Summary
Ce protocole présente une méthode simple et efficace pour isoler, identifier et quantifier les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde de souris pendant l’état d’équilibre ou d’inflammation. Le protocole associe la digestion enzymatique et mécanique pour la génération d’une suspension de cellule unique qui peut être davantage analysée par cytométrie en flux.
Abstract
Le système immunitaire est une composante essentielle d’un cœur en bonne santé. Le myocarde est abrite une riche population de sous-ensembles de différentes cellules immunitaires avec compartimentation fonctionnelle durant l’état d’équilibre et différentes formes d’inflammation. Jusqu'à tout récemment, l’étude des cellules immunitaires au cœur exige l’utilisation de la microscopie ou protocoles de digestion peu développé, qui a fourni suffisamment de sensibilité lors d’une inflammation sévère mais n’ont pu en toute confiance identifient petit — mais clés — les populations de cellules pendant l’état d’équilibre. Ici, nous discutons une combinaison simple méthode enzymatique (collagénase, hyaluronidase et DNAse) et digestion mécanique des cœurs murine précédée d’administration intravasculaire d’anticorps fluorescent marqué pour différencier les petits mais inévitable contaminants cellulaires intravasculaire. Cette méthode génère une suspension de cellules viables isolées qui peuvent être analysés par cytométrie de flux pour l’identification et la quantification, phénotypage, ou purifié avec tri de fluorescence-lancée de cellules ou de séparation de billes magnétiques pour transcriptionnels études analyse ou in vitro . Nous incluons un exemple d’une cytométrie étape par étape pour différencier les macrophages clés et les populations de cellules dendritiques du cœur. Pour une expérience de taille moyenne (10 coeurs), l’achèvement de la procédure nécessite 2 à 3 h.
Introduction
Différentes formes de stress myocardique ou préjudice, y compris ischémique (ischémie reperfusion ou infarctus du myocarde) et non ischémique (hypertension ou myocardite), favoriser le recrutement des cellules inflammatoires réparatrice et protectrice, mais aussi Propriétés pathogènes. Dès 1891, Romberg décrit tout d’abord la présence d’infiltrats cellulaires dans le myocarde des patients infectés par le typhus et la scarlatine1. Cependant, l’étude détaillée des cellules immunitaires cardiaques a nécessité le développement de l’immunophénotypage des techniques plus avancées. En conséquence, que récemment nous avons commencé à comprendre qu’une population diversifiée de cellules immunitaires avec des rôles de maintenance essentielle au cours de l’état d’équilibre réside dans le myocarde.
L’histologie a été et est encore, la méthode la plus courante pour caractériser les cellules immunitaires cardiaques lors d’une inflammation. Cependant, alors que l’histologie représente un précieux outil de diagnostic, son utilisation dans l’étude des cellules immunitaires cardiaques a limitations importantes. Les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde représentent une très faible proportion des cellules totales et sont plus ou moins uniformément distribués dans un espace immense proportionnellement. De même, plusieurs formes d’inflammation cardiaque, myocardite virale, comme le montrent des phénomènes focales d’inflammation. Cela signifie qu’une analyse précise du système immunitaire du cœur exige souvent des degrés plus élevés de prélèvement histologique, une hausse des coûts pour réduire le biais. En outre, l’histologie fournit une quantité très limitée d’information utilisable dans l’identification des cellules (par exemple le nombre de paramètres). Avec un nombre toujours croissant de sous-ensembles de cellules qui nécessitent l’utilisation de marqueurs d’expression multiples (y compris les marqueurs de surface, des facteurs de transcription ou des molécules sécrétées), cytométrie de flux s’est imposé comme l’outil le plus puissant pour l’immunophénotypage, en raison de la faible coût et haut débit.
L’utilisation de techniques de l’immunophénotypage dépend étroitement de l’élaboration de protocoles de digestion efficace permettant une analyse simple des cellules d’un grand nombre de cellules. L’élaboration de protocoles exhaustifs d’extraction de cellule a ouvert une nouvelle fenêtre d’opportunités dans l’étude de l’immunologie cardiaque. Grâce à la combinaison de la digestion, cytométrie en flux et transcriptomique, les principales populations des macrophages et des cellules dendritiques qui résident au cœur ont été caractérisées2,3. La population plus abondante de cellules immunitaires cardiaques pendant l’état d’équilibre sont CD64++ de MerTK macrophages, qui peuvent être encore divisés basés sur leur expression de CCR2 ou CD11c2. CCR2+ macrophages proviennent de la moelle osseuse adulte hématopoïèse, tandis que la majorité des CCR2– macrophages, qui peuvent exprimer des niveaux élevés ou faibles de MHC-II, sont principalement d’origine prénatale. Macrophages des fonctions clés telles que la réparation4 et l’élimination des débris5 lors des blessures ou soutenir la connectivité électrique6 en état stationnaire. Au cours de différentes formes d’inflammation un afflux important de Ly6CSalut MHC-IIlo CD64int monocytes se produisent, qui plus tard se différencient en Ly6CSalut CCR2+ macrophages2,7 . Une population beaucoup plus petite, mais importante, de cellules résidant dans le myocarde des individus en bonne santé est composée de cellules dendritiques8,9. Les deux grands sous-ensembles de MDD classiques cardiaque (CDC) ont été récemment caractérisées : cDC1 (CD103+ DCs) et cDC2 (CD11b+ DCs). Contrôleurs de domaine jouent un rôle important dans la défense contre l’infection8 mais peuvent aussi favoriser automutilation lors d’une inflammation, particulièrement au cours de l’infarctus du myocarde,9.
Nous décrivons ici une méthode simple pour l’isolement de cellules immunitaires cardiaques viables du myocarde de souris. La méthode combine la digestion enzymatique et mécanique avec une filtration de cellule-crépine afin d’obtenir une suspension de cellule unique qui peut être analysée, ou encore purifiée, par écoulement cytometry tri ou enrichissement des billes magnétiques. Des mesures précises de cellules myocardiques extravasculaires exigent la perfusion cardiaque afin d’éliminer les contaminants possibles de la circulation sanguine de la microcirculation cardiaque. En outre, nous présentons une étape facultative de l’étiquetage intravasculaire des cellules immunitaires qui peuvent être utilisés pour différencier plus loin cellules myocardiques de contaminants intravasculaires, basés sur la Galkina al protocole10. Enfin, nous présentons une analyse de cytométrie de flux de base pour identifier les sous-populations majeures de macrophage et cDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Déclaration d’éthique : ce protocole a été examiné et approuvé par le Comité de protection de l’Animal à l’University Health Network (Toronto, Canada) et est en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux.
1. préparation de la mémoire tampon
- Préparer le tampon de l’HEXABROMOBIPHÉNYLE (de Hank Balanced Salt Solution (HBSS), sérum de chaleur 2 % inactivé, 0,2 % d’albumine sérique bovine). Ajouter 10 mL de chaleur inactivé sérum bovin et 1 g d’albumine de sérum bovin à 500 mL de HBSS. Filtre à stériliser à travers un 0,2 µm et conserver à 4 ° C.
- Préparer le tampon de FACS (tampon Phosphate salin (PBS), 2 % chaleur inactivé de sérum bovin, 1 mM de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, pH 8,0)). Ajouter 10 mL chaleur inactivé sérum bovin et 1 mL d’EDTA 0,5 M à 500 mL de PBS. Filtre à stériliser à travers un 0,2 µm et conserver à 4 ° C.
Remarque : Les Solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant environ 1 mois.
2. étiquetage des leucocytes circulants
- Aseptiquement préparer injection de CD45 anti-souris avec 1 µg d’anticorps dilué dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour un volume d’injection final de 200 µL/souris. Charger le volume dans une seringue à insuline 28,5 G et conserver à l’abri de la lumière.
Remarque : Utilisez deux anticorps anti-CD45 différents marqués au fluorochrome afin de différencier les intravasculaire (colorées par l’administration i.v.) de la coloration intracardiaque (Taché après digestion ; Voir l’étape 4). -
Réchauffez la souris (âgés de 8 à 12 semaines) en exposant la queue à une lampe rouge pendant 5 min.
ATTENTION : Ne pas surchauffer l’animal. Garder la lampe à une distance suffisante (> 30 cm).- Retenir l’animal en position sternale à l’aide d’un dispositif approprié. Exposer et à stabiliser la queue avec la main non dominante en immobiliser la base de la queue avec l’index et le majeur et le milieu-partie distale de la queue entre le pouce et l’annulaire.
ATTENTION : N’appliquez pas trop de force à l’extrémité de la queue, car la peau peut être retirée. Introduire l’aiguille avec le biseau vers le haut dans la veine. Tenir l’aiguille parallèle à la veine en permanence, car elle est facile à ponctionner la veine.
NOTE : Sang dans la seringue peut survenir et est le signe d’une bonne injection. Courbure de l’aiguille à un angle de 90° peut faciliter l’administration i.v.. Confirmez avec votre bureau de la sécurité comme flexion aiguilles peuvent représenter un danger. - Injecter par voie intraveineuse des 200 µL dans la veine caudale. Le fluide doit circuler facilement et désactivez temporairement la veine.
ATTENTION : Ne pas forcer le fluide en cas de résistance. C’est signe de mauvais placement de l’aiguille. - Permettre aux anticorps de circuler pendant 5 min avant d’euthanasier humainement les souris.
- Retenir l’animal en position sternale à l’aide d’un dispositif approprié. Exposer et à stabiliser la queue avec la main non dominante en immobiliser la base de la queue avec l’index et le majeur et le milieu-partie distale de la queue entre le pouce et l’annulaire.
3. coeur d’isolement et la Digestion
-
Euthanasier la souris à l’aide de CO2 ou par toute autre procédure d’euthanasie acceptée sur le plan institutionnel.
- CO2 euthanasie, placez votre souris dans la chambre de CO2 et fixer le taux de remplissage à 20 % du volume chambre / minute (c'est-à-dire, si la chambre est de 10 L, verser à 2 L/min). Fonctionner pendant 2 min et moniteur de la souris jusqu'à ce que la respiration a cessé.
- Coupez le CO2 et laisser la souris pendant une supplémentaire 1-2 min. Vérifiez la respiration a cessé avant d’ouvrir la chambre et une pincée d’orteil pour confirmer que la souris est morte avant de procéder au traitement de la souris.
- Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 %. Soulever la peau et à l’abdomen et disséquer la souris en coupant le long le début de la ligne médiane ventrale au niveau des hanches jusqu’au sternum. Ouvrir l’abdomen et déplacer le foie pour exposer le diaphragme.
-
Couper le diaphragme, puis les côtes des deux côtés de la ligne médiane, en veillant à éviter de perforer les poumons et le cœur.
- Exposer au cœur de peeling en arrière les côtes, puis première coupe, l’oreillette gauche suivie de l’oreillette droite.
ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous coupez les oreillettes, assurant sans artères ou des veines sont blessés, comme cela peut diminuer l’efficacité du rinçage du sang contenu dans les organes. - Perfuse le coeur avec 15 à 20 mL de PBS froid à l’aide d’une seringue de 60 mL, munie d’une aiguille de 21 G et PBS froid. Doucement, saisir la base du coeur avec une pince et insérer l’aiguille dans le ventricule gauche près de l’apex. Répéter la procédure dans le ventricule droit. Une bonne injection entraîne blancs poumons et foie pâle.
Remarque : La Perfusion doit être effectuée dans les 5 minutes après l’euthanasie afin d’éviter la coagulation du sang, qui peut contaminer les organes d’intérêt avec des cellules circulantes.
- Exposer au cœur de peeling en arrière les côtes, puis première coupe, l’oreillette gauche suivie de l’oreillette droite.
-
Tenir la base du coeur avec une pince et tirez le cœur doucement, puis détachez le cœur en coupant les grandes artères pulmonaires et veines, aorte et le sac péricardique.
- Nettoyer le cœur en appuyant doucement le cœur entre le pouce et les doigts index dans une serviette en papier propre non pelucheux et retirer les oreillettes et les vestiges des grandes artères et les veines et tout autre contaminant avec une pince.
Remarque : S’assurer que l’intégralité des oreillettes est retirée et aucune autres tissus, comme les poumons ou les vaisseaux sanguins, ne sont présents, car ces tissus ont leurs propres cellules immunitaires résidents. En particulier, le poumon a une population de grandes cellules immunitaires qui peut masquer les plus petites populations de ceux dans le myocarde.
- Nettoyer le cœur en appuyant doucement le cœur entre le pouce et les doigts index dans une serviette en papier propre non pelucheux et retirer les oreillettes et les vestiges des grandes artères et les veines et tout autre contaminant avec une pince.
-
Place le coeur dans un plat en plastique de 5 cm à 50 µL de PBS froid.
- Émincer le cœur à l’aide de ciseaux de dissection courbées jusqu'à ce qu’il n’y a aucune pièces visibles et il a une consistance lisse.
NOTE : Essayer de garder le coeur dans une zone restreinte du plat pendant pour minimiser la perte de tissu à découper. - Transfert thetrituratedheart le tissu avec une pincette courbée dans tube de microcentrifuge de 2 mL avec 800 µL froid de Dulbecco modifié Eagle (DMEM).
- Émincer le cœur à l’aide de ciseaux de dissection courbées jusqu'à ce qu’il n’y a aucune pièces visibles et il a une consistance lisse.
-
Ajouter 450 U/mL ofcollagenase, I, 60 U/mL de type I-S de l’hyaluronidase et 60 U/mL de DNase-j’ai à chaque échantillon.
- Incuber les échantillons à 37 ° C sur un agitateur basculant à 50 tr/min pendant 45 à 60 min.
-
Après digestion, brièvement les échantillons de vortex (20 s) et placer immédiatement sur la glace pour conserver les échantillons à 4 ° C.
- Aide d’une pipette de 1 mL, pipette échantillons de haut en bas jusqu'à ce que des échantillons de tissus sont homogènes et ne pas boucher l’embout de la pipette.
Remarque : Définir un certain nombre de fois à la pipette peut augmenter de reproductibilité. Si les cœurs ne sont pas digérées de façon optimale, les morceaux du myocarde peuvent gêner la pipette. Meuler doucement l’embout de la pipette contre le tube de microcentrifuge aidera à homogénéiser les plus grands morceaux de tissu.
- Aide d’une pipette de 1 mL, pipette échantillons de haut en bas jusqu'à ce que des échantillons de tissus sont homogènes et ne pas boucher l’embout de la pipette.
-
Pré humide une passoire de cellule 40 µm placé sur un tube conique de 50 mL avec 1 mL d’HEXABROMOBIPHÉNYLE froid.
- Ajouter l’échantillon homogénéisé au filtre et laver à travers en versant lentement 12 – 14 mL d’HEXABROMOBIPHÉNYLE froid.
- Transférer les échantillons filtrés dans un tube conique marqué 15 mL et conserver à 4 ° C.
-
Centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer au large de surnageant.
- Lyse des globules rouges en ajoutant 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’Ammonium-Potassium (ACK) pour chaque échantillon. Remettre en suspension les échantillons au vortex et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Une fois terminée la lyse, ajouter 5 à 8 mL de Hank froid équilibré sel Solution (HBSS) pour arrêter l’hémolyse.
- Centrifuger les échantillons à 400 x gfor 5 min à 4 ° C. Aspirer au large de surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon de FACS pour chaque échantillon et le transférer dans un tube de microcentrifuge marqués de 1,5 mL.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici pendant 2 h avec échantillons stockés à 4 ° C.
4. flow Cytometry coloration et analyse
-
Centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Afin de réduire la liaison des anticorps non-spécifiques, diluer au 1/100 anti-CD16/CD32 et bloqueur de Monocyte (01:20) comptabilité (voir Table des matières) pour 50 µL FACS par échantillon. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
- Préparer la comptabilité de dilution (1/250 pour chacun des anticorps) d’anticorps pour 50 µL de FACS par échantillon.
Remarque : Un colorant de viabilité peut figurer dans l’anticorps cocktail afin d’exclure les cellules mortes. Exclusion de petite taille par analyse en flux peut également être utilisé (Figure 1C et D). - Sans laver, ajouter 50 µL du mélange maître anticorps pour chaque échantillon et mélanger.
- Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30 min à l’obscurité.
- Ajouter 600 µL FACS dans chaque échantillon pour laver et centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Aspirer au large de surnageant et Resuspendre le culot dans 300 µL FACS. Conserver les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité.
Remarque : Certains colorants de viabilité, tels que DAPI, nécessitent coloration moins de 10 min avant l’exécution de cytométrie en flux. - Analyse par cytométrie de flux (voir Figures 1 et 2) au cours des 3 prochaines heures. Si un temps plus long est requis, à court terme fixation à l’aide d’un paraformaldéhyde à faible concentration (0,5 à 1 % dans du PBS) est recommandé pour préserver la coloration.
Remarque : Il est fortement recommandé pour filtrer les échantillons à travers un tamis de cellule de 40 µm avant analyse en cytométrie en flux initier afin d’éviter l’obstruction de la fluidique du cytomètre en flux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A ce jour, aucune bonne méthode n’a été conçu pour isoler les cellules immunitaires des autres composantes de la cellule cardiaque, tels que les cardiomyocytes. Donc, analyse de la suspension de la cellule cardiaque par cytométrie nécessite un pré déclenchement avec CD45 afin d’identifier les populations de cellules immunitaires, suivies de la cellule unique et depetite taille exclusion gating (Figure 1A). Par ailleurs, une coloration de viabilité peut être effectuée pour exclure les cellules mortes. Exclusion de petite taille et de coloration viabilité représentent des méthodes presque équivalentes à exclure les cellules mortes (Figure 1B et 1D). Il est fortement recommandé de procéder avec l’anticorps coloration peu de temps après la procédure de digestion et de toujours garder la suspension cellulaire à 4 ° C, comme la viabilité des cellules peut se désintégrer. Cette procédure entraîne généralement environ 80 à 90 % des cellules immunitaires viables.
Le myocarde abrite une colonie diversifiée des cellules immunitaires, dont beaucoup sont toujours en attente d’identification et de caractérisation. Macrophages, identifiés comme CD64+ cellules, sont la population immunitaire majeure du coeur, ce qui représente 60 à 70 % de toutes les cellules immunitaires (Figure 1C, top). La digestion d’un coeur adulte murin donne sur 3 – 5 x 104 macrophages, en fonction de la taille du cœur. Macrophages cardiaques peuvent être subdivisés selon leur expression de CD11c ou CCR2 et leurs niveaux de MHC-II2.
L’autre sous-population immunitaire cardiaque qui a été bien caractérisée sont des cellules dendritiques conventionnelles. DCs classiques sont CD64– cellules qu’intermédiaire explicite à des niveaux élevés de MHC-II et des niveaux élevés de CD11c (Figure 1 C, bas). Ces cellules peuvent être encore divisés sur la base leur expression CD103 ou CD11b8,9. Contrôleurs de domaine représentent bien une sous-population cardiaque plus petite par rapport aux macrophages. La digestion d’un coeur adulte murin donne entre 150 et 500 contrôleurs de domaine de chaque sous-ensemble.
La perfusion du cœur avec du PBS froid est essentielle lors de l’identification des populations de cellules immunitaires dans le myocarde. Cependant, l’imparfait perfusion peut augmenter les quantités de contaminants intravasculaires dans les échantillons, conduisant à un biais important qui peut être basé sur des modifications périphériques (sang) plutôt que des changements dans les infiltrats cardiaques. Dans ces cas, administration intravasculaire d’anticorps anti-CD45 fluorescentes marquées, qui marque toutes les cellules immunitaires qui circule à travers la macro et microcirculation (Figure 2A), peut aider à différencier les cellules myocardiques de contaminants intravasculaires. Figure 2 B montre un exemple d’un coeur perfusé imparfaitement dans lequel 20 % des cellules immunitaires sont contaminants intravasculaires. Ce qui est important, ce niveau de contamination a peu d’effet sur les macrophages et analyse de DC, étant donné que ces cellules se trouvent rarement dans le sang (Figure 2D).
L’utilisation de la cytométrie d’une suspension cellulaire unique du myocarde permet l’étude des petites sous-populations du cœur. Par exemple, le déficit du facteur de transcription BATF3 a été démontré pour prévenir le développement de mature CD103+ DCs dans plusieurs tissus11. Afin d’étudier si cela est également vrai dans le cas du myocarde, des suspensions cellulaires unique de cellules cardiaques de BATF3 8 – 15 semaines déficient ou contrôle de même portée (à l’arrière-plan de C57BL/6) ont été analysées par cytométrie en flux. En raison de la population de petite taille et le nombre de marqueurs pour différencier les sous-ensembles de DC, histologie n'aurait pas pu fournir assez de puissance pour l’analyse atteindre une réponse définitive. Toutefois, l’analyse en cytométrie en flux pour comparer les cellules immunitaires du myocarde de type sauvage contre une souris Batf3- / - , un manque de CD103+ DCs peut être confirmée dans le second (Figure 3A et B). En outre, nous avons observé qu’une carence en BATF3 n’altéra pas significativement la composition des autres populations cardiaques (Figure 3C et D). Ces résultats illustrent le degré de sensibilité qui peut être réalisé à l’aide de cette méthode combinée de la digestion enzymatique et mécanique pour réaliser une suspension monocellulaire.
Figure 1 : Gating stratégie de macrophages cardiaques et contrôleurs de domaine. Des coeurs isolés de souris C57BL/6 ont macéré comme décrit, et suspension monocellulaire a été analysée par cytométrie en flux. (A) Gating de CD45 + singulet direct des cellules cardiaques. Utilisez CD45 étiquetage pour identifier les cellules immunitaires de l’homogénat de la cellule cardiaque, qui comprend des niveaux très élevés de cellules non immuns (c.-à-d., les cardiomyocytes, cellules endothéliales et les fibroblastes). Exclure les doublets en comparant les SSC-H vs SSC-A suivi par FSC-H vs FSC.-a. Remarque : Toute autre comparaison entre SSC-A, ASC-H et SSC-W ou FSC-A, FSC-H et FSC-W sont de même utile. Sélection de cellules vivantes peut être effectuée en excluant les très petites cellules (porte de SSC-H vs FSC-H). (B) la comparaison de l’exclusion de cellules mortes à l’aide de la viabilité de vs taille coloration (DAPI). (C) bloquant la stratégie pour l’identification des macrophages cardiaques (CD11b+ CD64+ cellules) et DCs (CD64– MHC-IISalut CD11c+). Macrophages cardiaques peuvent être classées de davantage basée sur leur expression de MHC-II et CD11c. DCs cardiaques peuvent être subdivisés basé sur leur expression de CD103 ou CD11b. (D) les parcelles représentant de DAPI + cellules mortes au sein des macrophages et DC compartiments après exclusion de petite taille. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étiquetage des intravasculaire cellules contaminants. (A) Comparaison de l’étiquetage de CD45 intravasculaire de neutrophiles sanguins et Ly6CSalut monocytes en anticorps anti-CD45 traités (rouge) ou chez les souris non traitées (bleus). (B) Identification des contaminants intravasculaires dans une préparation cardiaque par un étiquetage de CD45 intravasculaire. (C) flux représentatif des parcelles de cellules myocardiques et intravasculaires. (D) emplacements représentatifs des cellules marquées dans les macrophages et les compartiments DC après administration i.v. anti-CD45. Notez que les macrophages et les contrôleurs de domaine sont exclusivement extravasculaires. Intravasculaires contaminants sont généralement des lymphocytes, des monocytes et des neutrophiles2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification des macrophages cardiaques et DCs chez les souris déficientes en BATF3. (A) parcelles représentant débit cardiaques DCs dans Batf3+ / + et Batf3- / - souris. (B) Quantification des contrôleurs cardiaques Batf3+ / + et Batf3- / - souris. Notez l’absence de CD103+ DCs Batf3- / - souris. (C et D) Quantification des macrophages cardiaques (MF) en Batf3+ / + et Batf3- / - souris. Barres d’erreur représentent SEM. Red symboles représentent des animaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inflammation du myocarde, ou myocardite, est une caractéristique des maladies cardiovasculaires plus. Toutefois, le myocarde n’est pas dépourvue de ses propres composantes immunitaires dans les États non-maladie. Pendant l’état d’équilibre, beaucoup de cellules immunitaires se trouvent dans le myocarde et jouent le rôle essentiel de l’entretien et la protection. La caractérisation de ces diverses populations de cellules n'aurait pas été possible sans les méthodes telles que celle présentée dans le présent protocole.
Une combinaison de la digestion enzymatique et mécanique du myocarde permet l’isolement d’une suspension de cellule unique qui peut être utilisée en combinaison avec d’autres méthodes d’analyse, tels que l’isolement d’écoulement cytometry ou immunomagnetic de perle. Plusieurs considérations relatives à la méthode actuelle doivent être tenues compte. Tout d’abord, tous nos analyses font référence aux populations dans le myocarde ; nous excluons les oreillettes de notre analyse, car ce sont des tissus spécialisés avec ses propres particularités. Deuxièmement, les montants des enzymes utilisées sont exprimées en unités d’activité économique pour aider à la mise en place de digestions utilisant des enzymes provenant d’autres sources. Cependant, optimisation empirique de la concentration finale des enzymes et le temps de digestion est fortement recommandée, comme limitant l’enzyme peut réduire considérablement le rendement de la cellule et trop digestion peut radicalement affecter la viabilité. Troisièmement, l’étape facultative touchant l’administration intravasculaire d’anticorps marqués est particulièrement recommandée lorsque l'on étudie des populations rares dans le myocarde normal (par exemple les lymphocytes, les monocytes ou les neutrophiles)2 ou dans des circonstances Lorsque le nombre de populations dans le sang peut changer (monocytose, granulocytose ou lymphocytose) qui peuvent donner une fausse impression de changements au sein du myocarde qui doivent être confirmés à l’aide de cette méthode ou, alternativement, la microscopie. Toutefois, cette étape est d’utilité limitée lors de l’analyse des macrophages ou DCs matures, que ces cellules sont rarement trouvés en grande quantité dans le sang (Figure 2D). Il est important d’optimiser la quantité d’anticorps administrés et le temps d’incubation avant de sacrifier à la souris, comme à long terme incubation peut prévoir certaines diffusion d’anticorps dans le cœur, surtout dans un myocarde enflammée. Enfin, il est très important d’être méticuleux dans l’isolement du cœur, éliminant les restes de grandes artères, veines et ou tout autre tissu, comme le poumon. Ces tissus contaminants ont fortement élevé nombre de cellules immunitaires qui peuvent masquer facilement les populations indigènes du myocarde.
Il est très important pour effectuer une exclusion des cellules mortes, que vous utilisiez des colorants de viabilité ou par exclusion de petite taille au cours de l’analyse en cytométrie en flux, comme la digestion (ou lésion tissulaire dans les modèles de la maladie) peut provoquer une assez grande quantité de cellules mortes. Nous avons comparé l’efficacité de l’exclusion des cellules mortes en taille et en utilisant une étiquette de viabilité (Figure 1B et D), ce qui démontre leur équivalence près. Ce qui est important, exclusion de taille ne peut servir après fixation et perméabilisation car cette procédure réduit considérablement la taille des cellules.
Bien que l’autofluorescence est rarement un problème pour identifier les macrophages cardiaques à l’aide de cytométrie en flux, cela représente un problème plus important en essayant de caractériser l’expression de certains marqueurs, en particulier avec les fluorochromes excités par une énergie élevée ( plus courtes) longueurs d’onde situées (350 – 500 nm). Dans ces expériences, il est fortement recommandé d’utiliser des contrôles de l’isotype, éviter les lasers mauves et bleues (isothiocyanate de fluorescéine, la phycoérythrine, Pacific Blue/brillant Violet 421) et utiliser des fluorochromes avec des émissions supérieures à 600 nm, tels qu’allophycocyanin.
L’utilisation de protocoles comme celui présenté ici sont de plus en plus important qu’une quantité croissante de la littérature consiste à déterminer le rôle de l’intensité et le type d’inflammation pour évaluer et caractériser les résultats des maladies cardiovasculaires. Cette méthode permet à des niveaux plus élevés de caractérisation de cellules que l’histologie. Par exemple, l’utilisation du traçage de lignée a permis d’identifier ontogénique différents sous-ensembles des macrophages avec leurs fonctions différentes programmées2. De même, cette méthode peut être utilisée pour l’étude des lymphocytes T lors d’une inflammation myocardique et combinée avec la stimulation ex vivo pour étudier les cellules T polarisation8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé (148808 et 148792), S’a été pris en charge par une sentence du personnel du Bureau Provincial de l’Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre for Heart Research et le Peter Munk, Fondation des maladies du cœur Centre de cardiologie. XCC est titulaire d’une bourse de recherche IRSC Banting. LA détient un Heart & Stroke/Richard Lewar bourse de stagiaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
