Summary
כדי מקרוב מחקים המצב של פציעות לשרוף מחייבת יחסי הגומלין בין תצפיות קליניות מחקרים בבעלי חיים. במחקר זה, מודל החזירים של פציעה חמורה צריבה הוקמה כדי להעריך ההלבשה ניסיוני ב הגדרות פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological.
Abstract
ריפוי הפצע הוא תהליך דינמי תיקון והוא תהליך ביולוגי המורכבים ביותר בחיי האדם. בתגובה לשרוף פציעה, שינויים מסלולים ביולוגיים לפגום התגובה דלקת, וכתוצאה מכך ריפוי הפצע מושהית. ריפוי פצעים לקוי לעתים קרובות מתרחשת בחולים עם סוכרת מובילה לתוצאות שלילי כגון קטיעה. לפיכך, רטבים יש השפעה מיטיבה בקידום לצרוב את הפצע תיקון נחוצים. עם זאת, מחקרים על צריבה בפצע טיפול מוגבלות בשל חוסר מודלים בעלי חיים נאותה. המחקר הקודם שלנו הפגינו ביצועים ריפוי פצע במודלים עכברים וחזירים בטכניקה כירורגית פולשנית. מחקר זה נועד להדגים מודל החזירים של פציעה חמורה צריבה המבטל את הפצע התכווצות, יותר מקרוב קירוב התהליכים האנושיים של epithelialization מחדש, היווצרות רקמה חדשה. פרוטוקול זה מספק הליך מפורט עבור יצירת פצעים כוויות עקבי ובודקים את הביצועים, ריפוי פצע תחת הטיפול ההלבשה ניסיוני במודל של החזירים. פצעים כוויות שישה נוצרו באופן סימטרי dorsum, אשר היו מכוסים קליניים ההלבשה המורכבת של ארבע שכבות: שכבת הקשר הפנימית של חומרים ניסיוניים, שכבת ביניים הפנימי של הסרט עמיד למים, ביניים שכבה חיצונית של גזה שכבה חיצונית של טיח דבק. עם השלמת הניסויים, נבחנו סגירת הפצע אזור הפצע, ונקובר הצלקת סרגל ניקוד. הדגימות של העור resected מההקרבה שלאחר כל בעלי חיים הוכנו בהיסטולוגיה, צבעונית באמצעות hematoxylin אאוזין מכתים. אנטיבקטריאלי של כל ההלבשה בהקשר של ריפוי הפצע גם נבדק. היישום של הרוטב קליניים לפציעות במודל החזירים מחקה את התהליכים הביולוגיים של ריפוי לגבי התהליכים של epithelialization, התפשטות הסלולר אנגיוגנזה הפצע האנושי. לכן, מודל חזיר זה מספק שיטה קל ללמוד, חסכונית, וחזק כדי להעריך את ההשפעה של רטבים קליניים בפציעה חמורה צריבה.
Introduction
פגיעה צריבה יוזם תהליך דלקתי ומשרה מורכב אפקטים פתולוגיים, אשר משפיעים על תפקודי גוף רבים מיד לאחר תאונה, וכתוצאה מכך השפעה שלילית על איכות החיים של המטופלים. ריפוי פצעים לקוי גורם משמעותי התחלואה והתמותה בקרב חולים עם סוכרת1,2. רוב החולים עם פציעות לשרוף לחוות כאב במהלך הצריבה הפצע הטריה, הידוע בשם תהליך התופת למרות השימוש של משככי כאבים אופיואידים חזק3.
בניגוד יונקים אחרים, החזירים לשתף מספר מאפיינים אנטומיים, הפיזיולוגיות עם בני האדם לגבי התהליך של epithelialization, התפשטות הסלולר אנגיוגנזה. זה גורם החזירים מודל פוטנציאלי טוב יותר עבור פרוצדורות של מחקרים מסוימים, הם משמשים לעתים קרובות מחקרים מאוחרים יותר הראו תוצאות מבטיחות בעכברים. תכונות אלה הובילו השימוש הגובר החזירים כמינים העיקריים בבדיקות פרה. לאחרונה, עלייה מהירה המחקר הביו-רפואי עם כבוד אל הלב וכלי הדם, השתן, הכסות, מערכות העיכול נצפתה4,5,6. מחקר זה נועד להמחיש מודל החזירים של פציעה כוויות חמורות מבטלת את הפצע התכווצות ומספק הערכה קרובה יותר של תהליכי ריפוי הפצע האנושי ואת היווצרות רקמה חדשה. פצעים כוויות שישה נוצרו באופן סימטרי על dorsum, שלוש בכל צד של עמוד השדרה של החזירים. בשלב הבא, הלבשה anexperimental נבדקה במודל החזירים של פגיעה כוויות חמורות, אשר ניתן להתאים כדי לשכפל ריפוי הפצע האנושי (איור 1). הפצעים היו מכוסים ההלבשה קליני, המורכב משילוב של ארבע שכבות: שכבת הקשר הפנימית של חומרים ניסיוניים, שכבת ביניים הפנימי של הסרט עמיד למים, ביניים שכבה חיצונית של גזה, שכבה חיצונית של טיח דבק. סרט עמיד למים שומר על הסביבה הפצע לח תוך מניעת זיהום חיידקי ומאפשר גזים לחלחל את הרוטב. השכבה החיצונית ביניים של גזה היה מוחל על הסרטים עמיד למים, מאובטח על ידי שכבה חיצונית של טיח דבק. בתום הניסויים, נבחנו סגירת הפצע אזור הפצע, ציון גודל הצלקת ונקובר (VSS). הדגימות של העור resected מההקרבה שלאחר כל בעלי חיים הוכנו בהיסטולוגיה והמוכתמות באמצעות hematoxylin מכתים אאוזין (הוא). אנטיבקטריאלי של כל ההלבשה בהקשר של ריפוי הפצע נבדק גם במודל זה. המחקר הקודם שלנו הוכיחה ריפוי פצע ביצועים במודל עכברים וחזירים באמצעות טכניקה כירורגית פולשנית7. היות שלא היו שש לשרוף פצעים על dorsum בתוך כל החזירים, כל ההלבשה ניסיוני היה נבדק, מוערכות כל העמדות כדי למזער את הטיית הקשורים פצע את תהליך הריפוי במקומות שונים על dorsum החזירים. לכן, הדגם החזירים של פציעה כוויות חמורות הוקמה במחקר זה מספק גישה חדשה על ההערכה של רטבים קליניים ואסטמה ומקילה על ההתפתחות של טיפול הרומן על הפגיעה צריבה. מחקר זה מספק כלי חיוני לחשוף הפתופיזיולוגיה של כוויות ריפוי הפצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה-המרכז הרפואי של הביטחון הלאומי, טייוואן (R.O.C). מחקר זה נערך במרכז חיות מעבדה במרכז הרפואי הביטחון הלאומי. חזיר במשקל בין 20 ל 25 ק ג יש כבר בהצלחה שעברו אינסטרומנטציה באמצעות פרוטוקול זה.
1. עיבוד של החיות לטיפול אנושי
- לאחר ההגעה במתקן, בית החיות solitarily אבל לתת להם לתקשר אחד עם השני.
- לספק החיות גישה ad libitum מזון ומים.
- חבל החזירים טיפול אנושי, תחבורה מהמתקן חיות למעבדה ניסיונית ע י טיפול החיה לפחות פעם ביום במשך שבוע אחד.
- מהר החיה לפחות 12 שעות לפני ניתוח למניעת בחילות והקאות, השאיפה של נוזלים בבטן.
2. הרגעה
- לפני הבריאה צריבה פצע, תרופת הרגעה לבעלי חיים באמצעות זריקה תוך ורידי עם Zoletil 50 (25 מ ג/ק ג).
3. צנרור ואוורור
- במקום החיה על השולחן ו/או עגלה בעמדה בחזה ובצלעות.
- פתח את הפה של החיה עם מפזר דרך הפה.
- במקרה של הרפיה לא מספיקות של הלסתות או נוכחות של בליעת רפלקסים, אשר לעכב צנרור, המסכה החזיר עם איזופלוריין לזירוז הרגעה.
- לפקח על לחץ הדם, קצב הלב, טמפרטורת הגוף על-ידי צג אותות פיזיולוגיים במהלך הניתוח כדי למנוע סיבוכים פוטנציאליים.
4. הרדמה
- זירוז ולשמור על הרדמה; רצוי עזים ומתנגד החיה באמצעות זריקה תוך שרירית של tiletamine ו- zolazepam (25 מ ג / ק ג + 25 מ"ג / ק"ג).
- לצנרר את החיה עם הצינור אנדוטרכאליות בעת הרפיית שרירים, מאופיין על ידי אובדן של הלסת הטון, palpebral reflexed, נצפתה.
- לשמור על כולכם חזירים במצב הרדמה בקביעה מכשיר אידוי של 0.5-2.5% (v/v) איזופלוריין עד הסוף של הניתוח.
- לבחון את העומק של הרדמה על ידי בדיקות רפלקסים כאב עם קמצוץ הבוהן רגל לפני הניתוח. כאשר יש צורך, להוסיף הרדמה נוספים או לחכות כמה דקות. בדוק רפלקסים כאב באופן קבוע לאורך כל הניתוח.
5. עיקור של האתר כירורגית
- לגלח, לנקות את העור של החיה על פני שטח של-25 ס מ רוחב עמודה השדרה כל הדרך עד השחי משני הצדדים.
- לשפשף את העור לחות עם povidone יוד סקראב (75 מ"ג/מ"ל) במשך כ 5 דקות.
- הסר את הסבון povidone יוד העור בעזרת פדים סטרילית רטובה.
- לחטא את העור עם povidone-תמיסת היוד (100 מ"ג/מ"ל).
- מכסים את החיה עם וילונות כירורגי סטרילי כדי לצמצם העברת חיידקים וזיהום עוקבות של האתר כירורגית.
6. לצרוב את הפצע הבריאה
- השתמש בעט סימון כירורגי לסמן את המרכז של שישה פצעים כוויות באופן סימטרי על dorsum של החזיר. ודא כי המרחק בין כל פצע כוויה לפחות גדול מהרדיוס של הפצע (איור 1 א').
- למלא במלחם ששונה 50 מ של גליצרין, להכניס אותו כדי לנטר את הטמפרטורה של מד טמפרטורה אלקטרונית. הברזל חם הנו אזור שטוח של 9 ס מ2 (איור 1B).
- לחמם את הברזל עד 137-139 ° C עם צלחת חמה (איור 1C).
- ליצור פצעים כוויות אחיד 6 על-ידי הצבת את המגהץ על האזור המסומן מבלי להחיל כל כוח למשך 30 שניות (איור 1C).
- לשטוף את פצעי כוויה עם 0.9% תמיסת מלח (איור 1D).
- למדוד את ממדי הפצע ולהקליט את הפצע על ידי photomicrography (איור 1E).
7. הכנת רטבים
- לכסות את הפצע כל השכבה הקשר הפנימית של ארבע-שכבה ההלבשה קליניים באמצעות מגע ישיר. שכבה זו, להשתמש כמוסות המכילות ההלבשה או חומרים חלופיים (איור 1F).
- להחיל סרט עמיד למים על גבי הרוטב קליניים כדי לשמש מחסום נגד חיידקי חדירה (איור 1F).
- לכסות את כל הפצע עם גזה (0.5 ס מ עבה) ותקן עם קלטת נייר כדי לשמש שכבת אמצע של הרוטב (איור 1 ג'י).
- אבטח את הגזה עם שכבה חיצונית של טיח דבק. הרחבת שכבה זו כדי הטורסו להימנע העקירה של הרוטב (איור 1 H-1J).
8. פוסט-לצרוב טיפול ומדידה
- להחדיר את החזיר. הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג, IM) לניהול כאב עבור כל ה' 8-12, החל לפני ההתאוששות מן ההרדמה, שבוע אחד להפחית את הכאב פוטנציאליים.
- לאפשר גישה חופשית חזיר להאכיל ולהשקות.
- לשנות את הכתמים קליני כל יומיים עבור 10 הימים הראשונים ואז פעמיים בשבוע למשך 6-השבוע ללמוד.
- לנקות ולמדוד את הפצעים לפני החלת רטבים קליניים. לניהול חומרי הרדמה במהלך שינויים ההלבשה.
- להקליט את הפצע על ידי photomicrography להשוואה של שיעור ריפוי הפצע כל יומיים עבור 10 הימים הראשונים ואז פעמיים בשבוע למשך 6-השבוע ללמוד.
- לחשב את הפצע מחדש epithelialization או התכווצות כאחוז מגודל הפצע המקורי לפי שיטה שתואר לעיל. הניתוח של סגירת הפצע נערך באופן פעמיים עיוור.
- למדוד את הצלקת צריבה באמצעות VSS, אשר מורכב של ארבעה משתנים: vascularity, גובה (עובי), גמישות, פיגמנטציה בימים שלאחר צריבה 0, 7, 21, ו- 42. כל משתנה יש ציונים אפשריים ארבע עד שש. סה כ ניקוד נעה בין 0 ל 14, לפיה ציון 0 משקף עור רגיל.
9. התפתחות חיידקים ניסויים של רקמות לאחר הצריבה
- לנקות את הפצע לבדיקת אנטיבקטריאלי בימים שלאחר צריבה 0, 7, 21, ו- 42.
- למקם את הספוגית 100 מ של תמיסת סטרילית 0.9% ובעדינות מערבולת כדי להשיג השעיה הומוגנית.
- באופן סדרתי לדלל את homogenate (10− 1–10−5), צלחת 100 μL של כל דילול בתקשורת סלקטיבית, nonselective, בהתאמה.
- תקופת דגירה דילולים כל בתנאים אירוביים ב 37 מעלות צלזיוס של 24-72 שעות.
- צלחת aliquots triplicate של μL 10 בכל מכל כל דילולים על גבי צלחת אגר דם בתוספת דם כבשים 5% כדי לבודד אורגניזמים גראם חיוביים אירובית.
- דגירה המדגם על ידי הפצת או לשפוך את הדגימה בצורה אחידה על פני צלחת אגר בן לילה לקביעת מספר המושבה יוצרי יחידות (CFUs).
- קרא את הצלחות לאחר דגירה בין לילה. היפוך צלחת אגר דם של כבשים, לחלק התחתון של המנה ארבעת הרבעים שווים באמצעות סמן סרגל קטן.
- מקם את הצלחת לבמה של מיקרוסקופ לנתיחה ולספור את המושבות על כל צלחת. לפי ההגדרה, מושבה חייב להיות מינימום של 300 CFU כדי ניתן לבצע ספירה.
- לספור מושבות חיידקים בכל אחד משכפל שלוש. חישוב שהערך הממוצע של שלושת משכפל. לקבוע את CFU לכל צלחת על-ידי הכפלת הערך הממוצע הגורם הסופי דילול.
10. המתת חסד, קיבוע הרקמה
- מזריקים לווריד ממנת יתר של סודיום פנטוברביטל המתת חסד פתרון (80-120 מ"ג/ק"ג).
- En bloc לבצע כריתה של צריבה רקמת הפצע כדי לכלול את מערכת השרירים המשמשים כבסיס unwounded הרקמה שמסביב.
- לתקן את הרקמות עם 10% פורמלין במאגר נייטרלי.
- לערבב 10 מ"ל של פורמלדהיד (37%) ב- 90 מ של פתרון פוספט buffered (PBS) וחנות 4 ° C.
- העברת רקמות מקבע ו מערבולת המיכל על מנת להבטיח שלכל רקמות שקועים לחלוטין לשבועיים. היקף מקבע חייב להיות 30 פעמים האחסון רקמות.
- את רקמות בן לילה-הלעפה תרוטרפמט 4.
- מייבשים רקמות עם אתנול, להטביע לגושי פרפין. בצע את הפעולות הבאות ב- 4 הלעפה תרוטרפמט מטרף.
- לשטוף פעמיים עם PBS במשך 30 דקות.
- מייבשים רקמות עם אתנול 70% עבור 8 שעות, 80% אתנול בן לילה, 95% אתנול במשך 8 שעות, ולאחר מכן ב- 100% אתנול בן לילה.
- דגירה רקמות אתנול 100% 8 שעות נוספות.
- דגירה רקמות שלושה שינויים של קסילן כל 30 דקות.
- החלף את קסילן שעווה מומסת טרי (52 ° C), דגירה ב 52 ° C בתנור במשך שעה.
- להחליף השעווה שעווה טריים דגירה ב 52 ° C בתנור במשך 3 שעות, להחליף עוד פעם ואז דגירה ב 52 ° C בלילה.
- דגירה רקמות עם שני שינויים נוספים של שעווה בכל למשך שעה, ולאחר מכן להטביע את הרקמה ולאחסן ב 4 º C.
- לחתוך כתם הסעיפים פרפין-מוטבע עם הוא, ואתה באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ אור עם 100× ההגדלה.
- ליצור מקטעים הפרפין באמצעות של מיקרוטום רוטרי.
- Dewax מקטעים עם שלושה שינויים של קסילן כל 3 דקות.
- נוזלים ברקמות עם 100%, 95%, 80%-70% אתנול כל 3 דקות ולאחר מכן לטבול במים מזוקקים.
- כתם עם hematoxylin למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים ברז זורמים.
- להבדיל עם 0.1% חומצה הידרוכלורית אתנול למשך 5 דקות, לשטוף במי ברז.
- כתם עם 0.5% אאוזין במשך דקה אחת.
- מייבשים רקמות עם 70%, 80%, 95% ו 100% אתנול כל 2 דקות.
- נקה ההכתמה עם קסילן, ויבש בשכונה fume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צריבה משך 30 שניות על ידי ברזל חמה הביא את הפצעים שהיו עגול עם שוליים מוגדרים היטב וחיוור בצורה אחידה עם שפה של אריתמה (איור 1D). בתוך כל בעל חיים, היו שישה פצעי כוויה על dorsum. הסידור של פצעים כוויות תוארה באיור1 K. פצעים כוויות היו מכוסים ברוטב כמוסות המכילות לחלוטין, להשתמש כדי להעריך את העומק של היווצרות צלקת בימים שלאחר צריבה 0, 7, 21, ו 42, epithelialization מחדש, כפי שנקבע על-ידי גרוס פיקוח. צריבה הפצעים היו epithelialized מחדש על סמך בדיקה ברוטו ביום שאחרי צריבה 42. גודל הפצע בבעלי חיים אלה הוערך כדי לקבוע את הפצע ריפוי קצב (איור 2 א). הפצע אזורים היו 9, 10, 8, ו- 3 ס"מ2 בימים שלאחר צריבה 0, 7, 21, ו 42, בהתאמה. ביום שלאחר צריבה 42 לעומת יום 0 נצפתה הפחתה משמעותית באזור הפצע. שיעור הריפוי היה הגדיר את המרחק הגדול ביותר שולי הפצע הממוצע מהמרכז הפצע לחלק את הזמן כדי להשלים את סגירת הפצע. פצעים מטופלים עם כמוסות המכילות ההלבשה הראה סגר הפצע 73.43±6.33% ביום שאחרי צריבה 42 (איור 2B).
איור 3 מראה את התוצאות VSS ביחס vascularity צלקת, גמישות, פיגמנטציה, גובה בימים שלאחר צריבה 0, 7, 21, ו- 42. התוצאה VSS לשיאה ב- 7.4±0.5 ביום שאחרי צריבה 21, ירד ל 3.33±0.58 ביום שאחרי צריבה 42.
כל החיות הוקרבו ביום שאחרי צריבה 42. דוגמאות של העור resected מההקרבה שלאחר כל בעלי חיים היו בהיסטולוגיה מוכן, מוכתם על ידי H & Histologic אי בחינת הדגימות אישר כי הושגו מלא-כוויות, הפצעים הופיעה נרפא לחלוטין (איור 4). נמק הנובע ברנס יכול להיות שנצפו ב האפידרמיס הדרמיס, רכיבים עורי של הפצע מבלי להשפיע באופן משמעותי את השריר שמתחת (איור 4). העובי הדרמיס שמתחת הרוטב ניסיוני היה 5.4 מ"מ (איור 4A). בנוסף, המצב של הסתננות לימפוציטית דרמיס הם נצפו H & E ההכתמה, כפי שמציין החץ האדום 4B איור.
המאפיין אנטיבקטריאלי של הרוטב ניסיוני נקבע שימוש assay CFU בימים שלאחר צריבה 0, 7, 21, ו- 42. התוצאה הראתה עלייה קלה במספרים תא החיידק שנצפה בין הצריבה שלאחר ימים 0 ו- 21 ואחריו עלייה משמעותית ביום שאחרי צריבה 42 (איור 5). תוצאה זו עולה כי הדגם החזירים של פציעה כוויות חמורות הוקמה במחקר זה יכול לשמש כדי לפקח על ביצועי קליני של רטבים ניסיוני, כולל מאפיין בקטריאלי.
איור 1. לצרוב את הפצע יצירה ויישום של ההלבשה קליניים כמוסות המכילות. בעקבות הסרת שיער והכנת העור עם יוד ואלכוהול, עט סימון כירורגי (א) נעשה שימוש כדי לחלק לרמות 6 עיגולים על dorsum, משני צידי הקו האמצעי. (B) הברזל שהשתנה היה מלא גליצרין של מד טמפרטורה אלקטרונית מוכנס לתוך גליצרין כדי להראות את הטמפרטורה. (ג) הברזל הוא מחומם ל 137-139 ° C עם צלחת חמה, צריבה אחידה 6. הפצעים שנוצרו על הסימנים של העור. כדי ליצור פצעים כוויות, במקום הברזל חם עם אין כוח חיצוני על העור בחזרה החזיר (30 שניות) כדי ליצור שני פצעים מלא-עובי. (ד) לאחר כל הפצעים שנוצרו, הפצעים נשטפו עם תמיסת 0.9%. (ה) המאזניים הוצבו ליד הפצעים עבור צילום תמונות. (נ) השכבה הראשונה מכוסה ההלבשה הבדיקה ואת השכבה השנייה עם סרט עמיד למים. (G) השכבה השלישית מכוסה של הגזה על עובי 0.5 ס מ, קבוע עם קלטת נייר. (H-J) אבטח את הגזה עם שכבה חיצונית של טיח דבק. שכבה זו משתרע על הגוף כדי להימנע העקירה של הרוטב. (K) תרשים סכמטי של ההתפלגות צריבה פצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. שינוי גודל הפצע במודל של החזירים. (א) קצב סגירת הפצע נקבע כאחוז של הפצע המקורי ביום 0. פצעים לקה כמעט לחלוטין על צריבה אחרי 42 יום, שינויים (B) של אזור הפצע נצפו בין 0-42 ימים של מודל בעלי חיים post-burn. זה מראה הירידה הגדולה ביותר ביום שאחרי צריבה 42, מפגין 90 ± 4% פצע באזור הסגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3- התוצאות הכוללות ממוצע של ונקובר הצלקת סולם (VSS) באמצעות עיצוב ניסיוני כפול סמיות על פוסט-לשרוף ימים במודל של החזירים. צלקת הערכה כולל פיגמנטציה, vascularity, גמישות, וגובה של הצלקת. ניקוד נמוך יותר מציין את הצלקת על תנאי המעריכה מקרוב עור רגיל (P = 0.0005). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. Hematoxylin ואאוזין מכתים על פוסט-לשרוף יום 42. (A, B) המשולש ההפוך שחור מציין הרקמה צריבה לתיקון. המורפולוגיה של הפצע מלא-עובי הייתה חלקה ורציפה, השכבה papillary דמה תכונות של הצטלקות היפרטרופית. הערה הנוכחות של ניאו-אפידרמיס המכסים את פני השטח של הפצע. (B) החץ האדום מציין עורי חדרה-רקמת חיבור דלקתיות בתאים eschar הפצע הכוויה מעל הדרמיס קיימא להלן. ההגדלה המקורי, × 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. בר מראה הדיאגרמה חיידקית ספירת פצעים בנקודות זמן שונות. אנטיבקטריאלי של post-burn פצע במודל חיה-0, 7, 21, ו- 42 ימים. אנטיבקטריאלי הוערך על ידי המושבה יוצרי assay יחידות (CFU) ב 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי הקימה מודל החזירים של פגיעה חמורה צריבה ובחן את הדגם בעזרת כמוסות המכילות ההלבשה. התוצאות שלנו מראים כי מודל זה חזיר יכול לשמש למעקב אחר ביצועי קליני של רטבים ניסיוני, כולל מאפיין בקטריאלי. ריפוי קצב סגירת הפצע, אנטיבקטריאלי הפצע נותחו גם באמצעות מבחן מוכתמים, ואנטי -בקטריאלי VSS, H & E. השימוש של דגמים בעלי חיים צריבה פותחה ככלי חשוב כדי לסקור את הפתופיזיולוגיה של צריבה פציעה. ישנם יתרונות ביולוגי מסוים של שימוש חולדות נושאים ניסיוני, כולל המספר הגבוה של ריאגנטים ספציפיים עכברוש, בהיבטים של קבלת העכברים הטרנסגניים, לגלות מסלולים איתות מולקולריים פעילים בחדר ההתאוששות תהליך. אולם, החיסרון העיקרי של שימוש חולדות במודל בעלי חיים צריבה היא כשלון משוער לחלוטין את תהליך ריפוי הפצע האנושי. Epithelialization מחדש הוא גישת הריפוי העיקריות הנהוגות בני8, בעוד ריפוי בחולדות חריפה הפצע תלוי הפצע התכווצות באופן מהיר9. בנוסף, הלא-הפגיעות של חולדות ל היפרטרופית או היווצרות צלקת קלואיד אישר את dissimilarity של תהליך ההחלמה שלהם הפצע מזו של בני אדם. מצד שני, החזירים לאחרונה הפכו הנושא של חוקר לב כי הארכיטקטורה העור שלהם דומה לזה של העור האנושי. בנוסף, תהליך החזירים ובבני אדם ריפוי הפצע מתרחשת דרך שלבים דומים מבחינה פיזיולוגית כגון דלקת, התפשטות, epithelialization מחדש, שיפוץ. באופן כללי, כוויות ב החזירים לרפא על ידי 21 ימים, עם epithelialization מחדש המתרחשים בין 7 ל 14 יום גרימת הפצע שלאחר10,11, אשר תתאים צירי הזמן נצפתה אצל בני אדם. החזירים גם להציג השוואה תחלואה רבה יותר לעכברושים עקב גודלם הגוף שגורם עמידים יותר בפני דלקת בפצע. עכברים הם בדרך כלל המודל הראשון המשמשים להערכת לצרוב את הפצע התנאים טיפולים שונים. בנוסף, בניגוד יונקים אחרים, החזירים לשתף מספר מאפיינים אנטומיים, הפיזיולוגיות עם בני האדם לגבי התהליך של epithelialization, התפשטות הסלולר אנגיוגנזה. זה הופך את החזירים שעשויות להיות מודל טוב יותר, הם משמשים לעתים קרובות מחקרים מאוחרים יותר הראו תוצאות מבטיחות עכברים 12,13,14,15. יתר על כן, ההתפלגות של קולגן עורי, אספקת הדם תוכן, עורית אלסטי, רצף האירועים ריפוי הפצע, epithelialization מחדש הפכו החזיר רגיל מודל של ריפוי הפצע וטיפולים שיקומיים כירורגי15 ,16,17,18. בתוך כל בעל חיים, היו שישה פצעים כוויות ממוקם על הגבול העליון, האמצעי, ולא התחתון בחזרה חזיר והופץ באופן סימטרי לעמוד השדרה. ניתן ליצור פצעים כוויות על המיקומים דומה אלא על החזירים שונים. לכן, כל ההלבשה ניסיוני יכול להיות נבדק, הערכה במקומות שונים כדי למזער את הטיית הקשורים פצע את תהליך הריפוי במקומות שונים על dorsum החזירים. בנוסף, מודל זה החזירים של פציעה כוויות חמורות הוקמה במחקר זה נהנה גם להבטיח כי כל החזירים משרתת גם את שליטתה עם אחד פצע המקבל טיפול חדשניים והשני כפקד הרכב, המוביל לירידה משמעותית מספר בעלי חיים.
הנהלת בפציעות לשרוף הוא אחד הסיבוכים העיקריים בריפוי הפצע. בתהליך הריפוי האנושי מורכב ארבעה תהליכים ביולוגיים: hemostasis, דלקת, התפשטות, ההבשלה. לאחר תהליך הריפוי הוא מופרע או מפגר, זה מקדם התפשטות fibroblastic שתוצאתו צלקת היפרטרופית, אשר נראה לעין, נוטה להיות מוגבה מעל ה-העור שמסביב16. כדי להבטיח הפארמצבטית כימות מדויק, נדרש אדהזיה נאותה באמצעות טיח דבק מיד לאחר הפגיעה כדי למזער את ההשהיה בזמן. גירוי עורית היא תגובה נפוצה של טיח דבק, שתוצאתו פריחה מסביב הרוטב קליניים. לפיכך, זהירות מומלץ בשימוש של טיח דבק זמין כעת כדי למנוע גירוד. בעקבות טכניקות aseptic וחיטוי ביסודיות כל הציוד (למשל, caliper) כדי למנוע זיהום צולב בין החזירים הם חובה.
ריפוי פצע כוויה היא תהליך מורכב. זוהו מספר גורמים יש השפעה שלילית על תהליך כגון כאב, גירוד, זיהום חיידקי ריפוי הפצע. כאב יש השפעה שלילית על הדיאטה של בעל החיים. ללא ספיגת התזונתי מספיקות, ריפוי הפצע המושהה הוא בלתי נמנע. לכן, כל החזירים הוזרק עם. הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג, IM) מדי יום 7 ימים רצופים להפחית את הכאב. צריכת המזון היה פיקוח שבוע לאחר הכוויה פצע הבריאה. לאחר ירידה צריכת המזון נצפתה ביום 7, הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג, IM) המינהל היה נמשך עד היום ה-14. זיהום חיידקי, המהווה סיכון פוטנציאלי לריפוי הפצע, עשויים לעורר דלקת, בהמשך לצנן את תהליך הריפוי. לכן, רטבים קליני היו מכוסים סרטים עמיד למים כדי למנוע ולצמצם את זיהום פוטנציאליים. גירוד הוא חלק תהליך ריפוי הפצע לא נוח. חזיר יכול לגרד את הגב שלהם על הקרקע כדי להפחית את הגירוי, אשר יכול להיות שלילי עבור תהליך ריפוי הפצע. ההלבשה טובה בעלת התכונות של האצה צריבה פצע ריפוי עם צלקת מקובל מניעת זיהום ודלקת, שיכוך כאב, המתיר גיוס קל ותחילת19,20. הרוטב ניתן להסיר כאשר הדבר נדרש עבור יישומים אקטואליים נוספות ו/או מדידה של הפצע אזור21,22. למרות החלה ההלבשה קליניים ארבע-שכבה על חזיר הוא תהליך מסובך יותר וצורך יותר קליני, החזירים המודל מאפשר קירוב קרובים יותר להיענות הביולוגי האנושי מאשר במודל עכבר. יתרונות פוטנציאליים רבים באמצעות מודל החזירים הופכים אותו לפלטפורמה יותר לבדיקת פרה מאשר מינים אחרים.
היעילות הקלינית במונחים של הפצע סגירת הפצע ויעילות אזור הפחתה היה פיקוח באמצעות כמוסות המכילות ההלבשה שגילה סגר הפצע 73.43±6.33% ביום שאחרי צריבה 42. יתר על כן, התוצאה VSS, ניקוד המאומת בקנה מידה סובייקטיבי, שימש גם להעריך את הפצעים החזירים הזה המחקר17. חשוב לעקוב אחר היווצרות צלקת hypertrophic במהלך הטיפול עם רטבים ניסיוני, בפרט ניסויים קליניים18. יישום של כמוסות לטיפול פצעי כוויה הביא שינוי משמעותי VSS עשרות ביום שאחרי צריבה 42 לעומת התוצאות ביום 21. ניקוד נמוך יותר מצביע על שהאזור הפגוע מנסה לשחזר את מצב זה מקרוב משוער פיגמנטציה צבע עור רגיל, vascularity, גמישות, וגובה. בנוסף, התוצאות של צביעת המטוקסילין מצוינת בשכבת הקרנית ללא פגע באזור שטופל כמוסות. תוצאה זו עולה כי המודל החזירים של פציעה חמורה צריבה יכול לשמש באופן אמין כדי להעריך את אזור הפצע, סגירת הפצע, VSS הציון, והתקדמות הריפוי.
פרוטוקול זה מייצג את השלבים המפורטים רבים על הפגנת את השימוש רוטב ניסיוני על מודל החזירים של פציעה חמורה צריבה, ניתן ליישם את ההערכה של כל סוגי הלבשה קליניים. במלחם ששונה מלא 50 מ של גליצרין הוא מסוגל שמירה על הטמפרטורה בתוך 137-139° C במהלך תהליך היצירה הפצע. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות כגון חוסר יכולת לחקות לחלוטין את טמפרטורת כוויה אמיתי, צרות אזור הכוויה שנוצרה עקב היקף מלחם. עם זאת, היתרונות העיקריים של השיטה להתגבר על מגבלות אלה. ברזל ששונה זה יכול לשמש כדי ליצור פצעים בקנה אחד עם הדיוק וקלות בהשוואה לשיטות מסורתיות. יתר על כן, מודל זה מספק מדד רגיש של התגובה פיזיולוגיים, הקשורים pathophysiological של פציעה לכוויה התרמית תחת הטיפול של רטבים קליניים שונים. היתרון של המודל המוצע, מלבד היתרונות הכלכליים, הוא כי זה קל להיות מטופלים על ידי אלה עם ניסיון יחסית מעט ניתוחי. היישום של הרוטב קליניים לפציעות במודל החזירים מחקה את התהליכים הביולוגיים של ריפוי הפצע האנושי. לכן, הדגם החזירים של פציעה כוויות חמורות הוקמה ונבדק ברוטב קליניים במחקר זה מקלה על ההתפתחות של טיפול חדשניים עבור צריבה פציעה. מחקר זה מספק כלי חיוני לחשוף הפתופיזיולוגיה של כוויות ריפוי הפצע. לסיכום, המודל החזירים הזה מספק שיטה קל ללמוד, חסכונית, וחזק כדי להעריך את ההשפעה של רטבים קליניים בפציעה חמורה צריבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק של החולים הכללי Tri-שירות; המרכז הרפואי של הביטחון הלאומי, טייוואן (TSGH-C107-042); משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן (רוב-014 106-2314-B-016); ואת המרכז הרפואי הביטחון הלאומי (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sedation: | |||
| Ketamine | Merial | 2528 ESP | 10 mL vial |
| Azaperone | China chemical & pharmaceutical | 47W406 | 100 mL vial |
| Atropine | Oriental chemical works | IN120802 | 1 mL vial |
| Anesthetic: | |||
| Tiletamine+Zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Isoflurane | Baxter | N002A225 | 100 mL vial |
| Surgery: | |||
| Hair clippers | Moser | - | - |
| Povidone iodine scrub solution | Ever star | HA161202 | 4 L barrel |
| Modified iron | - | - | - |
| 0.9% saline solution | CHI SHENG | KC130 | 500 mL vial |
| Gauze | China Surgical Dressings Center | MO15900080 | 10 x10 cm |
| CAPS | CoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan | - | - |
| Paper tape | 3M | NDC-8333-1530-01 | 2.5 cm x 9.1m |
| Waterproof film | 3M | NDC-8333-1600-40 | 10 cm x 10 m |
| Adhesive plaster | Young chemical | BH1426015 | 10 cm x 10 m |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (14 cm) | Shinetec instruments | ST-S114 | - |
| Halstead-Mosquito (12.5 cm) | Shinetec instruments | ST-H012 | - |
| Handle(# 4) | Shinetec instruments | ST-H004 | - |
| Surgical Blade(#21) | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml Plastic centrifuge tube | Falcon | 352070 | - |
| 10% neutral buffered formalin | Leica | 3800604EG | - |
| Bacterial Growth Experiments | |||
| Blood agar plate (BAP) (TSA with 5% sheep blood) | CMP | - | 90 mm Mono |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
- Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
- Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
- Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
- Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
- Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243 (2015).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8 (2011).
- Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
- Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327 (2015).
- Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
- Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
- Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
- Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
- Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174 (1991).
- Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).
