periodo razonablemente corto de tiempo (no más de 7-10 min por cerebelo). La presencia de meninges en los resultados de cultivo neuronal en cultura enfermiza y eventualmente la muerte celular. Otro factor que podría causar la muerte de las neuronas antes del tratamiento es el momento de la tripsinización. Es importante que las células no son demasiado trypsinized. Por otra parte, bajo la tripsinización requiere mayor disociación mecánica de las células que puede dañarlos o provocar un bajo rendimiento. Por lo tanto, el tiempo de la tripsinización requiere optimización y es dependiente.

El siguiente factor a considerar es la confluencia de las células en el momento de uso. Confluencia diferentes puede generar variabilidad en los resultados. Esto es particularmente importante dependiendo de la lectura en los experimentos. Con un estado de confluencia baja, las neuronas comienzan a grupo después de 2-3 días. Un estado de confluencia demasiado baja o demasiado alta de las neuronas deteriora de señalización. Es importante contar el número de células vivas para la galjanoplastia precisa.

Se han descrito otros métodos de las culturas de la CGN, sobre todo mirando de procedimientos básicos de cultivo mediante un sistema de disociación de la papaína kit 30 como bien como las cultivo procedimientos y manipulación de la CGN para estudiar la migración neuronal y morfología 31. El protocolo presentado por Lee et al. describe el uso del Kit de sistema de disociación de papaína. Recomiendan dos métodos para aumentar la pureza de las aislada CGNs: funcionamiento de las células a través de una separación del gradiente de Percoll, así como la pre-galjanoplastia en una placa de poly-D-lisina por 20 min. Ambos métodos son ayudar en la separación de CGNs de contaminantes gliales. Esto es recomendable en caso de tratamiento con AraC sola no es suficiente para enriquecer la cultura pura de neuronal. Además, Lee utiliza crías de ratón de 4-6 días, mientras que sirve un modelo eficaz para examinar la diferenciación neuronal; encontramos usando CGNs de crías de ratón de 6-7 días es más apropiado para el estudio de la lesión neuronal. Holubowska et al presenta un protocolo de la transfección de las neuronas cerebelosas post mitotic usando el fosfato de calcio método in vitro y electroporación in vivo. Estos son métodos excelentes para manipulación genética de las neuronas que puede trazarse una sola neurona. La eficiencia de transfección mediante fosfato de calcio método puede variar de 0.1-5%. Por lo tanto, encontramos que para los análisis bioquímicos incluyendo análisis de ChIP-Seq, Co-inmunoprecipitación e immunoblotting, uso de lentiviruses es más apropiado que resulta en más del 80% transducción cuando transduced en el momento de la galjanoplastia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por Ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá y los institutos canadienses de investigación en salud otorga a A.J.-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

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References

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Neurociencia número 129 cerebelo neuronas cerebelosas del gránulo (CGN) Adenovirus transducción lentivirales excitotoxicidad N-metil-D-Aspartato (NMDA) Apoptosis cloruro de potasio (KCl) camptotecina peróxido de hidrógeno (H2O2)
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Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

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