Summary
Denne protokol udgør en enkel og effektiv metode til at isolere, identificere og kvantificere immunceller bosat i myokardiet af mus under steady state eller betændelse. Protokollen kombinerer enzymatiske og mekaniske fordøjelsen for generation af en enkelt cellesuspension, der yderligere kan analyseres ved flowcytometri.
Abstract
Immunsystemet er et væsentligt element i et sundt hjerte. Myokardiet er hjemsted for en rig bestand af forskellige immun celle subsets med funktionel opdeling både under steady state og under forskellige former for inflammation. Indtil for nylig, studiet af immunceller i hjertet krævede anvendelse af mikroskopi eller dårligt udviklede fordøjelsen protokoller, som forudsat nok følsomhed under alvorlig betændelse men var afskåret fra trygt identificere små — men nøgle — populationer af celler under steady state. Her diskuterer vi en simpel metode kombinerer enzymatisk (collagenase, hyaluronidase og DNAse) og mekanisk fordøjelsen af murine hjerter foranstillet intravaskulær administration af fluorescently-mærkede antistoffer til at skelne små men uundgåelige intravaskulær celle forureninger. Denne metode genererer en suspension af isolerede levedygtige celler, der kan analyseres ved flowcytometri til identifikation, fænotyper og kvantificering eller yderligere renset med fluorescens-aktiveret celle sortering eller magnetisk bead adskillelse for transkriptionel analyse eller in vitro- undersøgelser. Vi har et eksempel på en trinvis flow cytometric analyse til at differentiere de centrale makrofager og dendritiske cellepopulationer af hjertet. For en mellemlang mellemstore eksperiment (10 hjerter) kræver afslutningen af proceduren, der 2-3 h.
Introduction
Forskellige former for Myokardie stress eller skade, herunder iskæmisk (iskæmi reperfusion eller myokardieinfarkt) og ikke-iskæmisk (hypertension eller Myokarditis), fremme af ansættelse af inflammatoriske celler med reparative og beskyttende, men også sygdomsfremkaldende egenskaber. Allerede i 1891, beskrevet Romberg først tilstedeværelsen af cellulære infiltrater i myokardiet hos patienter smittet med tyfus og skarlagensfeber1. Men den detaljerede undersøgelse af hjertets immunceller kræves udvikling af mere avancerede Immunofænotypning-teknikker. Som en konsekvens, har først for nylig vi begyndte at forstå, at en forskelligartet befolkning på immunceller med vigtig vedligeholdelse roller under steady state er bosat inden for myokardiet.
Histologi har været og stadig er den mest almindelige metode til at karakterisere hjerte immunceller under betændelse. Men mens histologi repræsenterer et værdifuldt diagnostisk redskab, dets anvendelse i studiet af cardiac immunceller har vigtige begrænsninger. Immunceller bosat i myokardiet repræsenterer en meget lille andel af de samlede celler og er mere eller mindre jævnt fordelt i et forholdsmæssigt enorme rum. Tilsvarende vis flere former for hjerte betændelse, såsom viral myocarditis, fokale mønstre af betændelse. Det betyder, at præcis analyse af immunsystemet af hjertet ofte kræver højere grader af histologiske prøveudtagning, øger omkostningen ved at reducere bias. Derudover giver histologi en meget begrænset mængde brugbar information i celle identifikation (f.eks. antallet af parametre). Med et stadigt stigende antal celle subsets, der kræver brug af flere udtryk markører (herunder celleoverflademarkører, transkriptionsfaktorer eller udskilles molekyler), har flowcytometri etableret sig som den mest kraftfulde værktøj til Immunofænotypning, på grund af lave omkostninger og høj overførselshastighed.
Brugen af Immunofænotypning teknikker er stærkt afhængige af udviklingen af effektiv fordøjelse protokoller, der er tilladt for single-celler analyse af et stort antal celler. Udviklingen af udtømmende protokoller af celle udvinding åbnes et nyt vindue af muligheder i studiet af cardiac immunologi. Gennem kombinationen af fordøjelsen, flowcytometri og transcriptomics, har de store populationer af makrofager og dendritiske celler bosat i hjertet blevet karakteriseret2,3. Den mest rigelige befolkning af cardiac immunceller under steady state er CD64+MerTK+ makrofager, der yderligere kan inddeles baseret på deres udtryk for CCR2 eller CD11c2. CCR2+ makrofager stammer fra voksne knoglemarv bloddannelsen, mens fleste af CCR2- makrofager, der kan udtrykke høje eller lave niveauer af MHC-II, er hovedsagelig af prænatal oprindelse. Makrofager udføre vigtige funktioner såsom reparation4 og fjernelse af vragdele5 under skade eller støtte elektrisk connectivity6 i steady state. Forskellige former for inflammation en vigtig tilstrømning af Ly6CHej MHC-IIlo CD64int monocytter forekomme, som senere differentiere i Ly6CHej CCR2+ makrofager2,7 . En betydeligt mindre, men vigtige, befolkningen i celler bosat i myokardiet af sunde individer er sammensat af dendritiske celler8,9. De to store delmængder af cardiac konventionelle DCs (cDCs) har været for nylig præget: cDC1 (CD103+ DCs) og cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spiller en vigtig rolle i forsvaret mod infektion8 men kan også fremme self-skade under betændelse, især under myokardieinfarkt9.
Her, beskriver vi en simpel metode til dyrkning af levedygtige hjerte immunceller fra musen myokardiet. Metoden kombinerer enzymatiske og mekaniske fordøjelse med en celle-si filtrering for at opnå en enkelt cellesuspension, der kan analyseres, eller yderligere renset af flow flowcytometri sortering eller magnetisk bead berigelse. Præcise målinger af ekstravaskulære Myokardie celler kræver hjerte perfusion for at fjerne eventuelle forureninger fra blodbanen i hjertets microvasculature. Derudover præsenterer vi et valgfrit trin af intravaskulære mærkning af immunceller, der kan bruges til at differentiere yderligere Myokardie celler fra intravaskulær forureninger, baseret på Galkina et al. protokol10. Endelig præsenterer vi en grundlæggende flow flowcytometri analyse for at identificere de store makrofag og cDC delpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: denne protokol har gennemgået og godkendt af Animal Care Udvalget på University Health Network (Toronto, Canada) og er i overensstemmelse med den canadiske Rådet på Animal Care.
1. buffer forberedelse
- Forberede Ulla buffer (Hank's Balanced Salt løsning (HBSS), 2% varme inaktiveret bovint serum, 0,2% bovint serumalbumin). Tilsæt 10 mL af varme inaktiveret bovint serum og 1 g af bovint serumalbumin 500 ml HBSS. Filter sterilisere gennem en 0,2 µm filter og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede FACS buffer (fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 2% varme inaktiveret bovint serum, 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA, pH 8,0)). Tilsæt 10 mL varme inaktiveret bovint serum og 1 mL 0,5 M EDTA til 500 mL PBS. Filter sterilisere gennem en 0,2 µm filter og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
2. mærkning af cirkulerende leukocytter
- Aseptisk forberede anti-mus CD45 injektion med 1 µg antistof fortyndet i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) for en endelige Injektionsvolumen 200 µL/mus. Indlæse volumen i en 28,5 G insulin sprøjte og holde sig væk fra lys.
Bemærk: Brug to forskellige fluorokrom-mærket anti-CD45 antistoffer for at skelne den intravaskulær (farves ved i.v. administration) fra intracardiac farvning (farves efter fordøjelsen; se trin 4). -
Pre varm mus (8-12 uger gamle) ved at udsætte hale til en rød varmelampe i 5 min.
Forsigtig: Ikke overophede dyret. Hold lampen i en sikker afstand (> 30 cm).- Dy dyret i brystbenet holdning ved hjælp af en passende anordning. Udsætte og stabilisere hale med den ikke-dominerende hånd af immobilisere base af halen med indekset og langfinger og midten af distale regionen hale med tommel og ringfinger.
Forsigtig: Gælde ikke for meget kraft på spidsen af halen, da huden kan blive revet. Indsætte nålen med facet opad ind i venen. Holde nålen parallelt vene på alle tidspunkter, da det er let at punktere venen.
Bemærk: Blod ind i sprøjten kan forekomme og er et tegn på en god injektion. Bøjning nålen til en 90° vinkel kan lette i.v. administration. Bekræfte med din sikkerhed kontor som bøjning nåle kan udgøre en fare. - Injicér 200 µL intravenøst i halen vene. Væsken skal flyde let og midlertidigt fjerne venen.
Forsigtig: Tving ikke væske i, hvis modstand er opfyldt. Dette er tegn på forveksling af nålen. - Tillad antistof til at cirkulere i 5 min før humant euthanizing mus.
- Dy dyret i brystbenet holdning ved hjælp af en passende anordning. Udsætte og stabilisere hale med den ikke-dominerende hånd af immobilisere base af halen med indekset og langfinger og midten af distale regionen hale med tommel og ringfinger.
3. hjerte isolere og fordøjelse
-
Aflive mus ved hjælp af CO2 eller af andre institutionelt accepterede eutanasi procedure.
- For CO2 eutanasi, placere musen i CO2 sal og indstille fyld sats til 20% af salen volumen pr. minut (dvs., hvis salen er 10 L, fyld på 2 L/min). Køre for 2 min og dataskærm mus indtil vejrtrækning er ophørt.
- Slukke CO2 og lade musen til en yderligere 1-2 min. sikre vejrtrækning er ophørt før åbning kammeret og udføre en tå knivspids for at bekræfte, at musen er døde før vi går over til at behandle musen.
- Spray mus med 70% ethanol. Løft huden på maven og dissekere musen ved at skære langs den ventrale midterlinjen begyndelsen på niveau med hofterne op til brystbenet. Åbn maven og flytte leveren til at udsætte mellemgulvet.
-
Skære mellemgulvet, så ribben på begge sider af midterlinjen, være omhyggelig med at undgå punktering lungerne og hjertet.
- Expose hjertet af peeling tilbage ribben, så skåret første venstre forkamre efterfulgt af de højre atrier.
FORSIGTIGHED: Vær forsigtig, når skære forkamrene, sikre ingen arterier eller vener er såret, da dette kan mindske effektiviteten af rødmen blodet indeholdt i organer. - Perfuse hjerte med 15-20 mL koldt PBS ved hjælp af en 60 mL sprøjten udstyret med en 21 G kanyle og kolde PBS. Forsigtigt fat i bunden af hjertet med pincet og indsætte nålen ind i venstre hjertekammer nær apex. Gentag proceduren i højre hjertekammer. En ordentlig injektion resulterer i hvide lungerne og bleg leveren.
Bemærk: Perfusion bør udføres inden for 5 minutter efter aktiv dødshjælp for at undgå blodets koagulation, som kan forurene organer af interesse med cirkulerende celler.
- Expose hjertet af peeling tilbage ribben, så skåret første venstre forkamre efterfulgt af de højre atrier.
-
Hold bunden af hjertet med pincet og forsigtigt trække hjertet op, og fjern hjertet ved at skære de store pulmonale arterier og vener, aorta og perikardial sækken.
- Rense hjertet af forsigtigt holde hjertet mellem tommel- og indeks fingre i en ren fnugfri køkkenrulle og trække ud forkamre og resterne af store arterier og vener og eventuelle andre forureninger med pincet.
Bemærk: Sikre helhed af hjertets forkamre er fjernet og ingen andre væv, såsom lungerne eller blodkar, er til stede som disse væv har deres egen bopæl immunceller. Lungerne har især en stor immun celle befolkning, som kan maskere de mindre populationer af dem i myokardiet.
- Rense hjertet af forsigtigt holde hjertet mellem tommel- og indeks fingre i en ren fnugfri køkkenrulle og trække ud forkamre og resterne af store arterier og vener og eventuelle andre forureninger med pincet.
-
Sted midt i en 5 cm plastik fad med 50 µL koldt PBS.
- Hakkekød hjertet med buede dissekere saks, indtil der er ingen synlige stykker og det har en glat konsistens.
Bemærk: Prøv at holde hjertet i et indesluttet i fadet under hakke for at minimere væv tab. - Overfør thetrituratedheart væv ved hjælp af buet pincet til 2 mL microcentrifuge tube med 800 µL koldt Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM).
- Hakkekød hjertet med buede dissekere saks, indtil der er ingen synlige stykker og det har en glat konsistens.
-
Tilføje 450 U/mL ofcollagenase jeg, 60 U/mL af hyaluronidase type I-S og 60 U/mL DNase-I til hver prøve.
- Inkuber prøver ved 37 ° C på en vuggende shaker på 50 rpm i 45-60 min.
-
Efter fordøjelse, kort vortex prøver (20 s) og umiddelbart sted på is til at holde prøver ved 4 ° C.
- Bruger en 1 mL pipette, afpipetteres prøver op og ned indtil vævsprøver er homogen og ikke tilstopper pipette tip.
Bemærk: Fastlæggelse af et bestemt antal gange til afpipetteres kan øge reproducerbarhed. Hvis hjerter ikke er optimalt fordøjet, kan stykker af myokardiet hindre pipetten. Forsigtigt slibning pipette spidsen mod microcentrifuge røret vil hjælpe homogeniseres større stykker af væv.
- Bruger en 1 mL pipette, afpipetteres prøver op og ned indtil vævsprøver er homogen og ikke tilstopper pipette tip.
-
Pre våd en 40 µm celle si placeret på en 50 mL konisk slange med 1 mL koldt Ulla.
- Tilføje homogeniserede prøve at filteret og vaske gennem ved at langsomt hælde koldt Ulla 12 – 14 mL.
- Overføre filtrerede prøver til en mærket 15 mL konisk slange og holde ved 4 ° C.
-
Centrifuge prøver ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C. Opsug off supernatanten.
- Lyse røde blodlegemer ved tilsætning af 1 mL af Ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysisbuffer til hver prøve. Resuspend prøver af vortexing og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Når lysis er færdig, tilsættes 5 – 8 mL af kolde Hank Balanced Salt løsning (HBSS) at stoppe hæmolyse.
- Centrifugeres prøver på 400 x gfor 5 min. ved 4 ° C. Opsug off supernatanten.
- Der tilsættes 1 mL af FACS buffer til hver prøve, som overføres til et mærket 1,5 mL microcentrifuge rør.
Bemærk: Protokollen kan stå i pause her i op til 2 timer med prøver opbevares ved 4 ° C.
4. flow flowcytometri farvning og analyse
-
Centrifuge prøver ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- For at reducere ikke-specifikke antistof bindende, fortyndes 1: 100 anti-CD16/CD32 og monocyt Blocker (1:20) (Se Tabel af materialer) tegner sig for 50 µL FACS pr. prøve. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Forberede antistof fortynding (1:250 for hver antistof) tegner sig for 50 µL af FACS pr. prøve.
Bemærk: En levedygtighed farvestof kan medtages i antistof cocktail for at udelukke døde celler. Alternativt, lille størrelse udelukkelse af flow analyse kan være brugt (figur 1C og D). - Tilsæt 50 µL antistof master mix til hver prøve indsamles og bland uden vask.
- Inkuber prøver ved 4 ° C i 30 min. i mørke.
- Tilføje 600 µL FACS til hver prøve at vaske og centrifugeres prøver ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Opsug off supernatanten og resuspend pellet i 300 µL FACS. Holde prøver ved 4 ° C i mørke.
Bemærk: Nogle levedygtighed farvestoffer, såsom DAPI, kræver farvning inden for 10 min inden du kører flowcytometri. - Analysere ved flowcytometri (Se figur 1 og 2) inden for de næste 3 h. Hvis en længere tid er påkrævet, kortfristede fiksering ved hjælp af en lav koncentration PARAFORMALDEHYD (0,5-1% i PBS) anbefales at bevare farvning.
Bemærk: Det anbefales stærkt at filtrere prøver gennem en 40 µm celle si før indlede flow flowcytometri analyse for at forhindre tilstopning af fluidics af flow forskellige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til dato, er ingen god metode designet til at isolere immunceller fra andre kardiale celle komponenter, såsom cardiomyocytes. Analyse af den kardiale enkelt cellesuspension ved flowcytometri kræver derfor en pre gating med CD45 at identificere immun cellepopulationer, efterfulgt af enkelt celle og lille størrelse udstødelse gating (fig. 1A). Alternativt, en levedygtighed farvning kan udføres for at udelukke døde celler. Lille størrelse udstødelse og levedygtighed farvestof farvning repræsenterer næsten tilsvarende metoder til at udelukke døde celler (figur 1B og 1 D). Det anbefales stærkt at gå videre med antistof farvning snart efter proceduren for fordøjelsen og altid holde cellesuspension ved 4 ° C, som cellerne levedygtighed kan henfalde. Denne procedure giver typisk omkring 80-90% af levedygtige immunceller.
Myokardiet huser en forskelligartet koloni af immunceller, hvoraf mange er stadig verserende identifikation og karakterisering. Makrofager, identificeret som CD64+ celler, er den store immune befolkning af hjertet, der repræsenterer 60-70% af alle immunceller (figur 1C, top). Fordøjelsen af en voksen murine hjerte udbytter om 3-5 x 104 makrofager, afhængigt af hjertets størrelse. Hjerte makrofager kan være yderligere underdelt baseret på deres udtryk for CD11c eller CCR2 og deres niveauer af MHC-II2.
De andre kardiale immun delpopulation, der er blevet godt præget er konventionelle dendritiske celler. Konventionelle DCs er CD64- celler at udtrykke mellemliggende til høje niveauer af MHC-II og høje niveauer af CD11c (figur 1 C, nederst). Disse celler kan opdeles yderligere baseret på deres udtryk for enten CD103 eller CD11b8,9. DCs repræsenterer en meget mindre hjerte delpopulation i forhold til makrofager. Fordøjelsen af en voksen murine hjerte udbytter mellem 150 og 500 DCs af hver delmængde.
Perfusion af hjertet med kolde PBS er afgørende, når du identificerer immun cellepopulationer i myokardiet. Men ufuldkomne perfusion kan øge mængder af intravaskulære forureninger i prøver, fører til vigtige bias, der kan være baseret på perifere forandringer (blod) i stedet for ændringer i hjertets infiltrater. I disse tilfælde kan intravaskulær administration af fluorescerende-mærket anti-CD45 antistoffer, som mærker alle immun celler cirkulerer gennem makro- og microvasculature (figur 2A), hjælpe med at differentiere Myokardie celler fra intravaskulær forureninger. Figur 2 B viser et eksempel på et ufuldkomment perfused hjerte, hvor 20% af immunceller er intravaskulær forurenende stoffer. Ikke mindst har dette niveau af forurening ringe effekt på makrofag og DC analyse, da disse celler findes sjældent i blod (figur 2D).
Brugen af flowcytometri af en enkelt cellesuspension af myokardiet giver mulighed for undersøgelse af de mindre delpopulationer af hjertet. Eksempelvis mangel på transkriptionsfaktor BATF3 har vist sig at forhindre udviklingen af modne CD103+ DCs i flere væv11. For at studere hvis dette gælder også for myokardiet, blev enkelt celle suspensioner af cardiac celler fra 8-15 uger gamle BATF3-mangelfuld eller kontrol littermates (i C57BL/6 baggrund) analyseret ved hjælp af flowcytometri. På grund af små befolkningens størrelse og antallet af markører for at differentiere DC delmængder, kunne histologi ikke har givet tilstrækkelig strøm til analyse for at nå frem til et endeligt svar. Men, ved hjælp af flow flowcytometri analyse sammenligne immunceller af myokardiet af vildtype versus en Batf3- / - mus, manglende CD103+ DCs kan bekræftes i den sidstnævnte (fig. 3A og B). Desuden konstaterede vi, at BATF3-mangel ikke væsentligt ændrer sammensætningen af andre kardiale populationer (figur 3C og D). Disse resultater eksemplificere graden af følsomhed, der kan opnås ved hjælp af denne kombinerede metode af enzymatiske og mekaniske fordøjelsen for at opnå en enkelt cellesuspension.
Figur 1 : Gating strategi for kardiale makrofager og DCs. Isolerede hjerter fra C57BL/6 mus blev fordøjet som beskrevet, og enkelt cellesuspension blev analyseret ved flowcytometri. (A) Gating CD45 + live singlet hjerte celler. Bruge CD45 mærkning til at identificere immunceller fra hjertets enkelt celle homogenatet, som indeholder meget høje niveauer af ikke-immun celler (dvs., cardiomyocytes, endotel celler og fibroblaster). Udelukke dubletter ved at sammenligne SSC-H vs SSC-A efterfulgt af FSC-H vs FSC-A. Bemærk: Alle andre sammenligning mellem SSC-A, SSC-Hansen og SSC-W eller FSC-A, FSC-Hansen og FSC-W er ligeledes nyttig. Udvalg af levende celler kan udføres ved at udelukke meget små celler (SSC-H vs FSC-H gate). (B) sammenligning af døde celle udstødelse ved hjælp af størrelse vs levedygtighed farvning (DAPI). (C) Gating strategi for identifikation af cardiac makrofager (CD11b+ CD64+ celler) og DCs (CD64- MHC-IIHej CD11c+). Hjerte makrofager kan yderligere klassificeres baseret på deres udtryk af MHC-II og CD11c. hjerte DCs kan underinddeles baseret på deres udtryk for CD103 eller CD11b. (D) repræsentative parceller af DAPI + døde celler i makrofager og DC rum efter små størrelse udstødelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mærkning af intravaskulære celler kontaminanter. (A) sammenligning af intravaskulære CD45 mærkning af blodet neutrofile og Ly6CHej monocytter i anti-CD45 antistof behandlet (rød) eller ikke-behandlede (blå) mus. (B) identifikation af intravaskulære forurenende stoffer i et hjerte forberedelse af intravaskulære CD45 mærkning. (C) repræsentative flow parceller af myokardieinfarkt og intravaskulær celler. (D) repræsentative parceller af mærket celler i makrofager og DC rum efter anti-CD45 i.v. indgift. Bemærk at makrofager og DCs er udelukkende ekstravaskulære. Intravaskulær forurenende stoffer er typisk lymfocytter, monocytter og neutrofile2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Kvantificering af cardiac makrofager og DCs i BATF3-mangelfuld mus. (A) repræsentative flow parceller af cardiac DCs i Batf3+/ + og Batf3- / - mus. (B) kvantificering af cardiac DCs i Batf3+/ + og Batf3- / - mus. Bemærk fraværet af CD103+ DCs i Batf3- / - mus. (C og D) kvantificering af cardiac makrofager (MF) i Batf3+/ + og Batf3- / - mus. Fejllinjer udgør SEM. røde symboler repræsenterer individuelle dyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myokardial betændelse eller myocarditis, er en funktion af mest hjerte-kar-sygdomme. Myokardiet er imidlertid ikke sin egen immunkomponenter i ikke-sygdomstilstande. I steady state, mange immunceller bor i myokardiet og spille de afgørende roller i vedligeholdelse og beskyttelse. Karakterisering af disse forskelligartede befolkningsgrupper af celler ville ikke have været muligt uden metoder som præsenteres i denne protokol.
En kombination af mekanisk og Enzymatisk nedbrydning af myokardiet tillader isolering af en enkelt cellesuspension, der kan bruges i kombination med andre metoder til analyse, såsom flow flowcytometri eller immunomagnetic perle isolation. Flere overvejelser vedrørende den nuværende metode skal tages i betragtning. Første, alle vores analyser henvise til befolkningsgrupper i myokardiet; vi udelukke hjertets forkamre fra vores analyse, da disse er specialiserede væv med sin egen idiosynkrasier. Andet, mængder af enzymer, der anvendes er udtrykt som aktivitet enheder til at hjælpe i etableringen af digestions ved hjælp af enzymer fra andre kilder. Empiriske optimering af den endelige koncentration af enzymer og tidspunktet for fordøjelsen er imidlertid stærkt anbefales, som begrænsende enzym kan reducere celle udbytte og for meget fordøjelsen kan drastisk påvirke levedygtighed. For det tredje anbefales den valgfri skridt involverer intravaskulær administration af mærkede antistoffer især når man studerer ualmindeligt befolkninger i den normale myokardiet (f.eks lymfocytter, monocytter og neutrofile)2 eller under omstændigheder Når antallet af befolkninger i blodet kan ændre (monocytosis, granulocytosis eller lymfocytose) som kan give et falsk indtryk af forandringer i myokardiet, der skal bekræftes ved hjælp af denne metode eller alternativt, mikroskopi. Dette trin er dog af begrænset nytte når analyserer makrofager eller modne DCs, da disse celler findes sjældent i betydelige mængder i blod (figur 2D). Det er vigtigt at optimere mængden antistof administreres og inkubationstiden før ofrer musen, som lang sigt inkubation kan mulighed for nogle antistof diffusion ind i hjertet, især i en betændt myokardiet. Endelig er det meget vigtigt at være omhyggelig i isolation i hjertet, at fjerne rester af store arterier, vener og eller nogen andre væv, såsom lungerne. Disse forurenende væv har stærkt forhøjede antal af immunceller, der nemt kan maskere de Myokardie indfødte befolkninger.
Det er meget vigtigt at udføre udelukkelse af døde celler, uanset om du bruger levedygtighed farvestoffer eller gennem små størrelse udstødelse under analysen af handelsstrømmen flowcytometri, som fordøjelse (eller vævsskade i sygdomsmodeller) kan forårsage en forholdsvis stor mængde af døde celler. Vi har sammenlignet effektiviteten af døde celler og udelukkelse af størrelse ved hjælp af en levedygtighed etiket (figur 1B og D), demonstrere deres i nærheden af ækvivalens. Vigtigere, kan størrelse udelukkelse ikke bruges efter fiksering og permeabilization som denne procedure betydeligt reducerer Cellestørrelse.
Selv om autofluorescence er sjældent et problem at identificere hjerte makrofager ved hjælp af flowcytometri, repræsenterer dette en vigtigere opgave, når de forsøger at karakterisere udtryk for nogle markører, især med fluorokromer ophidset af høj energi ( kortere) lys bølgelængder (350-500 nm). I disse eksperimenter, er det stærkt anbefales at bruge isotype objekter, undgå de blå og violette lasere (fluorescein isothiocyanat, phycoerythrin, Pacific Blue/Brilliant Violet 421) og bruge fluorokromer med emissionerne over 600 nm, såsom allophycocyanin.
Anvendelse af protokoller som den præsenteres heri bliver vigtigere som en stigende mængde af litteratur er at identificere rollen af intensitet og type af betændelse i evaluering og kendetegner resultaterne af hjerte-kar-sygdom. Denne metode giver mulighed for højere niveauer af celle karakterisering end histologi. For eksempel, brug af afstamning sporingen tilladt til identifikation af ontogenically forskellige delgrupper af makrofager med deres programmeret forskellige funktioner2. På samme måde, kan denne metode bruges til at studere T-celle svar under Myokardie betændelse og kombineret med ex vivo stimulation til at studere T-celle polarisering8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den canadiske institutter for sundhedsforskning (148808 og 148792), SE blev støttet af et hjerte og slagtilfælde Foundation, personale award fra Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre for hjertet forskning og Peter Munk Hjertets centrum. XCC besidder en CIHR Banting Fellowship. LA holder en Heart & streg/Richard Mariannes Studentship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
