Summary
Schattingen van de hele nier nephron nummer zijn belangrijk klinisch en experimenteel, want er is een omgekeerde associatie tussen nephron aantal en een verhoogd risico op nier-en hart-en vaatziekten. Hierin, wordt het gebruik van de zure methode van de vergisting, die snelle en betrouwbare ramingen van het gehele nephron aantal van de nier verstrekt, aangetoond.
Abstract
Nephron schenking verwijst naar het totale aantal nephrons een individu is geboren met, als nephrogenesis bij de mens is voltooid door 36 weken van de dracht en geen nieuwe nephrons worden gevormd na de geboorte. Nephron nummer verwijst naar het totale aantal nephrons gemeten op elk punt in de tijd na de geboorte. Zowel beïnvloeden de genetische als milieufactoren zowel nephron schenking als aantal. Inzicht in hoe specifieke genen of factoren van invloed op het proces van nephrogenesis en nephron verlies of ondergang is belangrijk als individuen met een lagere nephron schenking of het aantal wordt gedacht dat een hoger risico op het ontwikkelen van renale of hart-en vaatziekten. Inzicht in hoe milieurisico's in de loop van het leven van een persoon beïnvloedt nephron aantal zal ook van vitaal belang bij het bepalen van toekomstige ziekterisico. Aldus, is de capaciteit om geheel nier nephron aantal snel en betrouwbaar te beoordelen een basis experimentele vereiste om mechanismen beter te begrijpen die bijdragen tot of bevorderen nephrogenesis of nephron verlies. Hier beschrijven we de zure methode voor de schatting van de hele nier nephron nummer op basis van de procedure beschreven door Damadian, Shawayri, en Bricker, met lichte wijzigingen. De zure methode zorgt voor snelle en betrouwbare schattingen van het aantal nephron (zoals beoordeeld door het tellen van glomeruli) die binnen 5% van die bepaald met behulp van meer geavanceerde, zij het duur, methoden zoals Magnetic Resonance Imaging. Bovendien is de methode van de zure verwerking een uitstekende high-throughput methode om nephron aantal in grote aantallen steekproeven of experimentele voorwaarden te beoordelen.
Introduction
Nephron is zowel de fundamentele structurele als functionele eenheid van nier1. Structureel, de nephron bestaat uit de kluwen (capillairen en podocytes) gelegen binnen de Bowman de capsule en de renale tubulus, bestaande uit de proximale tubulus, de lus van Henle, en de distale tubulus die eindigt in de verzamelbuis. Functioneel, de rol van de nephron is de filtratie en heropname van water en elektrolyten en de secretie van afval. In het algemeen, nephrogenesis is voltooid op 36 weken van de dracht bij de mens en kort na de geboorte in verschillende soorten, zoals de muis en de rat2. Nephron schenking verwijst naar het totale aantal nephrons dat een individu is geboren met, terwijl Nephron aantal is het totale aantal nephrons gemeten op elk moment na de geboorte3. De term nephron nummer en glomerulaire nummer worden vaak door elkaar gebruikt. Omdat er slechts een kluwen per nephron, de beoordeling van glomeruli nummer is een belangrijke surrogaat voor het schatten van nephron nummer.
De beoordeling van nephron schenking en nephron aantal is van klinisch belang aangezien de studies een vereniging tussen nephron schenking en verminderde nephron aantallen met een verhoogde weerslag van cardiovasculaire ziekte4,5 hebben aangetoond ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. op basis van bevindingen in de nieren bij autopsie, Brenner merkte op dat hypertensieve personen gepresenteerd met een lager totaal aantal nephrons dan normotensive individuen16. Zo, Brenner hypothetische dat er een omgekeerde relatie tussen nephron aantal en het risico op het ontwikkelen van hypertensie later in het leven. Brenner ook hypothetische dat een vermindering van nephron aantal werd gecompenseerd door de nephrons dat bleef. Met het oog op de normale filtratietarief in de nieren te handhaven, residuele nephrons compenseren door het verhogen van hun glomerulaire oppervlak (glomerulaire hypertrofie), waardoor het werken aan een nadelig effect van nephron verlies op de nierfunctie te verzachten4 ,16.
Terwijl de bescherming op de korte termijn, glomerulaire hypertrofie, op de lange termijn, leidt tot een verhoogde natrium-en vochtretentie, verhoogde extracellulaire vloeistof volume, en verhogingen van de arteriële bloeddruk, wat leidt tot een vicieuze cirkel van verdere stijgingen in glomerulaire capillaire druk, glomerulaire hyperfiltratie, en nephron littekens (sclerose) en verwonding4,16.
Het verkrijgen van schattingen of tellingen van nephron nummer bieden een paar experimentele voordelen: 1) het geeft informatie over het proces van nephrogenesis, die vervolgens kan worden gekoppeld aan specifieke genen of factoren in het embryo of de moeder-foetale omgeving, en 2) Er is een vereniging van nephron nummer met hart-en vaatziekten en, dus is er het potentieel dat de ramingen van nephron nummer kan worden gebruikt om toekomstige cardiovasculaire risico te voorspellen2,17,18, 19 , 20 , 21 , 22. in aanvulling op de moeder-foetale omgeving, verschillende ziekten rechtstreeks effect nephron aantal en nierfunctie, met inbegrip van atherosclerose, diabetes, hypertensie, en zelfs normale veroudering2,9, 10,11,12,22,23. Aldus, is de beoordeling van het gehele nephron aantal van de nier belangrijk om zowel de genetische als milieufactoren te begrijpen die nephrogenesis (d.w.z., nephron schenking) en nephron aantal over de cursus van het leven van een persoon en de resulterende gevolgen beïnvloeden op de nierfunctie en de cardiovasculaire gezondheid.
Momenteel zijn er verschillende methoden beschikbaar voor de bepaling en kwantificering van nephron nummer, elk met zijn eigen voordelen en beperkingen24,25,26,27,28 ,29,30. Geavanceerde methoden voor het bepalen van hele nier nephron nummer omvatten stereological methoden, zoals de Dissector/fractionator methode, en Magnetic Resonance Imaging25,26. Vaak beschouwd als de goud-standaard voor het bepalen van hele nier nephron nummer, de Dissector/fractionator methode is zowel duur en tijdrovend. De recente vooruitgang en de verbetering van Magnetic Resonance Imaging en verwerking hebben de hulpmiddelen verstrekt om elk nephron individueel te tellen. Echter, Magnetic Resonance Imaging is niet alleen tijdrovend, maar ook extreem duur. Bovendien vereist zowel de Dissector/fractionator methode als de Magnetic Resonance Imaging geavanceerde technische expertise, waardoor het gebruik van dergelijke methoden in het merendeel van de onderzoekslaboratoria wordt beperkt.
De meeste methodes om nephron aantal te bepalen maken tellingen of ramingen die op de identificatie van glomeruli worden gebaseerd, aangezien zij gemakkelijk identificeerbaar structureel zijn. In deze paper, de zure methode voor het schatten van nephron aantal in hele nieren wordt beschreven en aangetoond27. De zure methode is snel, betrouwbaar en beduidend minder duur dan andere methoden, zoals de Dissector/fractionator methode en Magnetic Resonance Imaging. Bovendien, de zure methode biedt zeer herhaalbare schattingen van nephron nummer dat zijn gemeld te worden binnen het bereik van die bepaald met behulp van Magnetic Resonance Imaging26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leveringen en reagentia hieronder vermeld zijn voor de bepaling van de hele nier nephron nummer in een muis, dat is, twee nieren. Wijzigingen voor het gebruik van de zure methode voor de moedermaceraat worden geïdentificeerd met sterretjes. Alle experimentele protocollen die aan de nationale instituten van de gids van de gezondheid voor de zorg en het gebruik van proefdieren worden voldeden en werden goedgekeurd door de institutionele Commissie van de Dierenzorg en van het gebruik bij het medische centrum van de Universiteit van Mississippi.
1. de isolatie procedure van de nier
- Weeg de muis (of andere soorten) en euthanaseren het met een Isofluraan (5%-8%) overdosis of pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneale injectie).
- Zodra de muis is euthanized, open haar buikholte met behulp van fijne chirurgische schaar langs de middellijn.
- Til de darmen en de voortplanting vet aan de rechterkant van de buikholte. Door de bruto dissectie, isoleren van de linker nier. Met behulp van fijne chirurgische schaar, snijd de linker renale slagader en ader en zorgvuldig verwijderen van de linker nier, het plaatsen van de nier in een adequaat gelabeld (muis nummer/Identifier) Weeg boot met fosfor-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Herhaal de procedure voor de juiste nier.
- Verwijder elke nier van de respectieve wegen boot en plaats deze op een chirurgische gaas pre-bevochtigd met PBS.
- Het verlaten van de nier op de chirurgische gaas, snel verwijderen van alle aanhangige niet-renale weefsel (zoals perirenal vet of bijnier), gevolgd door het verwijderen van de renale capsule. Weeg elke nier individueel, het opnemen van het gewicht van de linker en rechter nier afzonderlijk in een laboratorium notebook.
2. homogenisering, incubatie, en het spannen procedures
- Zodra elke nier wordt gewogen, drain elke weeg boot van PBS en plaats de nieren terug in de juiste gelabelde weeg boot. Met behulp van een schone scheermesje, snijd de nieren in de helft, in de lengte. Plaats elke nier half naar beneden gericht en snijd elke helft in 2-mm of kleinere stukken.
- Met behulp van dezelfde RazorBlade, zorgvuldig te verzamelen en plaats de gehakte stukjes nieren in een gelabelde 15-mL kegelvormige buis (muis nummer/Identifier; links versus rechts nier).
- Herhaal de procedure voor de tegenovergestelde nier, met behulp van een nieuwe scheermesje. Plaats de gehakte nier in een apart gelabelde 15-mL conische buis.
- Voeg in een goed geventileerde rook kap 5 mL zoutzuur van 6 M toe aan elke kegelvormige buis van 15 mL.
- Vervang de dop aan de kegelvormige buis, voorzichtig roeren de nier/HCl mengsel, en plaats de 15-mL kegelvormige buis in een voorverwarmde waterbad ingesteld op 37 °C voor 90 min (* 120 min voor de rat nieren).
- Schud elke 15 minuten kort elke 15 mL-buis gedurende de incubatie om ervoor te zorgen dat alle weefsels aan HCl-zuur worden blootgesteld.
- Plaats een 18-G naald in een 5-mL spuit (* 10-mL spuit voor rat) en verwijder voorzichtig de spuit plunjer. Plaats de spuit in een conische buis van 50 mL (buis #1) in een rook kap.
- Verwijder de nier/HCl oplossing uit het waterbad en giet het weefsel oplossing in het open uiteinde van de spuit en zet de 15-mL kegelvormige buis opzij in een test buis rack. Vervang de zuiger voorzichtig en duw de plunjer langzaam om de oplossing door de naald en in buis #1 te extruderen.
- Was de 15 mL kegel buis met 5 mL PBS-oplossing. Wervel de PBS in de 15-mL kegel buis om eventuele resterende nier weefsel te solubilize.
- Nogmaals, verwijder voorzichtig de plunjer van de 5-mL spuit met de 18-G naald en giet de inhoud van de 15-mL kegelvormige buis in het open uiteinde van de spuit. Vervang voorzichtig de zuiger en spoel de spuit door voorzichtig naar beneden te duwen op de zuiger, in de buis #1. Herhaal dit proces 2x (3x in totaal uitgevoerd).
- Plaats een 21-G naald in een nieuwe 5-mL spuit (* 10-mL spuit voor rat) en verwijder voorzichtig de spuit plunjer. Plaats de spuit met de 21-G naald bevestigd in een nieuwe 50-mL conische buis (Tube #2).
- Giet de inhoud van de buis #1 in het open uiteinde van de spuit met de 21-G naald. Plaats voorzichtig de zuiger en spoel de spuit door voorzichtig naar beneden te duwen op de spuit plunjer en het plaatsen van de geëxtrudeerde oplossing in de buis #2.
- Was buis #1 met 5 mL PBS-oplossing. Swirl de PBS in buis #1 om om het even welk blijvend nier weefsel te solubilize.
- Nogmaals, verwijder voorzichtig de plunjer van de 5-mL spuit met de 18-G naald en giet de inhoud van de buis #1 in het open uiteinde van de spuit. Vervang voorzichtig de zuiger en spoel de spuit door voorzichtig naar beneden te duwen op de zuiger, extruderen oplossing in de buis #2. Herhaal dit proces 2x (3x in totaal uitgevoerd).
- Breng het totale volume van de buis #2 tot 50 mL door toevoeging van extra PBS, tot de 50-mL lijn op buis #2.
- Incubeer buis #2 met de oplossing van het nier weefsel in een buis rek op een tuimelschakelaar in een ijskast die bij 4 °C 's nachts wordt geplaatst (minimum 8-10 h).
3. telling van glomeruli en extrapolatie van het Nephron nummer
- Verwijder de buis #2 uit de koelkast en het gekorrelde weefsel opnieuw op te schorten door voorzichtig het omkeren van de buis meerdere malen om een homogene oplossing te creëren. Wij adviseren het tellen van glomeruli binnen 5 d na verwerking.
- Zorgvuldige hoeveelheid 500 µ L van de nier oplossing in een enkele put van een 12-well plaat. Herhaal dit 2x, het plaatsen van elke hoeveelheid in een aparte goed, zodat er drie putten van de nier-oplossing per nier, voor analyse in drievoud.
- Voeg 500 µ L van PBS aan elk van de drie putten met de nier oplossing, voor een 1:1 verdunning.
- Met behulp van een omgekeerde Microscoop, Tel het aantal glomeruli per well. Tellen wordt geholpen met behulp van een raster van 16 aparte secties geplaatst op de bodem van elk goed. Tel het aantal glomeruli per gerasterde sectie en dan som de telling per net om het totale aantal glomeruli per put te krijgen. Glomeruli zijn gemakkelijk identificeerbaar door hun sferische structuur. Extra identificatiemiddelen omvatten een roodachtige tint als gevolg van bloed gevulde haarvaten, evenals pre-of post-arterioles die blijven gehecht aan het lichaam van individuele glomeruli (Figuur 1).
- Voeg het totale aantal glomeruli geteld per elk van de drie putten en vervolgens verdeel ze door drie voor het gemiddelde aantal glomeruli per 500 µ L van nier-oplossing. Als het verschil in het gemiddelde aantal glomeruli per put groter is dan 10%, herhaal dan de nephron-tellende procedure, waarbij veel aandacht wordt besteed aan de homogene aard van de nier oplossing. Vermenigvuldig het aantal glomeruli geteld per well tijden 100 voor het gemiddelde aantal glomeruli per nier. Totaal nephron aantal kan worden uitgedrukt per nier of, met behulp van nier gewicht, per mg of g weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hieronder zijn representatieve schattingen van de hele nier nephron nummer van een gevestigde muismodel van hypertensie en een genetische rat model van leeftijdsgebonden chronische nierziekte. De belangrijkste kenmerken van glomeruli, zoals een sferische structuur met of zonder bijgevoegde pre-of post-arteriolaire of buisvormige constructies, worden gemarkeerd voor de nieuwe methoden van de zure snij methode (Figuur 1).
In het eerste experimentele voorbeeld, werden de totale nephron aantallen bepaald in muizen (mannelijke C57BL/6, 6 weken oud) die met voertuig (zoute) of angiotensine II voor 14 dagen worden toegediend. In voertuig-geïnfundeerd muizen, nephron aantal was 12.411 ± 248 nephrons per nier, zoals bepaald met behulp van de zure snij methode (Figuur 2). Deze schattingen zijn in overeenstemming met het bereik van hele nier nephron nummer eerder gemeld bij muizen (tabel 1). Angiotensine verhoogde atriale druk door ongeveer 40 mmHg na 14 dagen van infusie en werd geassocieerd met een significante vermindering van nephron aantal (9.122 ± 193 nephrons per nier) van bijna 26% (Figuur 2). Deze gegevens suggereren dat angiotensine II Infusion niet alleen geassocieerd met hypertensie, maar ook een significante vermindering van nephron aantal wordt geassocieerd met nephron verlies als gevolg van sclerose of glomerulaire letsel.
In het tweede experimentele voorbeeld, werden de vorige bevindingen van nephron aantal in een genetisch rat model van renale agenesie, het heterogene voorraad-afgeleide model van unilaterale renale agenesie (HSRA) rat, bevestigd. De HSRA model vertoont onvolledige penetrantie fenotypes voor gebreken van de nier-en urinewegen, met sommige dieren worden geboren normaal (met twee nieren) en anderen geboren met een nier. Bij ratten geboren met twee nieren (mannelijke hA-Control, 12 weken oud), schattingen van nephron aantal met behulp van de zure methode waren 27.288 ± 336 nephrons per nier (Figuur 3). In tegenstelling, in ratten geboren met een eenzame nier (mannelijke hA-solitair; 4 weken oud) schattingen van nephron aantal bleken significant lager te zijn bij 24.594 ± 883 nephrons per nier (Figuur 3). Schattingen van nephron aantal bereikt in deze monsters zijn ook in overeenstemming met de reeksen eerder gemeld in de rat (tabel 1). Merk op dat deze gegevens in overeenstemming zijn met eerdere bevindingen waarin hA-Solitaire ratten bleken te vertonen verminderde nephron schenking of nummers (in vergelijking met een controle nier) meest waarschijnlijke afspiegeling van de onderliggende genetische factoren geassocieerd met zijn geboren met een enkele nier31.
Figuur 1 : Belangrijkste id's van glomeruli voor het tellen en beoordelen van hele nier nephron nummer. Glomeruli zijn gemakkelijk herkenbaar door hun sferische structuur, zoals aangegeven door de pijlen. Extra identificatiemiddelen bevatten een roodachtige tint als gevolg van bloed gevulde haarvaten, evenals pre-of post-arterioles (of tubuli) die kunnen blijven gehecht aan het lichaam van de individuele glomeruli volgende verwerking (zoals de een geïdentificeerd op de bodem van deze Micrograph). Ook aanwezig in dit beeld zijn overblijfselen van tubuli en bloedvaten. Vergroting = 10X; schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Nephron tellen in muizen. (A) representatief beeld van glomeruli van een enkele muis nier geplateerd in een 22,1-mm platte bodem goed van een 12-well cultuur plaat, zoals gezien met behulp van een omgekeerde Microscoop. Glomeruli en renale tubuli worden gezien bij matige dichtheid wanneer verdund door een factor van twee (0,5 mL nier oplossing plus 0,5 mL van 1x PBS). (B) effect van een 14-daags voertuig of angiotensine II infusie op nephron nummer in mannelijke C57Bl/6 muizen zoals beoordeeld door glomerulaire tellen. De angiotensine II infusie op 1.000 ng/kg/min (via osmotische minipump) werd geassocieerd met hypertensie en een markeerde een vermindering van nephron aantal in vergelijking met de nephron aantal in muizen doordrenkt met voertuig. Nephron nummers in voertuig-geïnfundeerd muizen zijn in overeenstemming met eerder gerapporteerde schattingen van Nephron aantal in muizen (tabel 1). Voertuig: n = 3, angiotensine II: n = 3, *p < 0,05. Foutbalken = SE. vergroting = 4X; schaalbalk = 250 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Nephron tellen bij ratten. (A) representatief beeld van glomeruli van een enkele rat nier geplateerd in een 22,1-mm platte bodem goed van een 12-well cultuur plaat, zoals gezien met behulp van een omgekeerde Microscoop. Glomeruli en renale tubuli worden gezien op een significant hogere dichtheid ten opzichte van die in de muis. (B) kwantificering van het nephron nummer in HSRA-Control en HSRA-s ratten blijkt dat nephron aantal is minder in HSRA-s in vergelijking met HSRA-C ratten en in overeenstemming met eerdere bevindingen in dit model31. HSRA-C, ratten geboren met twee nieren: n = 3; HSRA-S, ratten geboren met een eenzame nier: n = 3,* p < 0.05. Foutbalken = SE. vergroting = 4X; schaalbalk = 250 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Soort(en) | Nephron aantal per nier | Verwijzing |
| Muis | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Rat | 13000-27000 | 31, 33 |
| Schapen | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| Varken | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| Menselijke | 500000-2000000 | 8-15 |
Tabel 1: gerapporteerde reeksen van nephron nummer in verschillende soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met een goede experimentele techniek, de zure methode is ideaal voor het schatten van nephron aantal in hele nieren. Hoewel de nier in zuur wordt opgelost, blijft glomeruli grotendeels intact en is gemakkelijk identificeerbaar, makend het tellen van individuele glomeruli vrij gemakkelijk en ongecompliceerd. De zure snijtechniek is om verschillende redenen bijzonder voordelig. Ten eerste, de zure methode is een snelle en handige methode die relatief weinig in termen van kosten en fysieke inspanning vereist. Alle reagentia en verbruiksmaterialen die nodig zijn om de zure snij methode uit te voeren zijn gemakkelijk verkrijgbaar in de meeste basis laboratoria, de enige belangrijke vereiste dat toegang tot een omgekeerde Microscoop voor glomerulaire tellen. In termen van kosten, wordt geschat dat de zure methode kost slechts een paar honderd dollar per dier, dat is niet veel in vergelijking met de kosten in verband met andere methoden van hele nier glomerulaire tellen, zoals Magnetic Resonance Imaging, die kan variëren in duizenden dollars per dier van de scantijd en technische expertise.
Ten tweede, de zure methode van de verwerking impliceert beduidend minder weefsel-verwerkingstijd in vergelijking met andere methodes van geheel nier nephron aantal zoals Dissector/fractionator methode24. Van begin tot eind, de zure methode vereist minder dan 24 uur van de totale tijd, waarvan minder dan 1-2 uur wordt besteed verwerking nieren en vervolgens het tellen van de individuele glomeruli per experimenteel dier. In tegenstelling, de Dissector/fractionator methode is arbeidsintensieve, waarvoor een geschatte 15 uur arbeid (4-6 uur van de afdeling, 2-3 uur van kleuring, en 4-5 uur van het tellen van de tijd) per nier, niet met inbegrip van de 48-72 uur nodig is om de nieren in gl proces ycol methylmethacrylaat24. Door de voordelen van kosten en tijd, is de methode van de zure versnijding vooral nuttig in studies waarbij schattingen van het hele nier nephron nummer in grote aantallen dieren met of zonder genetische of farmacologische interventies moeten worden gemaakt. Zowel de kosten en tijd die betrokken zijn bij de Dissector/fractionator methode en Magnetic Resonance Imaging zijn beschouwd als een belangrijke beperkende factor in hun adoptie in de meeste onderzoekslaboratoria.
Ten slotte, de zure methode biedt schattingen van de hele nier nephron nummer dat vergelijkbaar zijn met maatregelen met behulp van meer geavanceerde methoden, zoals Magnetic Resonance Imaging26. Bijvoorbeeld, gebruikend kationische Ferritine-etikettering van glomeruli en driedimensionele beeldverwerking om elke nephron in één enkele nier van de Sprague-Delombaerde rat te tellen, bracht de Magnetic Resonance Imaging op gemiddelde tellingen van 34.000 individuele glomeruli per nier26. In niet-kationische Ferritine-gelabelde nieren, Magnetic Resonance Imaging leverde tellingen van 2.000 nephron-achtige structuren als gevolg van het tellen van niet-glomerulaire regio's van de nier met magnetische signalen van vergelijkbare grootte en vorm als Ferritine-label glomeruli. Wanneer deze artefacten worden afgetrokken van de tellingen bepaald door kationische Ferritine-gelabelde nieren, het effectieve aantal glomeruli bepaald, met behulp van Magnetic Resonance Imaging, is dichter bij 32.000 nephrons per nier26. In diezelfde studie brachten validatie experimenten gemiddeld glomerulaire van 31.000 per nier met behulp van de zure methode26. Zo produceert de zure snij methode schattingen van de hele nier nephron nummer dat binnen < 5% van die bepaald met behulp van State-of-the-art technieken zoals Magnetic Resonance Imaging.
Hoewel er verschillende belangrijke voordelen in verband met de zure snij methode, onderzoekers moeten zich ook bewust zijn van de beperkingen in verband met deze methode. Een beperking heeft betrekking op het gebruik van hele nieren. Aangezien de gehele nier wordt opgelost en gehomogeniseerd, kan de informatie betreffende de ruimtedistributie van glomeruli binnen de nier schors worden bepaald niet. Als het kennen van de intrarenal verdeling van glomerulaire volume belangrijk is, dan zou het gebruik van Magnetic Resonance Imaging een beter-geschikte methode zijn.
In vergelijking met andere methoden lijkt het gebruik van de methode van de zure moedermaceraat enigszins te onderschatten het totale nephron aantal. De kleinere schattingen zijn waarschijnlijk deels te wijten aan de ontbinding van een klein percentage van glomeruli in het zuur of tijdens de vermeerdering van de nier. Bovendien, met veroudering of ziekte, is er een verlies van functionele nephrons, die, hoewel niet bij te dragen tot de vorming van urine, kan gevoeliger zijn voor zure afsnij werk en kan worden vernietigd tijdens de verwerking, waardoor bijdragen tot lagere schattingen van de totale nephron Nummer. Zo moet de zorg worden gebruikt bij het verzamelen en verwerken van nieren, zodat er geen nier weefsel te verlaten in vivo bij het hakken van de nieren, of in de spuiten bij het uitdrijven van weefselmonsters. Globaal, echter, schijnt de onderschatting van totaal nephron aantal toe te schrijven aan weefsel verwerking vrij klein.
Zoals het tellen van glomeruli met behulp van de zure methode is subjectief, de onderschatting van nephron aantal kan ook een afspiegeling zijn van de waarnemer bias, die gemakkelijk kan worden overwonnen door metingen worden uitgevoerd door twee afzonderlijke onderzoekers verblind om informatie over experimenteel dier of voorwaarde. Als er een belangrijke bezorgdheid bestaat over wat een kluwen is, zou een alternatieve benadering het infunderen van proefdieren met ijzeroxide voor euthanasie inhouden. Wanneer intraveneus toegediend, zal ijzeroxide binnenkomen en worden gevangen in de kluwen; aldus, zou de verwerkte glomeruli donkere zwarte moeten bevlekt, toestaand voor een grotere identificatie van glomeruli wanneer het tellen van30.
De methode van de zure vervorming schat het hele nier nephron getal op basis van de meting van kleine monsters (3 x 0,5 mL of 1,5 mL) in tegenstelling tot metingen van de gehele oplossing van de nier (50 mL). De zure methode is zeer reproduceerbaar in de natuur, en glomeruli telt binnen monsters van een enkele nier en binnen experimentele groepen blijken te zijn zeer consistent. Bovendien, representatieve resultaten gemeld in de huidige studie van wild-type C57Bl/6 muizen en ratten geboren met een nier (Figuur 2 en 3) zijn zeer consistent met eerdere bevindingen, evenals met de eerder gemelde reeksen (tabel 1 )5,31. Desgewenst kunnen extra metingen gemakkelijk worden gemaakt om het totale nephron aantal per nier beter te schatten.
Terwijl de zure verwerkingstechniek betrouwbare en herhaalbare schattingen van nephron aantal biedt, wordt deze methode niet aanbevolen voor het verkrijgen van metingen van glomerulaire volume, aangezien blootstelling aan zuur het meest waarschijnlijk veranderingen in glomeruli volume veroorzaakt. Aangezien de bepaling van glomerulaire volume is belangrijk bij het bepalen van de hele nier glomerulaire oppervlakte, is het raadzaam dat deze metingen worden gemaakt met behulp van histologische en stereological methoden24,25. In het bijzonder, stereological methoden die gebruik maken van glycol methylmethacrylaat embed nieren om weefsel zwelling en expansie te beperken en, dus, handhaven glomerulaire geometrie zo dicht mogelijk bij dat in vivo.
Ten slotte, een andere beperking van de zure snijtechniek, en een die gemeenschappelijk is voor andere methoden van de beoordeling van nephron nummer, is dat er geen informatie over glomerulaire functie (zoals glomerulaire filtratie rate) kan worden vastgesteld van glomeruli eenmaal Verwerkt. Dus, terwijl individuele glomeruli kan worden geteld, de functionele status (urine-vormende of niet-urine-vormende) kan niet worden bepaald met behulp van de zure methode van de moedermaceraat. Op dezelfde manier kan geen longitudinale informatie worden vastgesteld met behulp van de zure methode bij individuele muizen. In plaats daarvan zijn afzonderlijke groepen dieren op verschillende tijdstippen nodig om inzicht te krijgen in veranderingen in nephron getal over de levensduur van een dier of voor-of postgenetic of farmacologische interventie.
Samengevat, de zure methode is een lage kosten, high-throughput, en efficiënte methode om hele nier nephron nummer te schatten. De methode van de zure vervorming zorgt voor een hoge mate van reproduceerbaarheid, zoals blijkt uit de twee hier gepresenteerde voorbeelden, alsmede door degenen die eerder werden gerapporteerd met behulp van deze methode18,19,20,21 , 22 , 28. terwijl het gebruik van de methode van de zure vervorming voor gebruik in de muis (en rat) werd beschreven, kan de zure snij methode ook worden geschaald voor gebruik in grotere soorten, zoals de hond en het varken27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund voor een deel door de nationale instituten van gezondheid, nationaal hart, Long, en het Instituut van het bloed (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
