Summary
Nauw mimic de wijze van brandwonden vereist het samenspel tussen klinische observatie en onderzoek in diermodellen. In deze studie, werd een model van de varkens van ernstige branden schade opgericht om te beoordelen van een experimentele dressing in fysiologische en pathofysiologische instellingen.
Abstract
Wondgenezing is een dynamische herstelproces en het meest complexe biologische proces in het menselijk leven. In reactie op schade branden, wijzigingen in de biologische wegen afbreuk doen aan de ontsteking reactie, resulterend in een vertraagde wondgenezing. Verminderde wondgenezing optreedt vaak bij patiënten met diabetes leidt tot ongunstige uitkomsten zoals amputatie. Vandaar, dressings hebben gunstig effect bij de bevordering van branden wond reparatie nodig zijn. Studies over branden wond behandeling zijn echter beperkt wegens gebrek aan goede diermodellen. Onze vorige studie aangetoond wondgenezing prestaties in rat en varkens modellen met behulp van een minimaal invasieve operatietechniek. Deze studie was gericht op het aantonen van een model van de varkens van ernstige branden schade die wond contractie elimineert en meer nauw benadert de menselijke processen van re epithelialization en de vorming van nieuw weefsel. Dit protocol biedt een gedetailleerde procedure voor het maken van consistente brandwonden en behandeling van de wond-genezing prestaties onder de behandeling van een experimentele dressing in een varkens-model. Zes brandwonden zijn symmetrisch gemaakt op het dorsum, die waren bedekt met een klinische dressing bestaat uit vier lagen: een contact binnenlaag van experimentele materialen, een tussenliggende binnenlaag van waterdichte film, een tussenliggende buitenlaag van gaas, en een buitenste laag van hechtende pleister. Na de voltooiing van experimenten, werden wond sluiting, wond gebied, en Vancouver litteken schaal-score onderzocht. De monsters van de huid van elk dier na offer gereseceerd histologisch waren voorbereid en gekleurd met haematoxyline en eosine-kleuring. Antibacteriële activiteit van elke dressing in het kader van de wondgenezing werd ook onderzocht. De toepassing van de klinische dressing op de wonden in varkens model bootst de biologische processen van menselijke wond genezing met betrekking tot de processen van epithelialization, cellulaire proliferatie en angiogenese. Daarom biedt deze varkens-objectmodel een easy-to-learn, kosteneffectieve en robuuste methode voor de beoordeling van het effect van klinische dressings in ernstige branden letsel.
Introduction
Een blessure branden het inflammatoire proces initieert en induceert complexe pathologische effecten, die talrijke lichaamsfuncties direct na een ongeluk beïnvloeden, wat resulteert in een negatieve impact op de levenskwaliteit van de patiënten. Verminderde wondgenezing veroorzaakt significante morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met diabetes mellitus1,2. De meeste patiënten met brandwonden ervaren pijn tijdens branden wond debridement, die bekend als een ondraaglijke proces ondanks het gebruik van krachtige opioïden analgetica3 staat.
In tegenstelling tot andere zoogdieren delen varkens verschillende anatomische en fysiologische kenmerken bij de mens met betrekking tot het proces van angiogenese, epithelialization en cellulaire proliferatie. Dit maakt varkens een potentieel beter model voor bepaalde procedures en studies, en ze worden vaak gebruikt in latere studies die aangetoond veelbelovende resultaten bij muizen. Deze functies hebben geleid tot het toenemende gebruik van varkens als een belangrijke soort in de preklinische testen. Onlangs, een snelle toename van het biomedisch onderzoek met respect tot cardiovasculaire, urine, Integumentair en spijsvertering geconstateerd4,5,6. Deze studie heeft tot doel om aan te tonen van een model van de varkens van ernstige branden letsel dat voorkomt dat de samentrekking van de wond en zorgt voor een nauwere onderlinge aanpassing van de menselijke wond helende processen en de vorming van nieuw weefsel. Zes brandwonden zijn symmetrisch gemaakt op het dorsum, drie aan weerskanten van de wervelkolom van de varkens. Anexperimental dressing werd vervolgens onderzocht in een model van de varkens van ernstige branden verwonding, dat kan worden aangepast om te repliceren menselijke wondgenezing (Figuur 1). De wonden waren bedekt met een klinische dressing, die is samengesteld uit vier lagen: een contact binnenlaag van experimentele materialen, een tussenliggende binnenlaag van waterdichte film, een tussenliggende buitenlaag van gaas en een buitenste laag van hechtende pleister. Een waterdichte film houdt de omgeving van de wond vochtig terwijl het voorkomen van bacteriële infectie en waardoor gassen te doordringen van de dressing. De tussenliggende buitenlaag van gaas werd toegepast op de waterdichte films en beveiligd door een buitenste laag van hechtende pleister. Bij de voltooiing van experimenten, werden wond sluiting, wond gebied, en Vancouver litteken schaal (VSS) score onderzocht. De monsters van de huid van elk dier na offer gereseceerd histologisch waren voorbereid en gekleurd met haematoxyline en eosine (HE) kleuring. Antibacteriële activiteit van elke dressing in het kader van de wondgenezing werd ook onderzocht in dit model. Onze vorige studie heeft aangetoond wondgenezing prestaties in rat en varkens model met behulp van een minimaal invasieve operatietechniek7. Aangezien er dat zes branden wonden op het dorsum binnen elke varkens waren, was elke experimentele dressing getest en geëvalueerd in alle posities te minimaliseren bias aan het genezingsproces gewikkeld in verschillende plekken op het varkens dorsum gerelateerde. Daarom is het model van de varkens van ernstige branden letsel vastgesteld in deze studie biedt een nieuwe aanpak voor de evaluatie van klinische dressings en vergemakkelijkt de ontwikkeling van een nieuwe behandeling voor schade van de branden. Deze studie biedt cruciale hulpmiddelen om de pathofysiologie van branden wondgenezing bloot te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen hebben goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op National Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C). Deze studie werd uitgevoerd in het laboratorium dier Center op de National Defense Medical Center. Varkens met een gewicht van tussen 20 en 25 kg heeft met succes zijn geïnstrumenteerd met behulp van dit protocol.
1. aanpassing van de dieren aan menselijke behandeling
- Na aankomst in de faciliteit, huis van de dieren overrijden maar laat ze met elkaar omgaan.
- Bieden de dieren ad libitum toegang tot voedsel en water.
- Acclimatiseren varkens menselijke behandeling en vervoer van het dier faciliteit naar het experimentele laboratorium door het hanteren van het dier ten minste eenmaal per dag gedurende één week.
- Snel het dier voor ten minste 12 uur voor de operatie ter voorkoming van misselijkheid, braken en aspiratie van maag vloeistoffen.
2. sedatie
- Vóór de oprichting van branden wond, verdoven dieren via een intraveneuze injectie met Zoletil 50 (25 mg/kg).
3. intubatie en ventilatie
- Plaats het dier op een tabel en/of trolley in sternale positie.
- Open de mond van het dier met een mondelinge strooier.
- In geval van onvoldoende ontspanning van de kaken of aanwezigheid van het slikken van reflexen, die belemmeren intubatie, masker het zwijn met Isofluraan voor het opwekken van sedatie.
- Controleren van bloeddruk, hartslag en lichaamstemperatuur door fysiologische signaal monitor tijdens de operatie om mogelijke complicaties te voorkomen.
4. anesthesie
- Induceren en onderhouden van anesthesie; bij voorkeur anesthetize het dier via een intramusculaire injectie van tiletamine en zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
- Intubate van het dier met de Endotracheale tube wanneer spier ontspanning, gekenmerkt door verlies van kaak Toon en ooglidreflex reflexed, werd waargenomen.
- Houden alle varkens in een verdoving staat bij de instelling van een vaporizer van 0.5-2.5% (v/v) Isofluraan tot het einde van de operatie.
- Onderzoeken de diepte van de verdoving door te testen pijn reflexen met een achterpoot teen snuifje voor de operatie. Indien nodig, toevoegen van extra verdoving of wacht een paar minuten. Controleer pijn reflexen regelmatig gedurende de operatie.
5. sterilisatie van de chirurgische Site
- Scheren en het reinigen van de huid van het dier over een oppervlakte van ongeveer 25 cm breedte van de wervelkolom helemaal tot aan de oksel aan beide zijden.
- Scrub de huid gehydrateerd met Povidon-jodium scrub (75 mg/mL) voor ongeveer 5 min.
- Verwijder de zeep Povidon-jodium uit de huid met behulp van natte steriele gauzes.
- Het steriliseren van de huid met Povidon-jodium lotion (100 mg/mL).
- Dekking van het dier met steriele afdeklakens bacteriële overdracht en besmetting van de chirurgische site achteraf terug te dringen.
6. branden wond creatie
- Gebruik een pen chirurgische markering ter gelegenheid van het centrum van zes brandwonden symmetrisch op het dorsum van het varken. Zorg ervoor dat de afstand tussen elke wond branden ten minste groter is dan de straal van de wond (figuur 1A).
- Vul een gemodificeerde soldeerbout met 50 mL glycerine en invoegen van een elektronische thermometer erin om de temperatuur te bewaken. Het heet strijkijzer beschikt over een vlak gebied van ongeveer 9 cm2 (figuur 1B).
- Opwarmen van de ijzer tot 137-139 ° C met een warmhoudplaat (Figuur 1 c).
- Zes uniforme brandwonden maken door het plaatsen van het ijzer op het gemarkeerde gebied zonder toepassing van kracht gedurende 30 seconden (Figuur 1 c).
- Wassen van de brandwonden met zoutoplossing 0,9% (Figuur 1 d).
- Meten van de afmetingen van de wond en het opnemen van de wond door photomicrography (figuur 1E).
7. bereiding van Dressings
- Betrekking hebben op elke wond met de contact binnenlaag van een vier-laags klinische dressing via direct contact. Voor deze laag, gebruikt u de CAPS-bevattende dressing of alternatieve materialen (figuur 1F).
- Een waterdichte film op de klinische dressing om te dienen als een barrière tegen bacteriële penetratie (figuur 1F) van toepassing.
- Betrekking hebben op elke wond met een gaas (0,5 cm dik) en herstellen met de papieren rompslomp om te dienen als de midden laag van de dressing (figuur 1G).
- Beveiligen van de gaas met een buitenste laag van hechtende pleister. Uitbreiden van deze laag naar de romp om te voorkomen dat de verplaatsing van de dressing (Figuur 1 H-1J).
8. na branden zorg en meting
- Injecteer de varkens met buprenorfine (0,1 mg/kg, IM) voor pijnbehandeling voor elke 8-12 h, beginnen vóór terugwinning van anesthesie, gedurende één week om potentiële pijn te verminderen.
- Toestaan dat de vrije toegang van varken te voeden en water.
- Wijzigen van de klinische dressings om de 2 dagen voor de eerste 10 dagen en vervolgens tweemaal per week voor de 6 weken durende studie.
- Schoon en meten van wonden voordat het opnieuw toepassen van klinische dressings. Verdoving tijdens dressing wijzigingen beheren.
- Opnemen van de wond door photomicrography voor vergelijking van wond genezing tarief om de 2 dagen voor de eerste 10 dagen en vervolgens tweemaal per week voor de 6 weken durende studie.
- Bereken de wond opnieuw epithelialization of samentrekking als het percentage van de oorspronkelijke grootte van de wond volgens een eerder beschreven methode. De analyse van de wond sluiting werd uitgevoerd in een dubbel-blind wijze.
- Meten van het litteken van de branden met behulp van de VSS, die uit vier variabelen bestaat: vasculariteit, hoogte (dikte), plooibaarheid en pigmentatie op na branden dagen 0, 7, 21 en 42. Elke variabele heeft vier tot zes mogelijke scores. De totaal score varieert van 0 tot en met 14, waarbij een score van 0 geeft normale huid.
9. bacteriële groei experimenten van de weefsels na branden
- Swab het wond voor het antibacteriële testen op na branden dagen 0, 7, 21 en 42.
- Plaats het staafje in 100 mL steriele zoutoplossing 0,9% en zachtjes vortex tot een homogene suspensie.
- Serieel verdunnen (10−1–10−5) het homogenaat en plaat 100 μl van elke verdunning in selectieve en opvangfaciliteiten media, respectievelijk.
- Incubeer alle verdunningen onder aërobe omstandigheden bij 37 ° C gedurende 24-72 uur.
- Plaat drievoudige aliquots van 10 μL van alle verdunningen op bloed agarplaat aangevuld met 5% schapen bloed te isoleren van aërobe gram-positieve organismen.
- Incubeer het monster door verspreiden of het gieten van het monster gelijkmatig op het oppervlak van een agarplaat 's nachts voor het bepalen van het aantal kolonie-vormende eenheden (CFUs).
- Lees de platen na een incubatieperiode van de overnachting. De schapen bloed agarplaat omkeren en de onderkant van de schotel verdelen in vier gelijke kwadranten met behulp van een markering en kleine liniaal.
- Plaats de plaat op het podium van een Microscoop dissectie en tellen van de kolonies op elke plaat. Per definitie moet een kolonie een minimum van 300 kve te worden geïnventariseerd.
- Tellen de bacteriële kolonies in elk van de drie wordt gerepliceerd. Bereken de gemiddelde waarde van de drie repliceert. De kve per plaat bepalen door te vermenigvuldigen met de gemiddelde waarde de eindverdunning factor.
10. euthanasie en weefsel fixatie
- Intraveneus injecteren een overdosis van natrium pentobarbital euthanasie oplossing (80 – 120 mg/kg).
- Uitvoeren en bloc excisie van branden wond weefsel met de onderliggende spieren en omliggende gewonde weefsel.
- Herstellen van weefsels met 10% neutraal gebufferde formaline.
- Meng 10 mL formaldehyde (37%) in 90 mL fosfaatgebufferde oplossing (PBS) en winkel in 4 ° C.
- Weefsels overbrengen fixeer en swirl van de container om ervoor te zorgen dat alle weefsels worden volledig ondergedompeld in fixeerspray. Het volume van fixeerspray moet 30 maal het volume van weefsel.
- Vaststellen dat weefsels 's nachts 4 ˚C.
- Weefsels met ethanol dehydrateren en inbedden in paraffineblokken. Voer de volgende stappen op 4 ˚C op een shaker.
- Spoel tweemaal met PBS voor 30 minuten.
- Dehydrateren weefsels met 70% ethanol voor 8 uur, 's nachts 80% ethanol, 95% ethanol voor 8 uur, waarna in 100% ethanol's nachts.
- Incubeer weefsels in 100% ethanol voor een verdere 8 uur.
- Incubeer weefsels in drie wijzigingen van xyleen, elk gedurende 30 minuten.
- Vervang de xyleen met vers gesmolten (52 ° C) wax en Incubeer bij 52 ° C in de oven gedurende 1 uur.
- De wax vervangen door verse wax en Incubeer bij 52 ° C in de oven gedurende 3 uur, en vervolgens nogmaals vervangen en na een nacht bebroeden bij 52 ° C.
- Weefsels met twee meer veranderingen van wax elke Incubeer gedurende 1 uur, en dan insluiten van het weefsel en bewaren bij 4 ° C.
- Snij en vlekken van de paraffine-ingebedde secties met hij en visualiseren via een lichte Microscoop met 100× vergroting.
- Paraffine secties gebruikend rotary microtome maken.
- Dewax secties met drie wijzigingen van xyleen, elk gedurende 3 minuten.
- Weefsels met 100%, 95%, 80% en 70% ethanol, elke 3 minuten hydrateren, en vervolgens onder te dompelen in gedestilleerd water.
- Vlek met haematoxyline gedurende 10 minuten en spoel in stromend kraantjeswater.
- Differentiëren met 0,1% zoutzuur ethanol voor 5 minuten, en spoel in leidingwater.
- Vlek met 0,5% eosine gedurende 1 minuut.
- Dehydrateren weefsels met 70%, 80%, 95% en 100% ethanol gedurende 2 minuten.
- Schakel de kleuring met xyleen en droog in de zuurkast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Branden duur van 30 seconden door heet strijkijzer resulteerde in wonden die rond met een welomschreven marge en uniform bleek met een rand van erytheem (Figuur 1 d waren). Binnen elk dier waren er zes brandwonden op het dorsum. De rangschikking van brandwonden werd afgebeeld in Figuur 1 K. Brandwonden werden volledig bedekt met CAPS-bevattende dressing en gebruikt voor het evalueren van de diepte van littekenvorming na branden dagen 0, 7, 21 en 42 en opnieuw epithelialization, zoals bepaald door bruto inspectie. Brandwonden werden opnieuw epithelialized op basis van bruto inspectie op na branden dag 42. De grootte van de wond in deze dieren werd geëvalueerd om te bepalen van de wond genezing tarief (figuur 2A). Wond gebieden waren 9, 10, 8 en 3 cm2 op na branden dagen 0, 7, 21 en 42, respectievelijk. Een significante vermindering van wond gebied werd waargenomen op na branden dag 42 in vergelijking met dag 0. De genezing tarief werd gedefinieerd als de grootste gemiddelde wond marge afstand van het midden van de wond gedeeld door de tijd in beslag van de sluiting van de wond. Wonden behandeld met CAPS-bevattende dressing toonde een 73.43±6.33% wond sluiting op na branden dag 42 (figuur 2B).
Figuur 3 toont de VSS-scores met betrekking tot litteken vasculariteit, plooibaarheid, pigmentatie en hoogte op na branden dagen 0, 7, 21 en 42. De VSS-score bedroeg 7.4±0.5 op na branden dag 21 en verlaagd naar 3.33±0.58 op na branden dag 42.
Alle dieren werden opgeofferd na branden dag 42. Monsters van de huid van elk dier na offer gereseceerd histologisch werden voorbereid en gekleurd door H & E. Histologic onderzoek van de monsters bevestigd dat full-dikte brandwonden werden bereikt, en de wonden volledig genezen (Figuur 4 verscheen). Necrose als gevolg van brandwonden kon worden waargenomen in de epidermis, de dermis en de dermale componenten van de wond zonder aanzienlijke invloed zijn op de onderliggende spier (Figuur 4). De dikte van de dermis onder de experimentele dressing was 5.4 mm (figuur 4A). Bovendien, het afwerpen van de dermis en lymfatische infiltratie die worden waargenomen bij de H & E kleuring, zoals aangegeven door de rode pijl in figuur 4B.
De antibacteriële eigendom van de experimentele dressing werd bepaald met behulp van een CFU assay op na branden dagen 0, 7, 21 en 42. Het resultaat toonde een lichte stijging in de bacteriële cel aantallen waargenomen tussen na branden dag 0 en 21 gevolgd door een aanzienlijke stijging op na branden dag 42 (Figuur 5). Dit resultaat suggereert dat het model van de varkens van ernstige branden letsel vastgesteld in deze studie kon worden gebruikt om de klinische prestaties van experimentele dressings, met inbegrip van antibacteriële eigendom te bewaken.
Figuur 1. Branden van de oprichting van de wond en de toepassing van een CAPS-bevattende klinische dressing. Na verwijdering van het laserhaar en voorbereiding van de huid met jodium en alcohol, (A) chirurgische markering pen werd gebruikt om een overzicht van zes cirkels op het dorsum, beide zijden van de middellijn. (B) de gewijzigde ijzer was gevuld met glycerine en een elektronische thermometer ingevoegd glycerine te tonen van de temperatuur. (C) het ijzer wordt verhit tot 137-139 ° C met een warmhoudplaat, en zes uniforme brandwonden zijn gemaakt op de merken van de huid. Als u brandwonden maakt, plaatst u het hete ijzeren met geen externe kracht op van het zwijn terug huid (30 seconden) te maken van twee full-dikte wonden. (D) nadat alle wonden gemaakt waren, waren de wonden gewassen met zoutoplossing 0,9%. (E) de weegschaal stonden naast de wonden voor het nemen van foto's. (F) de eerste laag is bedekt met een dressing van de test en de tweede laag met een waterdichte film. (G) de derde laag is bedekt met het gaas van over 0.5 cm dikte en vaste met papieren rompslomp. (H-J) Beveiligen van de gaas met een buitenste laag van hechtende pleister. Deze laag breidt uit tot de romp om te voorkomen dat de verplaatsing van de dressing. (K) schematisch diagram van de branden wond verdeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Verandering van de grootte van de wond in een varkens-model. (A) het tempo van de wond sluiting werd bepaald als een percentage van de oorspronkelijke wond op dag 0. Wonden had bijna volledig aangegaan op na branden 42 dag, en (B) wijzigingen van het wond gebied werden waargenomen tussen 0 tot en met 42 dagen van een dierlijk model van na branden. Het toont de grootste daling op na branden dag 42, exposeren 90 ± 4% wond gebied sluiting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. De gemiddelde totale scores van Vancouver litteken schaal (VSS) met behulp van een dubbel-blinde experimentele design op branden na dagen in een varkens-model. Litteken beoordeling omvat pigmentatie, vasculariteit, plooibaarheid en hoogte van het litteken. Een lagere score geeft aan het litteken op voorwaarde dat nauw benadert normale huid (P = 0.0005). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. De Haematoxyline en eosine-kleuring op branden na dag 42. (A, B) het zwarte omgekeerde driehoekje geeft aan dat het weefsel van de gerepareerde branden. De morfologie van de wond volledig-dikte was vloeiend, en de papillaire laag leek op kenmerken van hypertrofische littekens. Let op de aanwezigheid van neo-epidermis die betrekking hebben op het wond oppervlak. (B) de rode pijl geeft de dermale bindweefsel-geïnfiltreerd ontstekingscellen in het branden wond eschara boven de levensvatbare dermis hieronder. Oorspronkelijke vergroting × 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. A bar diagram weergegeven: bacteriële tellen van wonden op verschillende tijdstippen. Antibacteriële activiteit voor na burn wond diermodel op 0, 7, 21 en 42 dagen. Antibacteriële activiteit werd beoordeeld door kolonie-vormende eenheden (kve) assay in drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie een varkens-model van ernstige branden letsel vastgesteld en onderzocht het model met behulp van een dressing CAPS-bevattende. Onze resultaten suggereren dat deze varkens-model kan worden gebruikt voor het controleren van de klinische prestaties van experimentele dressings, met inbegrip van antibacteriële eigendom. Wond genezing tarief, de wond sluiting, en de antibacteriële activiteit zijn ook geanalyseerd met behulp van VSS, H & E kleuring en antibacteriële test. Het gebruik van dierlijke burn modellen is ontwikkeld als een waardevol instrument te herzien van de pathofysiologie van schade van de branden. Er zijn bepaalde biologische voordelen van het gebruik van ratten als experimentele onderwerpen, met inbegrip van het hoge aantal rat-specifieke reagentia en de praktische aspecten van het verkrijgen van transgene ratten, aan het ontdekken van de moleculaire signaalroutes actief in het herstel proces. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van ratten in een dierlijke branden model is echter niet volledig onderlinge aanpassing van de menselijke wond genezingsproces. Opnieuw epithelialization is de belangrijkste helende aanpak waargenomen in mens8, terwijl wond genezing bij ratten sterk afhankelijk is van wond contractie in een snelle manier9. Bovendien, de niet-kwetsbaarheid van ratten aan hypertrofische of keloïde littekenvorming bevestigd het voorbeeld van hun herstelproces van de wond van die van de mens. Aan de andere kant, varkens geworden onlangs het onderwerp van onderzoeker aandacht omdat hun huid architectuur vergelijkbaar met die van menselijke huid is. Bovendien, de wond genezingsproces bij varkens en mensen vindt plaats via fysiologisch soortgelijke fasen, zoals ontsteking, proliferatie, opnieuw epithelialization en remodeling. In het algemeen brandwonden in varkens genezen door 21 dagen, met nieuwe epithelialization die zich tussen 7 en 14 dagen na opgerolde geklutste10,11, die bij de tijdlijnen passen waargenomen bij de mens. Varkens Toon ook meer morbiditeit vergelijken aan de ratten als gevolg van hun lichaamsgrootte dat meer resistent maakt tegen de wond van de infectie. Muizen zijn meestal het eerste model gebruikt om te evalueren van branden wond voorwaarden onder verschillende behandelingen. Bovendien, in tegenstelling tot andere zoogdieren deelgenoot varkens maken van een aantal anatomische en fysiologische kenmerken van mens met betrekking tot het proces van angiogenese, epithelialization en cellulaire proliferatie. Dit maakt varkens potentieel een beter model, en ze worden vaak gebruikt in latere studies die aangetoond veelbelovende resultaten in muizen 12,13,14,15. Bovendien, de verdeling van dermale collageen en elastische inhoud, cutane bloedtoevoer, de opeenvolging van gebeurtenissen in de wondgenezing en opnieuw epithelialization hebben gemaakt de varkens een standaardmodel voor wondgenezing en reconstructieve chirurgische behandelingen15 ,16,17,18. Binnen elk dier, er waren zes brandwonden, gelegen op de bovenste, middelste en lagere terug van de varkens en symmetrisch verdeeld aan de wervelkolom. Brandwonden kunnen worden gemaakt op de soortgelijke plaatsen, maar op verschillende varkens. Daarom kan elke experimentele dressing worden getest en geëvalueerd in verschillende locaties om te minimaliseren van bias aan het genezingsproces gewikkeld in verschillende plekken op het varkens dorsum gerelateerde. Bovendien, dit model van de varkens van ernstige branden letsel vastgesteld in deze studie ook profiteert ervoor te zorgen dat elke varkens dient als haar eigen controle met een wond ontvangende roman behandeling en anderzijds als voertuig controle, leidt tot een aanzienlijke vermindering van de het aantal dieren.
Het beheer van de brandwonden is een van de belangrijkste complicaties bij wondgenezing. De menselijke genezingsproces bestaat uit vier biologische processen: hemostase, ontsteking, proliferatie en rijping. Zodra het genezingsproces is gestoord of achterlijk, bevordert het een fibroblastic proliferatie die in een hypertrofische litteken, dat is zichtbaar en heeft de neiging resulteert te worden gesteld boven de omliggende huid16. Reproduceerbaarheid en nauwkeurige kwantificering te garanderen, moet voldoende hechting met behulp van zelfklevend gips onmiddellijk na de schade tot een minimum beperken van de vertraging in de tijd. Cutane irritatie is een gemeenschappelijke reactie van hechtende pleister die in een uitslag rond de klinische dressing resulteert. Voorzichtigheid is dus aangeraden in het gebruik van beschikbare hechtende pleister om te voorkomen jeuk. Volgend op aseptische technieken en grondig ontsmetten van alle apparatuur (bijvoorbeeld, remklauw) om te voorkomen dat kruisverontreiniging tussen de zwijnen zijn absoluut noodzakelijk.
Branden wond genezing is een ingewikkeld proces. Een aantal factoren zijn geïdentificeerd als u wilt dat een negatieve invloed op de wond genezingsproces zoals pijn, jeuk en bacteriële besmetting. Pijn heeft een negatief effect op het dier het dieet. Zonder voldoende opname van de voedingsstoffen is vertraagde wondgenezing onvermijdelijk. Dus, elke varkens werd geïnjecteerd met buprenorfine (0,1 mg/kg, IM) dagelijks gedurende 7 opeenvolgende dagen om pijn te verminderen. Inname van voedsel werd een week na het branden wond creatie gecontroleerd. Zodra een afname van de voedselinname werd waargenomen op dag 7, buprenorfine (0,1 mg/kg, IM) administratie werd voortgezet tot en met dag 14. Bacteriële infectie, die een potentieel gevaar voor wondgenezing, kan leiden tot ontstekingen en verdere temperen het genezingsproces. Klinische dressings waren daarom bedekt met waterdichte films te voorkomen en mogelijke besmetting te minimaliseren. Jeuk is een ongemakkelijk deel van de wond genezingsproces. Varkens kunnen hun eigen rug krabben op de grond tot het verminderen van de jeuk, die ongunstig voor wond genezing proces kan zijn. Een goede dressing beschikt over de eigenschappen van een versnelde burn wond genezing met een aanvaardbaar litteken, preventie van infecties en ontstekingen, verlichten van de pijn en toelaat gemakkelijk en vroege mobilisatie19,20. De dressing kan worden verwijderd wanneer dit nodig is voor verdere actuele toepassingen en/of meting van het wond gebied21,22. Hoewel het toepassen van een vier-laags klinische dressing op een zwijn een meer gecompliceerd en tijdrovend proces dan klinische is, kan varkens model nauwere onderlinge aanpassing aan een menselijke biologische reactie dan muismodel. De vele potentiële voordelen van het gebruik van varkens model maken het een beter platform voor preklinische testen dan andere soorten.
De klinische werkzaamheid van wond sluiting efficiëntie en wond gebied vermindering werd gecontroleerd met behulp van een CAPS-bevattende dressing dat bleek een 73.43±6.33% wond sluiting op na branden dag 42. Bovendien, de VSS-score, een gevalideerde subjectieve schaal-score, werd ook gebruikt voor het beoordelen van wonden in varkens in deze studie17. Het is belangrijk om te controleren van hypertrofische littekenvorming tijdens behandeling met experimentele dressings, met name in klinische proeven18. Toepassing van CAPS in de behandeling van brandwonden resulteerde in een significante verandering in VSS scores op na branden dag 42 vergeleken met de scores op dag 21. Een lagere score geeft aan dat de gewonde gebied probeert te herstellen tot een toestand die nauw bij benadering normale kleur huidpigmentatie, vasculariteit, plooibaarheid en hoogte. Bovendien, de resultaten van de H & E kleuring aangegeven een intact stratum corneum laag op het gebied van CAPS-behandeld. Dit resultaat stelt dat het model van de varkens van een ernstige burn schade op betrouwbare wijze kan worden gebruikt om te evalueren van de wond gebied, de wond sluiting, de VSS score, en de genezing vooruitgang.
Dit protocol vertegenwoordigt de talrijke gedetailleerde stappen voor het aantonen van het gebruik van een experimentele dressing op een model van de varkens van ernstige branden letsel en kan worden toegepast op de evaluatie van alle types van klinische dressing. Een gemodificeerde soldeerbout gevuld met 50 mL glycerine is geschikt voor de handhaving van de temperaturen binnen 137 tot 139° C tijdens het creatieproces wond. Deze methode heeft echter beperkingen zoals onvermogen om na te bootsen absoluut de echte branden temperatuur en de beperktheid van het gebied van de branden gemaakt als gevolg van het toepassingsgebied van de soldeerbout. Echter, de belangrijkste voordelen van de methode die beperkingen te overwinnen. Deze gewijzigde ijzer kan maken van consistente wonden met nauwkeurigheid en gemak in vergelijking met de traditionele methoden worden gebruikt. Dit model biedt bovendien een gevoelige maat voor de fysiologische en pathofysiologische reactie van een thermische brandwond schade onder de behandeling van verschillende klinische dressings. Het voordeel van de voorgestelde model, naast de economische voordelen, is dat het makkelijk kunnen worden verwerkt door mensen met relatief weinig chirurgische ervaring. De toepassing van de klinische dressing op de wonden in de varkens-model bootst de biologische processen van menselijke wondgenezing. Dus, het model van de varkens van ernstige branden letsel vastgesteld en getest met klinische dressing in deze studie vergemakkelijkt de ontwikkeling van nieuwe behandeling voor schade van de branden. Deze studie biedt cruciale hulpmiddelen om de pathofysiologie van branden wondgenezing bloot te leggen. Ter afronding: dit model varkens voorziet een easy-to-learn, kosteneffectieve en robuuste methode voor de beoordeling van het effect van klinische dressings in ernstige branden letsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Tri-Service General Hospital; National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan (meeste 106-2314-B-016-014); en de National Defense Medical Center (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sedation: | |||
| Ketamine | Merial | 2528 ESP | 10 mL vial |
| Azaperone | China chemical & pharmaceutical | 47W406 | 100 mL vial |
| Atropine | Oriental chemical works | IN120802 | 1 mL vial |
| Anesthetic: | |||
| Tiletamine+Zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Isoflurane | Baxter | N002A225 | 100 mL vial |
| Surgery: | |||
| Hair clippers | Moser | - | - |
| Povidone iodine scrub solution | Ever star | HA161202 | 4 L barrel |
| Modified iron | - | - | - |
| 0.9% saline solution | CHI SHENG | KC130 | 500 mL vial |
| Gauze | China Surgical Dressings Center | MO15900080 | 10 x10 cm |
| CAPS | CoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan | - | - |
| Paper tape | 3M | NDC-8333-1530-01 | 2.5 cm x 9.1m |
| Waterproof film | 3M | NDC-8333-1600-40 | 10 cm x 10 m |
| Adhesive plaster | Young chemical | BH1426015 | 10 cm x 10 m |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (14 cm) | Shinetec instruments | ST-S114 | - |
| Halstead-Mosquito (12.5 cm) | Shinetec instruments | ST-H012 | - |
| Handle(# 4) | Shinetec instruments | ST-H004 | - |
| Surgical Blade(#21) | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml Plastic centrifuge tube | Falcon | 352070 | - |
| 10% neutral buffered formalin | Leica | 3800604EG | - |
| Bacterial Growth Experiments | |||
| Blood agar plate (BAP) (TSA with 5% sheep blood) | CMP | - | 90 mm Mono |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
- Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
- Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
- Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
- Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
- Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243 (2015).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8 (2011).
- Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
- Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327 (2015).
- Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
- Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
- Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
- Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
- Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174 (1991).
- Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).
