Summary
Здесь мы представляем протокол генетически изменить основной или расширенный человека природные (NK) киллеры с помощью Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Используя этот протокол, мы создали NK клеток человека недостаточно для превращения рецепторов фактора роста – b 2 (TGFBR2) и phosphoribosyltransferase гипоксантина 1 (HPRT1).
Abstract
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии ускоряется генома техники во многих типов клеток, но до настоящего времени доставки генов и стабильной гена модификации были сложным в первичной НК-клеток. К примеру трансген доставки с помощью лентивирусные или ретровирусной трансдукции привели к ограниченной доходности генетически НК-клеток за счет существенной связанные процедуры NK клеток апоптоз. Здесь мы описываем ДНК, свободной метод для изменения генома человека основной и расширенный НК-клеток с использованием Cas9 рибонуклеопротеида комплексов (Cas9/RNPs). Этот метод позволил эффективно нокаут TGFBR2 и HPRT1 генов в клетки. RT-PCR данные показали значительное снижение уровня выражения гена, и цитотоксичность пробирного представитель ячейки продукта предложил, что RNP-Изменение NK клеток стали менее чувствительными к TGFβ. Генетически модифицированные клетки может быть расширение пост электропорация путем стимуляции с облученного mbIL21-выражая клетки фидера.
Introduction
Иммунотерапия рака была выдвинута в последние годы. Генетически модифицированные химерных антигена рецепторов (автомобиль) Т-клетки являются отличным примером инженерии иммунных клеток, успешно развернуты в Рак иммунотерапия. Эти клетки были недавно одобрен FDA для лечения против CD19 + B клеток злокачественных опухолей, но успех пока ограничивается заболеваний, принимая несколько ориентации антигены и ориентации такого ограниченного антигенной репертуаров склонны к неспособности иммунных побег. Кроме того автомобиль Т-клетки были сосредоточены на использование аутологических клеток T из-за риска – трансплантат против – хост заболеваний, вызванных аллогенных клеток T. В противоположность этому НК-клетки способны убить цели опухолевого антигена независимым образом и не вызывают GvHD, что делает их хорошим кандидатом для рака иммунотерапия6,,78,9.
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технология была использована недавно в инженерных иммунных клеток, но генетически перепрограммирования НК-клеток с плазмид всегда была сложной. Это объясняется трудностями в доставке трансген зависимым образом ДНК как лентивирусные и антиретровирусным трансдукции, вызывая значительные связанные процедуры NK клеток апоптоз и ограниченное производство генетически NK клеток4 , 9.
Многие врожденные иммунные клетки Экспресс высокий уровень рецепторов для патоген связанные молекулярные модели, такие как ретиноевой кислоты inducible gene я (RIG-я), которые позволяют повышение признания иностранных ДНК. Подавление этих путей позволило более высокую эффективность трансдукции в НК-клеток при использовании методов на основе ДНК генетической модификации10.
Здесь мы описываем метод для использования свободных ДНК генома редактирования основного и расширенного NK клеток человека используя Cas9 рибонуклеопротеида комплексы (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs состоит из трех компонентов, рекомбинантные Cas9 белка complexed с синтетическими сингл руководство РНК состоит из complexed crRNA и tracerRNA. Эти Cas9/RNPs способны раскалывание genomic цели с более высокой эффективностью по сравнению с иностранными ДНК зависимая подходов благодаря их доставки как функциональных комплексов. Кроме того быстрое оформление Cas9/RNPs от клеток может уменьшить пробить эффекты, такие как индукции апоптоза. Таким образом они могут использоваться для создания плей аутов, или стук ins для гомологичная рекомбинация6,7в сочетании с ДНК. Мы показали, что электропорации Cas9/RNPs-это простой и довольно эффективный метод, который преодолевает предыдущие ограничения генетической модификации в НК-клеток.
TGFβ является основных иммуносупрессивные цитокинов, который ингибирует активацию и функции НК-клеток. Было высказано предположение о том, что ориентация на тропе TGFβ может увеличить функции иммунных клеток. Мы целевой регион кодирования TGBR2 ectodomain, который связывает TGFβ11. Представитель результаты показывают значительное снижение уровня экспрессии мРНК этого гена и далее демонстрировать, что изменение НК-клетки становятся устойчивыми к TGFβ. Кроме того измененные клетки сохраняют жизнеспособность и пролиферативный потенциал, поскольку они способны быть расширенной пост электропорация облученного фидер клеток. Таким образом, следующий метод является перспективным подходом к генетически манипулировать НК-клеток для любого дальнейшего клинического или исследовательских целях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Баффи пальто здоровых доноров были получены в качестве исходного материала от Центральной Огайо региона американского Красного Креста. Это исследование было установлено быть освобождены исследований институционального обзора Совет из общенациональных Детская больница.
1. человека NK клеток очистки и расширения
- Изолируйте репликацию с Баффи пальто12.
- Слой 35 мл образца Баффи пальто на 15 мл Ficoll-Paque.
- Центрифуга на 400 x g 20 минут без тормозов и собирать КСДОР от интерфейса.
- Мыть восстановленные получения три раза путем добавления по крайней мере равным объемом PBS, центрифугирование в 400 x g на 5 минут и аспирационных КПБ мыть. NK клеток могут быть изолированы на этой стадии RosettesSep13.
- Разверните НК-клеток, стимулируя с облученного 10 х 106 mbIL21-выражая клетки фидера на 0, 7 и 14 дней. Замените свежим RPMI, содержащие 10% СМИ FBS, 1% глютамина, 1% стрептомицин, пенициллин и 100 МЕ/мл Ил-2 для всего СМИ тома каждый день.
2. gRNA дизайн и подбор
- Выбор конкретных локусов геномной направлять, используя онлайн инструменты, например, NCBI, ансамбль.
Пример.
Описание/контроль: Преобразование рецепторов фактора роста бета 2 (TGFBRR2) ectodomain
Просмотр записи: PF08917
Просмотр InterPro: IPR015013
Должность: 49-157 aa
Целевые последовательности: Экзона 4 гена TGFBR2 (ENSG00000163513) - Дизайн оформления, используйте ТРИФОСФАТЫ дизайн веб-инструменты, такие как http://crispr.mit.edu и «Benchling.»
- Введите в последовательности ДНК, выбранного на шаге 2.1. Выберите целевой генома человека (hg 19). ТРИФОСФАТЫ направляющие (20 нуклеотидов следуют последовательность PAM: NGG) будут проверяться из последовательности, введенные ранее. Он также показывает возможные совпадения пробить на протяжении выбранного генома.
- Выберите лучшие три оформления, которые имеют самый высокий балл, основанный на их ставок на цель и пробить. Например Таблица 1 показывает разработан ТРИФОСФАТЫ RNAs целевой экзона 4 TGFBR2 гена предложенные ТРИФОСФАТЫ дизайн веб-инструменты.
- Порядок ТРИФОСФАТЫ РНК как синтетические последовательность конкретных crRNAs.
- Заказать сохранены, transactivating РНК (tracrRNA) для взаимодействия через частичная Гомология с crRNA.
3. Дизайн Удаление скрининг грунтовки
- Праймеры дизайн, охватывающих gRNA расщепления сайтов для assay T7E1 мутации.
- Использование грунты по крайней мере 100 ВР от предсказал расщепление сайта для обеспечения небольшие вставки удаление (indels) на целевой сайт sgRNA будет появляться на 1,5% агарозном геле после мутации assay. Таблица 2 показывает грунты, которые используются для усиления TGFBR2 ectodomain.
4. трансдукции человека основной и расширенный НК-клеток
Примечание: Трансдукции Cas9/RNPs элементов в НК делается путем электропорации, используя 4D системы следующим.
-
Ячейка Подготовка
- Для первичного НК-клеток, инкубировать свежевыделенных НК-клеток в среде RPMI присутствии 100 МЕ/мл Ил-2 на 4 дня и выполнять электропорации в день 5. Замените средства массовой информации каждый день, как описано ранее и за день до трансдукции.
- Для расширенного НК-клеток, стимулируют клетки в день 0 с облученного фидер клеток в соотношении 1:1 и выполнять электропорации в день 5 или 6 или 7. Замените средства массовой информации каждый день, как описано ранее и за день до трансдукции.
- В день электропорация Подготовьте T25 колбу, заполнены с 8 мл свежего RPMI, содержащие 100 МЕ/мл Ил-2 для клетки проходят электропорации и предварительно incubate колбы в увлажненные, 37 ° C и 5% CO2 инкубатора.
Примечание: Размороженный клетки или клетки, которые прошли 2-ой или 3rd стимуляции может быть electroporated в любое время после их восстановления, как описано. - Возьмите 3-4 × 106 клеток / условие для 26 мкл трансдукции смеси.
Примечание: Очень высокая концентрация НК-клеток в растворе для электропорации повышает уровень трансдукции. - Вымойте клетки 3 раза с PBS для удаления всех FBS, который обычно содержит РНКазы активности. Спина их вниз каждый раз на 300 x g за 8 минут.
Примечание: Рассмотрим 7 электропорации условия для Cas/RNPs как единый gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) и сочетание двух оформления (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) и один элемент управления с не Cas9/RNPs.
-
Форма crRNA:tracerRNA / комплекс
- Ресуспензируйте crRNAs (gRNA1, gRNA2 и gRNA3) и tracerRNA в 1 x решение TE окончательный концентрации 200 мкм. Mix 2.2 мкл каждого gRNA 200 мкм с 200 мкм tracerRNA, как показано в таблице 3.
- Тепла образцы на 95 ° C за 5 минут и дайте ему остыть на скамейке сверху комнатной температуре (15-25 ° C). Магазин высокомобильна РНК и crRNA: tracerRNA/комплекс при-20 ° C для последующего использования.
-
Образуют комплекс RNP
Примечание: чтобы сэкономить время, образуют комплекс во время стирки RNP Шаг 4.1.5.- Для одного crRNA:tracrRNA дуплекс реакции развести Cas9 эндонуклеазы до 36 мкм, как показано в примере в таблице 4.
- Для комбинации трансдукции crRNA:tracrRNA дуплексы, разбавить Cas9 эндонуклеазы до 36 мкм, как показано в примере в Таблица 5.
- Добавление Cas9 эндонуклеазы crRNA:tracrRNA дуплексы медленно во время закрученного кончиком пипетки, свыше 30 s до 1 минуты.
- Инкубируйте смесь при комнатной температуре 15-20 мин. Если не готовы использовать смесь после инкубации, оставьте смесь на льду до использования.
-
Электропорация
- Добавьте все дополнения электропорации решение P3 и держать его при комнатной температуре.
- Ресуспензируйте ячейки Пелле (3-4 × 106 клеток из шага 4.1.5) в 20 мкл P3 первичной 4 D электропорации решения. Избегайте пузырьков воздуха при закупорить.
Примечание: клетки не следует оставлять долгое время в растворе P3. - Сразу же добавьте 5 мкл RNP комплекса (шаг 4.3) суспензии клеток.
- Добавьте смесь 1 мкл 100 мкм Cas9 электропорации усилитель на Cas9/RNPs/ячейку.
- Передача Cas9/RNPs/ячейку смесь на 20 мкл электропорации полоски.
- Аккуратно коснитесь полосы, чтобы убедиться, что образец охватывает в нижней части полосы.
- Начало 4D электропорации системы и выбрать программу EN-138 .
5. должность трансдукция
- Пусть отдых на 3 минуты в полоски клетки.
- 80 мкл предварительно уравновешенной СМИ культуры в кювет и нежно перенесите образца в колбы.
- 48 часов после трансдукции, экстракт геномной ДНК от 5 × 105 клеток для удаления гена скрининга.
- Усилить гена интереса, используя грунты, предназначенные на шаге 3.2 с комплекты полимеразы дна Taq.
- Форма heteroduplexes Ампликон ПЦР для T7EI пищеварение и инкубировать продукта на 30-60 минут с T7EI фермента в 37 ° C.
Примечание: T7EI, которую пробирного является предпочтительным для скрининга является быстрым, простым и обеспечивает чистый электрофорез результаты по сравнению с использованием пробирного инспектора. Однако, этот метод не может обнаружить вставок и удалений из < 2 базы, которые создаются не гомологичных концу вступление (NHEJ) деятельность в Cas9 RNPs экспериментов14. - Запустите переваривается ДНК на 1,5% агарозном геле на 110 V для 30-45 минут, каждые 15 минут визуализировать геля.
- Стимулировать остальнои клеток с mbIL21-выражая ячейки едока в соотношении 1:1.
- Через пять дней после стимуляции извлечь РНК для уровня выражения гена с помощью ПЦР.
- Проведение анализов Флуорексон как сообщалось ранее12. Вкратце Загрузите клетки-мишени с Флуорексон утра (в примере, используется 3 мкг/мл/1000000 DAOY клеток). Подготовьте НК-клеток для анализов цитотоксичность, отдыхает на ночь в IL2 (100 МЕ/мл) плюс или минус 10 нг/мл растворимых TGFβ. Проводить Флуорексон анализов в том же цитокинов, НК-клетки были положила в одночасье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Электропорация эффективность
Чтобы оптимизировать электропорации Cas9/RNPs, мы протестировали 16 различных программ с трансдукции GFP ненацеливания siRNA и плазмида ДНК в клетки. Потока cytometry анализ показали, что EN-138 самый высокий процент клеток жизнеспособность и электромеханической эффективности (35% живой GFP позитивные клетки) для обоих частиц (рис. 1 и рис. 2). Интересно, что эффективность использования этой программы для электропорации Cas9/RNPs был выше, как мы видели 60% снижение уровня мРНК TGFBR2 выражение (рис. 5). Кроме того генетически модифицированных НК-клеток может выросла и расширилась за 30 дней и криоконсервированных (данные не показаны).
Мутация пробирного
Cas9/RNPs, содержащий gRNA2, gRNA1 + gRNA2 и gRNA3 были успешно Нокаут гена ectodomain TGFBR2, но gRNA1 только не сделать обнаруживаемыми indels любые T7E1 (рис. 3). Кроме того Рисунок 4 показывает успешно нокаут человеческого HPRT1 (phosphoribosyltransferase 1 гипоксантин) расширенный NK клеток человека коммерчески при условии оформления. По данным группы денситометрия, пропорциональной indel ставки с помощью gRNA1 + gRNA2 привела к 34% группы TGFBR2 изменения НК-клеток, 25% для gRNA3 и 81% для HPRT гена Изменение NK клеток.
Ген выражение уровня пробирного
Как представитель нашего результата на рисунке 5 показан эффект Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) на уровень производства мРНК TGFBR2 ectodomain, проанализированы RT-PCR. Как видно на графике, уровень выражение mRNA гена целевых значительно сократилось.
Цитотоксичность
Как показано на рисунке 6, после инкубации gRNA1 + gRNA2, gRNA2 и gRNA3 Cas9/RNPs изменения клеток с TGFβ1, совместно культивируемых с DAOY клетки; изменение ячейки не показали каких-либо значительное снижение уровня их цитотоксичности по сравнению с группой контроля, которая была Ил-2 в СМИ на ночь. Этот результат демонстрирует, что Cas9/RNPs изменения клетки сохраняют их цитотоксичности функции в присутствии TGFβ1 и показывает, что изменение ячейки стал TGFβ1 устойчивостью.
Рис. 1. Эти цифры показывают эффективность электропорации siRNA и плазмида ДНК выражения гена GFP в НК-клеток, используя программу EN-138. Как видно здесь, жизнеспособность клеток NK-77,5% и 35% живых клеток были положительными GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Эта цифра показывает жизнеспособность и эффективность еще один из 16 программ, протестированных для оптимизации электропорации (DN-100) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рис. 3. Cas9/RNPs опосредованной TGFBR2 нокаут в расширенный () первичного NK клеток (b) измерено T7E1 мутация assay. T7E1 фермента признает и расщепляет несоответствие ДНК. Каждая небольшая группа (синие стрелки) представляет переваривается фрагментов ДНК, которые несут indel. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Cas9/RNPs - опосредованного HPRT нарушения в расширенной НК-клеток, измерено T7E1 мутация assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. уровень мРНК экспрессии TGFBR2 ectodomain в ТРИФОСФАТЫ изменение НК-клеток, представленный Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) с помощью RT-PCR. GAPDH был использован как ген внутреннего управления. Сокращение уровня РНК указывает на нарушение гена TGFBR2 (означает ± SEM, значение P < 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. а. Цитотоксичность исследования с использованием репрезентативной выборки Cas9/RNPs изменения (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 и gRNA3) клеток NK-показывает, что ночь инкубации клеток с TGFβ1 не значительно уменьшается их способностью лизировать клетки DAOY. b. при сравнении с немодифицированных НК-клеток, Cas9/RNP Изменение NK клеток (gRNA2 и gRNA3), менее чувствительны к TGFβ1 (средний ± SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| gRNA № | gRNA последовательность | Закать синтетических crRNA | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Таблица 1. Три дизайн оформления целевой экзона 4 TGFBR2 ectodomain как синтетических crRNA.
| TGFBR 2 ectodomain грунты передний | 5 GTC ТГК TCC ОБЩ TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain грунтовка REV | 5 GGG CCT КЛЯП AAT КТГ CAT TTA 3 |
Таблица 2. Грунты, используется для усиления ectodomain гена TGFBR2
| Компонент | Сумма (uL) |
| 200 мкм crRNA | 2.2 |
| 200 мкм tracer РНК | 2.2 |
| IDTE буфера | 5.6 |
| Конечный продукт | 10 |
Таблица 3. Форма crRNA:tracerRNA / комплекс с помощью 200 мкм РНК
| Компонент | Сумма (мкл) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA дуплекс (из шага 4.2) | 2 (200 пмоль) |
| ALT-R Cas9 эндонуклеазы (61 сток мкм) | 2 |
| Общий объем | 5 ul |
Таблица 4. Для одного crRNA:tracrRNA дуплекс реакции развести Cas9 эндонуклеазы до 36 мкм.
| Компонент | Сумма (мкл) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA дуплекс (напр. gRNA1) | 1 (100 пмоль) |
| crRNA:tracrRNA дуплекс (напр. gRNA2) | 1 (100 пмоль) |
| ALT-R Cas9 эндонуклеазы | 2 |
| Общий объем | 5 МКЛ |
Таблица 5. Для комбинации трансдукции crRNA:tracrRNA дуплексы развести Cas9 эндонуклеазы до 36 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ДНК зависимая модификация НК-клеток сложной4,9. Мы, таким образом, внедрили непосредственно комплекс синтетически преформированных рибонуклеопротеида (RNPs) и Cas9 белка как очищенный протеин в основной и расширенный NK клеток8. Этот метод позволил нам устранить укупорки, хвостохранилища, и другие процессы транскрипционный анализ и трансляционная начал РНК-полимераза II, который может вызывать апоптоз клеток НК связанные с ДНК зависимой трансдукции методами.
Кроме того метод сообщили здесь использует очищенный протеин Cas9 complexed как Cas9/RNPs, которые активны сразу же после электропорации и деградации быстро, тем самым увеличивая на цель и уменьшения пробить эффекты текущей протоколам 5 , 6 , 7 , 16. Кроме того, оптимизация новый подход электропорации передавать Cas9/RNP с высокой эффективностью это еще один важный шаг, представленных здесь, которые применимы к любой другой гены интереса. Этот метод может быть расширена для модификации большего числа НК-клеток, использование коммерчески доступных больше электропорации кюветы (данные не показаны).
В целом Cas9/RNPs может использоваться для генетически модифицировать НК клеток человека основной и расширенный для иммунотерапии рака, используя метод выше описанных. Наши результаты также показали, что успешный Нокаут гена TGFBR2 ectodomain приводит к эти измененные НК-клетки становятся устойчивыми TGFβ111.
Сочетая RNP доставки с источником дна шаблона (например, естественно recombinogenic аденоассоциированный вирус (AAV) доноров векторов) могут позволить участкам гена вставки гомологичная рекомбинация3,18,19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL служит/служил в качестве консультанта для курьера терапии, обсидиан терапии, Intellia терапии, Merck научно-исследовательских лабораторий и Miltenyi Биотек и справедливости/лидерство в CytoSen терапии.
Acknowledgments
Мы признаем Брайан Tullius за его любезное помощь в редактировании рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
