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Developmental Biology

माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए वयस्क और प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस फेफड़ों की संवहनी कास्टिंग

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/61242
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 3, 1
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

इस तकनीक का उद्देश्य फेफड़ों की मुद्रास्फीति और फेफड़े की धमनी के माध्यम से रेडियो-अपारदर्शी बहुलक-आधारित यौगिक के इंजेक्शन के माध्यम से प्रारंभिक प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों के फेफड़े के धमनी नेटवर्क का पूर्व वीवो विज़ुअलाइज़ेशन है। कास्ट ऊतकों के लिए संभावित अनुप्रयोगों पर भी चर्चा की जाती है।

Abstract

रक्त वाहिकाएं 3-आयामी अंतरिक्ष में जटिल नेटवर्क बनाती हैं। नतीजतन, यह नेत्रहीन की सराहना करना मुश्किल है कि कैसे संवहनी नेटवर्क एक ऊतक की सतह को देख कर बातचीत और व्यवहार करते हैं । यह विधि फेफड़ों के जटिल 3-आयामी संवहनी वास्तुकला की कल्पना करने का साधन प्रदान करती है।

इसे पूरा करने के लिए, एक कैथेटर फेफड़े की धमनी में डाला जाता है और वैक्यूलेचर को एक साथ रक्त से निकाल दिया जाता है और प्रतिरोध को सीमित करने के लिए रासायनिक रूप से फैलाया जाता है। फेफड़ों तो एक मानक दबाव पर श्वासनली के माध्यम से फुलाया जाता है और बहुलक यौगिक एक मानक प्रवाह दर पर संवहनी बिस्तर में संचार किया जाता है । एक बार पूरे धमनी नेटवर्क भर जाता है और इलाज के लिए अनुमति दी है, फेफड़ों के वाक्यूलेचर सीधे कल्पना या एक माइक्रो सीटी (μCT) स्कैनर पर छवि हो सकती है ।

जब सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया जाता है, तो चूहों में फेफड़े की धमनी नेटवर्क की सराहना कर सकते हैं जो शुरुआती प्रसवोत्तर उम्र से लेकर वयस्कों तक होते हैं। इसके अतिरिक्त, पल्मोनरी धमनी बिस्तर में प्रदर्शन करते समय, इस विधि को अनुकूलित कैथेटर प्लेसमेंट और एंडपॉइंट्स के साथ किसी भी संवहनी बिस्तर पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

इस तकनीक का ध्यान चूहों में बहुलक आधारित यौगिक का उपयोग करके पल्मोनरी धमनी वास्तुकला का दृश्य है। जबकि मस्तिष्क, हृदय और गुर्दे जैसे प्रणालीगत संवहनी बिस्तरों पर व्यापक कार्य किया गया है1,,2,,3,,4,,5,फेफड़े की धमनी नेटवर्क की तैयारी और भरने के बारे में कम जानकारी उपलब्ध है। इसलिए, इस अध्ययन,का उद्देश्य पिछले काम6,,7,8 पर विस्तार करना और एक विस्तृत लिखित और दृश्य संदर्भ प्रदान करना है जिसे जांचकर्ता आसानी से फेफड़े के धमनी पेड़ की उच्च-संकल्प छवियों का उत्पादन करने के लिए अनुसरण कर सकते हैं।

जबकि लेबलिंग और इमेजिंग फेफड़ों के वाक्यूलेचर के लिए कई तरीके मौजूद हैं, जैसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, इकोकार्डियोग्राफी, या सीटी एंजियोग्राफी9,,10, इनमेंसे कई तौर-तरीके छोटे जहाजों को पर्याप्त रूप से भरने और/या कैप्चर करने में विफल रहते हैं, जो अध्ययन किया जा सकता है। धारावाहिक खंड और पुनर्निर्माण जैसे तरीके उच्च संकल्प प्रदान करते हैं लेकिन समय / श्रम-प्रधान11,12,13हैं । पारंपरिक जंग 10 , 13 , 14 ,,,15,,16में कोमल ऊतक अखंडता के साथ समझौता किया13जाताहै ।16 यहां तक कि पशु आयु और आकार कारक बन जाते है जब एक कैथेटर शुरू करने का प्रयास या, संकल्प की कमी है । दूसरी ओर, बहुलक इंजेक्शन तकनीक धमनियों को केशिका स्तर तक भरती है और जब μCT के साथ संयुक्त होती है, तो अद्वितीय संकल्प5के लिए अनुमति देती है। 14 के रूप में युवा के रूप में माउस फेफड़ों से नमूने सफलतापूर्वक8 डाली गई है और घंटे के एक मामले में संसाधित । इन्हें अनिश्चित काल के लिए पुनः प्राप्त किया जा सकता है, या यहां तक कि मौजूदा सॉफ्ट टिश्यू17से समझौता किए बिना हिस्टोलॉजिकल तैयारी/इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के लिए भी भेजा जा सकता है। इस विधि के लिए मुख्य सीमाएं सीटी उपकरण/सॉफ्टवेयर की अग्रिम लागत, इंट्रावैस्कुलर दबाव की सटीक निगरानी के साथ चुनौतियां हैं, और एक ही जानवर में देशांतर डेटा प्राप्त करने में असमर्थता है ।

यह कागज मौजूदा काम पर बनाता है और फेफड़े की धमनी इंजेक्शन तकनीक को और अधिक अनुकूलित करने और आयु/आकार से संबंधित सीमाओं को पोस्टनेटल डे 1 (P1) के लिए नीचे धक्का हड़ताली परिणाम उपज । यह उन टीमों के लिए सबसे उपयोगी है जो धमनी संवहनी नेटवर्क का अध्ययन करना चाहती हैं। तदनुसार, हम कैथेटर प्लेसमेंट/स्थिरीकरण के लिए नए मार्गदर्शन प्रदान करते हैं, भरने की दर पर नियंत्रण में वृद्धि/ परिणामस्वरूप डाले तो भविष्य लक्षण वर्णन और morphologic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । शायद अधिक महत्वपूर्ण बात, यह पहला दृश्य प्रदर्शन है, हमारे ज्ञान के लिए, जो इस जटिल प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ता को चलता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को नेशनल हार्ट लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (एसीयूसी) ने मंजूरी दे दी है ।

1. तैयारी

  1. माउस को हेपरिन (1 यूनिट/जी माउस बॉडी वेट) के साथ इंट्रापेरिटी इंजेक्ट करें और इसे 2 मिनट के लिए एम्बुलेट करने की अनुमति दें।
  2. एक सीओ2 कक्ष में जानवर को इच्छामृत्यु।
  3. एक शल्य बोर्ड पर एक रीढ़ की स्थिति में माउस की व्यवस्था और टेप के साथ बोर्ड के लिए सभी चार अंगों को सुरक्षित। ठीक विच्छेदन के लिए आवर्धन का उपयोग करें।

2. फेफड़ों और श्वासनली को उजागर करना

  1. बालों के हस्तक्षेप को कम करने के लिए माउस के वेंट्रल साइड को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
  2. पेट की त्वचा को संदंश से समझें और नाभि क्षेत्र में कैंची से एक छोटा सा चीरा बनाएं। पेट की मांसपेशी और त्वचा के बीच फासल परत में कैंची के सुझावों स्लाइड और दो परतों को अलग शुरू करते हैं । पेट, रिबकेज और गर्दन से त्वचा को हटाते हुए, रोककर काम करें।
  3. पेट की मांसपेशी को कैंची से खोलें और डायाफ्राम के उजागर होने तक दोनों तरफ बाद में काट लें।
  4. धीरे-धीरे xiphoid प्रक्रिया को समझें और पतली, अर्धपरिवहन डायाफ्राम के माध्यम से कौडल फेफड़ों के दृश्य को अधिकतम करने वाले रिबकेज को थोड़ा उठाएं। सावधानी से xiphoid प्रक्रिया के नीचे डायाफ्राम में एक छोटा सा चीरा करें। फेफड़े गिर जाएंगे और डायाफ्राम से दूर हो जाएंगे। डायाफ्राम को रिबकेज से दूर करें, इस बात का ध्यान रखें कि फेफड़ों के परेंचिमा को निक न करें।
  5. अवर वेना कावा (आईवीसी) और घेघा का पता लगाएं और तोड़ दें जहां वे डायाफ्राम से गुजरते हैं। फेफड़ों के संपर्क से बचने, वक्ष गुहा में किसी भी पूलिंग रक्त को साफ करने के लिए धुंध का उपयोग करें।
  6. एक बार फिर xiphoid समझ और धीरे से लिफ्ट । फेफड़ों के संपर्क से बचने के लिए रिबकेज को द्विपक्षीय रूप से (मोटे तौर पर मिडक्सिलरी लाइन पर) काटें। पूर्वकाल रिबकेज को पूरी तरह से हटा दें, जिससे मनुब्रीम से ठीक पहले स्टर्नल कोण के साथ अंतिम कट हो।
  7. एक पूर्व भरे सिरिंज का उपयोग करना, उदारतापूर्वक बाहर सुखाने को रोकने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) के साथ फेफड़ों गीला। प्रक्रिया के दौरान इस दिनचर्या जारी रखें।
  8. संदंश का उपयोग करके, मनुब्रियम को समझें और धीरे-धीरे शरीर से दूर रहें। कैंची का उपयोग करके, मनुब्रियम में 1-2 मिमी पार्श्व काटें, क्लैविकल्स को तोड़ें, और हटा दें। इससे नीचे की थाइमस बेनकाब हो जाएगी।
  9. थाइमस के प्रत्येक पालि को समझें, अलग खींचें, और हटा दें। इस प्रक्रिया को उपमंडीबुलर ग्रंथि के साथ दोहराएं। अंत में, श्वासनली को ओवरले करने वाले मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें।
    नोट: विच्छेदन के बाद, दिल, आरोही महाधमनी (ए. ए.), फेफड़े की धमनी ट्रंक (पैट), और श्वासनली दिखाई देना चाहिए । सुनिश्चित करें कि ट्रंक से प्राथमिक धमनी शाखाओं विभाजित या घायल नहीं हैं।

3. पीए कैथेटराइजेशन और रक्त परफ्यूजन

  1. यूनिट 1 को इकट्ठा करने के लिए, पीई-10 ट्यूबिंग के 15 सेमी को 30 जी सुई के हब पर मिलाएं और पीबीएस में 10-4 मीटर सोडियम नाइट्रोप्रसाइड (एसएनपी) के साथ पहले से भरे 1 मिलियन सिरिंज से जुड़े हुए हैं। प्राइम प्लंजर को आगे बढ़ाते हुए टयूबिंग जब तक सभी हवा इस इकाई (चित्रा 1)से पर्ज है ।
    सावधानी: SNP विषाक्त है अगर निगल लिया । त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। हैंडलिंग के बाद स्किन को अच्छी तरह से धो लें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    1. वैकल्पिक रूप से, यूनिट 2 को इकट्ठा करें। चूहों के बाद 7 (P7) और छोटे के लिए, अपने हब से एक अतिरिक्त 30 जी सुई अलग करने के लिए एक हीमोस्टेट का उपयोग करें और यूनिट 1(चित्रा 1)के ट्यूबिंग के खुले अंत पर सुई धागा ।
  2. सुई के बजाय, 7-0 रेशम की 10 सेमी लंबाई के एक छोर को समझने के लिए घुमावदार तेज संदंश का उपयोग करें। एक तरफ से प्रवेश करने वाले दिल के शीर्ष को भेदें और मांसपेशियों के माध्यम से और दूसरी तरफ से संदंश के सुझावों को पारित करें। संदंश के एक और सेट के साथ रेशम को पकड़ें और लगभग 2 सेमी लंबाई खींचें और बंद कर दें। सीवन के शेष 8 सेमी अंत ले लो, दिल कौडलाई tugging, और सर्जिकल बोर्ड के अंत टेप ।
    नोट: यह तनाव पैदा करेगा, आगे महान जहाजों को उजागर करने और जगह में दिल tethering, फेफड़े की धमनी में कैथेटर के आसान प्लेसमेंट के लिए अनुमति देता है ।
  3. एए और पीएटी दोनों के तहत घुमावदार संदंश की युक्तियों को हुक करें। 7-0 रेशम की 3 सेमी लंबाई को खोलने के माध्यम से वापस खींचें और एक एकल फेंक ढीला सीवन बनाएं।
  4. कैंची का उपयोग दिल के शीर्ष की ओर एक 1-2 मिमी चीरा बनाने के लिए, पतली दीवारों सही वेंट्रिकल (आरवी) मर्मज्ञ, कैथेटर (यूनिट 1) के सम्मिलन के लिए अनुमति देने के लिए । प्रविष्टि से पहले, पुष्टि करें कि सिस्टम में कोई हवा नहीं है। प्राइमेड ट्यूबिंग को सही वेंट्रिकल में पेश करें और धीरे-धीरे अर्धपरिवहन पतली दीवारों वाले पैट में आगे बढ़ें।
    1. नेत्रहीन सत्यापित करें कि कैथेटर या तो बाईं या दाएं फेफड़े की शाखाओं में उन्नत नहीं हुआ है और फेफड़े की धमनी शाखा बिंदु को नहीं करता है। टेप का उपयोग करना, सर्जिकल बोर्ड को ट्यूबिंग के डिस्टल हिस्से को सुरक्षित करें।
      नोट: आरवी की पहचान करने के लिए, दिल के दाईं ओर चुटकी के लिए संदंश का उपयोग करें । बाएं वेंट्रिकल के विपरीत, आरवी की अपेक्षाकृत पतली मुक्त दीवार को आसानी से समझा जाना चाहिए।
    2. P7 से छोटे चूहों के लिए, एक माइक्रोमैनिपुलेटर के लिए यूनिट 2 संलग्न करें और जोड़तोड़ का उपयोग कर ऊपर वर्णित के रूप में पीएटी में इकाई के सुई अंत परिचय ।
  5. धीरे-धीरे दोनों महान जहाजों के चारों ओर ढीले सीवन को कस लें और दिल को प्राकृतिक विश्राम की स्थिति में वापस करने के लिए चरण 3.2 में बनाए गए सीवन की 8 सेमी लंबाई में कटौती करें। कैथेटर अब पैट के भीतर मजबूती से सुरक्षित है ।
  6. सिस्टम से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए दिल के बाएं अर्क को क्लिप करें।
  7. सिरिंज पंप में सुरक्षित एसएनपी युक्त सिरिंज (यूनिट 1 या यूनिट 2, आकार निर्भर) और रक्त को फ्लश करने और वेक्यूलेचर को अधिकतम करने के लिए 0.05 एमएल/मिनट की दर से समाधान को छिद्रित करें। रक्त/perfusate काटा auricle के माध्यम से बाहर निकल जाएगा । जब तक परफ्यूजन स्पष्ट नहीं हो जाता है तब तक परफ्यूजन जारी रखें (वयस्क माउस में ~ 200 माइक्रोन, छोटे जानवरों के लिए कम)।
    नोट: जब कम चिपचिपाहट PBS/SNP perfusing, एक अपेक्षाकृत अधिक जलसेक दर समय की बचत के हित में इस्तेमाल किया गया था । ओवरफिलिंग, टूटना और डिस्टल एंडपॉइंट्स पर नियंत्रण को अधिकतम करने के लिए अधिक चिपचिपा बहुलक यौगिक धीमी दर से संचारित होता है।

4. ट्रेकोस्टोमी और फेफड़ों की मुद्रास्फीति

  1. फेफड़ों की मुद्रास्फीति इकाई(चित्रा 2) कानिर्माण ।
    1. एक लचीला प्लास्टिक 24 जी नसों में (चतुर्थ) कैथेटर (सुई हटाया) /तितली जलसेक एक स्टॉपकॉक के लिए सेट, एक खुले ५० मिलीलीटर सिरिंज (कोई प्लंजर) से जुड़ी कनेक्ट करें । एक अंगूठी स्टैंड से सिरिंज लटका।
    2. सिरिंज में 10% बफर फॉर्मेलिन जोड़ें। स्टॉपकॉक खोलें, जिससे फॉर्मेलिन ट्यूबिंग में प्रवेश कर सके और सिस्टम से सभी हवा को शुद्ध कर सके। स्टॉपकॉक को बंद करें और सिरिंज को तब तक उठाएं जब तक कि मेनिस्कस श्वासनली8से 20 सेमी ऊपर न हो जाए।
      सावधानी: फॉर्मेलिन ज्वलनशील, कैंसरजनक, तीव्रता से विषाक्त है जब निगला जाता है, और त्वचा की जलन, गंभीर आंखों की क्षति, त्वचा संवेदीकरण और रोगाणु कोशिका म्यूटेजेनिकिटी का कारण बनता है। घूस और त्वचा और आंखों के साथ संपर्क से बचें। वाष्प या धुंध के साँस लेने से बचें। इग्निशन के स्रोतों से दूर रहें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  2. दो ढीले टांके को 2-4 मिमी के अलावा क्रिकॉइड उपास्थि से कम रखें।
  3. कैंची का उपयोग करके, क्रिककोथायराइड स्नायु में एक छोटा सा चीरा टांके से बेहतर बनाएं।
  4. उद्घाटन में चतुर्थ कैथेटर डालें और दो ढीले टांके से परे टिप अग्रिम।
  5. श्वासनली के चारों ओर टांके कसें और स्टॉपकॉक खोलें। फॉर्मेलिन को गुरुत्वाकर्षण द्वारा फेफड़ों में प्रवेश करने की अनुमति दें और फेफड़ों को पूरी तरह से फुलाने के लिए 5 मिनट की प्रतीक्षा करें। यदि फेफड़े मुद्रास्फीति के दौरान रिबकेज का पालन करते हैं, तो रिबकेज के बाहर कुंद इत्तला दी संदंश के साथ समझें और लोब्स को मुक्त करने में सहायता करने के लिए सभी दिशाओं में आगे बढ़ें। फेफड़ों से सीधा संपर्क न करें।
  6. 5 मिनट के बाद, पहले सीवन और लिगेट से परे चतुर्थ कैथेटर वापस । दूसरे सीवन के लिए दोहराएं। फेफड़े अब एक बंद, दबाव वाली स्थिति में फुलाया जाता है।

5. वाक्यूलेचर कास्टिंग

  1. 1.5 एमएल ट्यूब में, बहुलक के 8:1:1 समाधान 8 के1 एमएल तैयार करें: पतला: इलाज एजेंट और अच्छा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे कई बार उलटा करें।
  2. एक 1 सीसी सिरिंज से प्लंजर निकालें, एक दस्ताने उंगली के साथ विपरीत छोर को कवर, और सिरिंज में बहुलक यौगिक डालना । सावधानी से प्लंजर, उलटा, और सभी हवा को हटाने और सिरिंज की नोक पर एक meniscus बनाने के लिए प्लंजर अग्रिम ।
  3. सुई के हब से एसएनपी/पीबीएस सिरिंज निकालें और एक मेनिस्कस बनाने के लिए अतिरिक्त पीबीएस को हब में ड्रिप करें । सावधानी से फंस हवा के लिए हब की जांच करें, यदि आवश्यक हो तो उखाड़ फेंकना, और मेनिस्कस में सुधार करें। बहुलक यौगिक से भरी सिरिंज के लिए हब में शामिल हों।
    नोट: दोनों सिरों पर एक meniscus बनाना काफी हवा के लिए प्रणाली में प्रवेश करने की संभावना कम कर देता है ।
  4. सिरिंज पंप पर पॉलीमर कंपाउंड से भरी सिरिंज को अटैच करें और 0.02 एमएल/मिनट पर इंसंफ्यूज करें ।
    नोट: छोटे फेफड़ों के लिए, एक धीमी दर ओवरफिलिंग को रोकने के लिए सहायक हो सकती है, लेकिन, आवश्यक नहीं है।
  5. यौगिक की निगरानी के रूप में यह स्वतंत्र रूप से पीई ट्यूबिंग नीचे ले जाता है और सिरिंज की मात्रा नोट के रूप में यह पैट में प्रवेश करती है । भरना जारी रखें जब तक सभी lobes पूरी तरह से केशिका स्तर तक भर रहे है और सिरिंज पंप बंद करो । सिरिंज की मात्रा को फिर से चेक करें।
    नोट: कई रन के बाद अनुमानित मात्रा का उपयोग अनुमानित एंडपॉइंट (वयस्क माउस के लिए ~ 35 माइक्रोन और पी 1 पिल्ला के लिए ~ 5 माइक्रोन) को मापने के लिए किया जा सकता है। पंप के रुकने के बाद सिस्टम में अवशिष्ट दबाव पॉलीमर कंपाउंड को फेफड़े की धमनियों में धकेलता रहेगा। सभी फेफड़ों के पालि को समान दर पर भरना चाहिए।
  6. एक फाइबर ऑप्टिक सफाई पोंछ के साथ फेफड़ों को कवर, उदारतापूर्वक PBS लागू होते हैं, और शव कमरे के तापमान पर 30-40 मिनट के लिए अशान्त बैठने के लिए अनुमति देते हैं । इस अवधि के दौरान, बहुलक यौगिक इलाज और कठोर होगा।
  7. कैथेटर निकालें, माउस के बाहों/निचले आधे को तोड़ दें, और सिर/छाती को रात भर 10% बफर फॉर्मेलिन से भरे ५० एमएल शंकुकाल में रखें ।
  8. निर्धारण के बाद, श्वासनली को समझें और शेष रिब पिंजरे और छाती से दिल/फेफड़ों की इकाई को धीरे से अलग करें। दिल/फेफड़ों के ब्लॉक को फॉर्मेलिन भरी प्रस्फुटन शीशी में रखें। बाकी को छोड़ दें।

6. कास्टिंग के लिए वैकल्पिक संवहनी बिस्तर (तालिका 1)

नोट: प्रत्येक लक्ष्य संवहनी बिस्तर के लिए अलग कैथेटर प्लेसमेंट, जलसेक दरों और इष्टतम भरने के समय की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, कई जानवरों को कई अंगों को कास्ट करने के लिए आवश्यक होगा।

  1. प्रणालीगत संवहनी बिस्तरों के लिए डायाफ्राम से बेहतर या अवर ऊपर के रूप में चरण 1.1-2.5 का पालन करें। पोर्टल सिस्टम और डायाफ्राम(टेबल 1)पर अतिरिक्त नोट्स देखें।
  2. एक हीमोस्टेट के साथ xiphoid प्रक्रिया को समझें और आंतरिक वक्ष धमनियों से ठीक पहले रिबकेज को द्विपक्षीय रूप से (मोटे तौर पर मिडक्सिलरी लाइन में) काट दें।
  3. इस तरह है कि यह जानवर की गर्दन पर आराम कर रहा है पर अभी भी जुड़े रिबकेज गुना/
  4. ऊपर चरण 3.1 का पालन करें, फिर फेफड़ों को हटा दें। एक बार जब वक्ष महाधमनी (टीए) दिखाई देता है, तो इसके नीचे घुमावदार संदंश के सुझावों को हुक करें, ~ 10 मिमी डायाफ्राम से बेहतर हो। 7-0 रेशम की 3 सेमी लंबाई को समझें, टीए के नीचे खोलने के माध्यम से वापस खींचें, और एक एकल-थ्रो ढीला सीवन बनाएं। इस प्रक्रिया को दोहराएं ~ 8 मिमी डायाफ्राम से ऊपर।
  5. डायाफ्राम से बेहतर संरचनाओं के लिए, टीए के वेंट्रल हिस्से पर एक छोटा छेद (कुल परिधि का ~ 30%) बनाने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें, ~ 2 मिमी चरण 6.4 में रखे ढीले टांके से कम है।
    1. डायाफ्राम से कम संरचनाओं के लिए, इसके बजाय, ढीले टांके से बेहतर एक छोटा छेद ~ 2 मिमी बनाएं।
  6. जानवरों के आकार के आधार पर, पोत में यूनिट 1 या 2 पेश करें, ढीले टांके से परे आगे बढ़ें, और धीरे-धीरे पोत को लिगेट करें।
  7. चरण 3.7 का पालन करें, 1.0 एमएल/न्यूनतम की दर से सिरिंज पंप की स्थापना और न्यूनतम 5 एमएल परफसिंग करें। Perfusate आईवीसी के माध्यम से बाहर निकलें जाएगा ।
  8. चरणों का पालन करें 5.1 - 5.4 जलसेक दर को 0.05 एमएल/न्यूनतम में समायोजित करें, नेत्रहीन वास्तविक समय में लक्ष्य ऊतक की निगरानी करें।
    नोट: जलसेक मात्रा अंग और पशु आयु विशिष्ट हो जाएगा । मात्रा को धमनी शाखाओं को गैर-लक्षित संवहनी बिस्तरों (यानी मस्तिष्क, यकृत, गुर्दे, आंत) के लिए अग्रणी द्वारा और सीमित किया जा सकता है।
  9. 5.6 का पालन करें तो लक्ष्य ऊतक को हटा दें और फॉर्मेलिन में रखें।

7. माइक्रो सीटी के लिए नमूना माउंट, स्कैन, और पुनर्निर्माण

  1. पैराफिन फिल्म का उपयोग करना, स्कैनिंग बिस्तर पर एक सपाट सतह बनाएं और इस सतह(चित्रा 3A)पर गीले नमूने को केंद्र में रखें।
    नोट: यदि मोशन विरूपण साक्ष्य का पता चला है, तो नमूने को और स्थिरीकरण की आवश्यकता हो सकती है।
  2. निर्जलीकरण को रोकने के लिए अतिरिक्त पैराफिन फिल्म के साथ हल्के से तम्बू/कवर नमूना। ऊतक(चित्रा 3B)के लिए विरूपण के कारण नमूने पर पैराफिन फिल्म आराम नहीं करने के लिए विशेष ध्यान रखना ।
  3. तालिका 2 में उल्लिखित सेटिंग्स का उपयोग करके नमूना स्कैन करें और किसी दिए गए प्रयोग के भीतर इन मापदंडों को मानकीकृत करें।
    नोट: यह प्रयोग/एंडपॉइंट निर्भर है । नमूनों के बीच तुलना में आसानी के लिए चुने गए मापदंडों का मानकीकरण करें।
  4. पोस्ट-प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए पुनर्निर्मित स्कैन स्थानांतरित करें।

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Representative Results

एक सफल कलाकारों पूरे फेफड़े धमनी नेटवर्क की वर्दी भरने का प्रदर्शन करेंगे । हम उम्र में लेकर C57Bl/6J चूहों में यह प्रदर्शित करते हैं: प्रसवोत्तर दिन P90(चित्रा 4A),P30(चित्रा 4B),P7(चित्रा 4C),और P1(चित्रा 4D)। प्रवाह की दर को नियंत्रित करके और नेत्रहीन वास्तविक समय में भरने की निगरानी करके, सबसे डिस्टल वेक्यूलेचर के विश्वसनीय एंडपॉइंट्स(चित्रा 5A)प्राप्त किए गए थे।

आम चुनौतियों में फेफड़ों को नुकसान, अधूरा भरने, अंडरफिलिंग, या ओवरफिलिंग, कैथेटर को वेडिंग और जानवरों का आकार शामिल है।

यदि फेफड़ों/वायुमार्ग को नुकसान होता है, तो छोटे लीक फेफड़ों को दबाव(चित्रा 5B,C)रखने से रोकेंगे । पूर्ण मुद्रास्फीति के अभाव में, नमूनों में सटीक मात्रात्मक और स्थानिक तुलना करना मुश्किल हो जाता है। फेफड़ों के परेंचिमा के जोखिम को कम करने के लिए, रिबकेज को हटाते समय फेफड़ों को बहुत बारीकी से काटने से बचें और निर्जलीकरण और आसपास की संरचनाओं के पालन से बचने के लिए प्रक्रिया के दौरान पीबीएस के साथ फेफड़ों को नम रखें। यदि एक पालि मुद्रास्फीति के दौरान रिब पिंजरे का पालन करती है, तो धीरे-धीरे रिबकेज के बाहर (फेफड़ों से दूर) को संदंश के साथ समझें और इसे लोब्स को मुक्त करने के लिए एक दिशा में ले जाएं। वैकल्पिक रूप से, एक कुंद उपकरण, जैसे कि एक स्मूथ एज के साथ एक स्मूथ एज का उपयोग फुलाया फेफड़ों को रिबकेज से दूर उठाने या धक्का देने के लिए किया जा सकता है। फेफड़ों को फुलाते समय, सुझाए गए दबाव मापदंडों का पालन करें और अधिक मुद्रास्फीति से बचें क्योंकि इससे वायुमार्ग टूट सकता है। अंत में, जब तक निर्धारण पूरा न हो जाए तब तक फेफड़ों को वक्ष गुहा से न हटाएं। श्वासनली, फेफड़ों, और दिल छाती गुहा के शेष भागों से ब्लॉक एन हटा दिया जाना चाहिए ।

बद(चित्रा 5D)या अधूरा(चित्रा 5E)भरने एक "एयरलॉक" से पैदा हो सकता है, जिसमें हवा कैथेटर के माध्यम से संवहनी प्रणाली में पेश किया जाता है, यौगिक के नीचे प्रवाह अवरुद्ध । एक एयरलॉक की संभावना को कम करने के लिए, सतर्क प्रविष्टि (चरण ३.४) से पहले कैथेटर की नोक से हवा शुद्ध और SNP/PBS से बहुलक यौगिक के लिए सिरिंज संक्रमण के दौरान । यदि भरने बद या अधूरा रहता है, यह फोकल/लांग सेगमेंट स्टेनोसिस या टॉर्टुओसिटी के परिणामस्वरूप बढ़ी हुई संवहनी प्रतिरोध का संकेत हो सकता है । रक्त के थक्के भी अधूरा भरने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और प्रक्रिया से पहले हेपरिन का उपयोग करके आसानी से बचा जाता है।

अनुचित इंजेक्शन की मात्रा अंडरफिलिंग या ओवरफिलिंग का कारण बनेगी। अंडरफिलिंग तब होती है जब बहुत कम यौगिक को वैक्यूलेचर(चित्रा 5F)में पेश किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, ओवरफिलिंग, या बहुत अधिक बहुलक यौगिक को बहुत तेजी से शुरू करने से या तो धमनी टूटना(चित्रा 5G)या, अधिक सामान्य रूप से, शिरास पारगमन(चित्रा 5H) हो सकता है। दोनों समस्याओं को एक सिरिंज पंप का उपयोग करके समाप्त किया जा सकता है । जांचकर्ताओं को सावधानीपूर्वक प्रस्तावित दर और मात्रा प्रतिबंधों का पालन करना चाहिए या उनके विशिष्ट मॉडल और अनुकूलन के आधार पर अपनी दरें स्थापित करनी चाहिए । आवर्धन के तहत वास्तविक समय में पॉलीमर यौगिक परफ्यूजन की निगरानी करना महत्वपूर्ण है, और छोटी धमनियों/केशिकाओं को भरने का उपयोग अंतिम बिंदु के रूप में किया जाना चाहिए ।

कैथेटर को आगे बढ़ाना पल्मोनरी ट्रंक के नीचे बहुत दूर है टिप को एक फेफड़े की धमनी शाखा में कील करने और प्रवाह में असंतुलन पैदा कर सकता है। नतीजतन, एक तरफ दूसरे(चित्रा 5I)की तुलना में तेजी से भरता है, जो अक्सर एक फेफड़े में ओवरफिलिंग और दूसरे में अंडरफिलिंग की ओर जाता है। जबकि कैथेटर wedging इस परिदृश्य में सबसे अधिक संभावना कारण है, "एयरलॉक" और हेपरिन की कमी भी कारकों का योगदान हो सकता है ।

अंत में, छोटे जानवर अतिरिक्त बाधाओं का अपना सेट पेश करते हैं। छोटे जानवरों की मांग स्थिर हाथ और छोटी गलतियों को कम क्षमा कर रहे हैं । उच्च गुणवत्ता वाले उपकरण, विशेष रूप से माइक्रोसर्जरी के लिए डिज़ाइन किए गए, शुरुआती प्रसवोत्तर समय बिंदुओं पर अधिक महत्वपूर्ण हो जाते हैं। एक माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग न केवल प्लेसमेंट में बहुत सहायता करता है बल्कि कैथेटर अव्यवस्था को रोकता है। एंडपॉइंट्स को सही ढंग से नियंत्रित करने और प्रबंधित करने के लिए छोटे जानवरों पर सिरिंज पंप का उपयोग करना भी आवश्यक है।

जबकि विशेष रूप से फेफड़े के संवहनी के लिए दिखाया गया है, इस प्रक्रिया को आसानी से प्रणालीगत लक्ष्य संवहनी बिस्तरों के रूप में अच्छी तरह से(तालिका 1)के लिए लागू किया जा सकता है । ऊपर सूचीबद्ध चुनौतियों के अलावा, सही प्रवेश बिंदु चुनना महत्वपूर्ण है। वक्ष महाधमनी के माध्यम से कास्टिंग सबसे संवहनी बिस्तरों के लिए उत्कृष्ट परिणाम पैदा करता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कैथेटर को यथासंभव लक्ष्य स्थल पर समीपस्थ के रूप में सम्मिलित करना और गैर-लक्षित वाक्यूलेचर को प्रवाह और मात्रा नियंत्रण में सहायता करता है। ये शोधन डिस्टल वैस्कुलर एंडपॉइंट्स(चित्रा 6ए-एफ)और मानक जलसेक दरों की उचित प्रत्यक्ष निगरानी के साथ संयुक्त रूप से भरने का अनुकूलन करते हैं। इस तरह के कास्टिंग विधियों के कई उदाहरण साहित्य में मौजूद हैं और पूर्ण संदर्भित करने के लिए बहुत सारे हैं। तथापि , अंग विशिष्ट पाठ जैसे 4 , 5 ,7,18,,,19,20,,21में अतिरिक्त विवरण पाया जा18सकताहै .20

कास्टिंग के बाद, नमूनों को μCT स्कैनिंग(चित्रा 7A,B)के लिए संसाधित किया जा सकता है। पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए, एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेज (सामग्री की तालिकादेखें) ने अभी भी छवियों(चित्रा 7C)या फिल्मों के रूप में प्रस्तुत फेफड़े के संवहनी पेड़ की 3डी मात्रा प्रतिपादन का उत्पादन किया। इसके अलावा सांख्यिकीय विश्लेषण खंड लंबाई और संख्या, टॉर्ट्यूसिटी, ऑर्डर (पीढ़ी या रैंक), वॉल्यूम और आर्केड लंबाई जैसी संवहनी विशेषताओं की खोज भी की जा सकती है। μCT स्कैनिंग के अलावा, डाले गए नमूनों को सकल छवियों को प्राप्त करने या संसाधित करने और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण8के लिए कटौती करने के लिए भी मंजूरी दी जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:कैथेटर और सुई सेटअप। सीरिंज संलग्न ट्यूबिंग और सुई (Unit1 और Unit2) के साथ दिखाया गया है। इनसेट: सुई और ट्यूबिंग का क्लोजअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:फेफड़ों की मुद्रास्फीति सेटअप। रिंग स्टैंड, क्लैंप, फॉर्मेलिन से भरी एक सिरिंज, और एक कैथेटर के साथ टयूबिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:माइक्रो-सीटी नमूना तैयारी प्री-स्कैन। (A)यहां नमूना एक पैराफिन फिल्म बेस पर केंद्रित था,(ख)यहां नमूना केंद्रित था और पैराफिल्म बेस पर कवर किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:3 महीने से 1 दिन पुराने विकास के चरणों में संवहनी-ढलते फेफड़े। फेफड़ों का पृष्ठीय दृश्य,(A)P90,(B)P30,(C)P7, और(D)P1 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:पॉलीमर यौगिक जलसेक के दौरान आदर्श भरने और सामान्य त्रुटियों के उदाहरण। (ए)जब अंत बिंदु को भरने तक पहुंचा था, तो एक मजबूत और ठीक संवहनी नेटवर्क देखा गया था। (ख)पूरी तरह से फुलाया फॉर्मेलिन परफ्यूस्ड फेफड़ों का प्रतिनिधित्व सफेद धराशायी रेखा द्वारा किया जाता है,(ग)अंडरइनफ्लेटेड/हवा निकाल फेफड़े दिखाए जाते हैं । यह एक समझौता फेफड़े के वायुमार्ग के कारण देखा गया था। मूल फुलाया स्थिति एक सफेद धराशायी रेखा द्वारा दर्शाया जाता है और हवा निकाल स्थिति को एक काले बिंदीदार रेखा द्वारा दर्शाया जाता है,(डी)बद भरने: पालि के कुछ हिस्सों का वास्कुलर भरा हुआ रहता है जबकि अन्य क्षेत्र पूरी तरह से भरे हुए थे,(ई)अधूरा भरने: बहुलक यौगिक फेफड़ों के पूरे वर्गों में प्रवेश करने में विफल रहा है,(एफ)अंडरफिलिंग: पॉलीमर यौगिक डिस्टैल वेक्यूलेचर को भरने में विफल रहा,(जी)टूटना: तीर वैक्यूलेचर से निकाले गए बहुलक यौगिक की ओर इशारा कर रहा है,(एच)वेनस फिलिंग: पूरी तरह से भरे हुए और वेनस सिस्टम में विस्तारित धमनी खंडों की ओर इशारा करते हुए तीर नोट करें। नसों और वेणुओं काफी बड़ा कैलिबर के थे,(मैं)कैथेटर कील: यहां कैथेटर एक धमनी में शंट किया गया था पूरी तरह से भरने से सही पालि के संतुर होने को रोकने जबकि बाएं पालि भर गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। अतिरिक्त अंगों में संवहनी कास्टिंग और अंत बिंदु। (क)किडनी: ग्लोमेरुलस में पॉलीमर कंपाउंड की पंचाट उपस्थिति ने अंतिम बिंदु प्रदान किया। (ख)लिवर: अंग के किनारों पर दिखाई देने वाले छोटे जहाजों पर ध्यान दें। (ग)पेट: छोटे जहाज दिखाई दे रहे थे और पूरी तरह से भरे हुए थे । (घ)बड़ी आंत: छोटे जहाजों को आसानी से पहचाने जाने योग्य और भरा जाता है। (ई)डायाफ्राम: यहां की मांसपेशी पतली और छोटे भरे जहाजों के साथ पारदर्शी है। (च)मस्तिष्क: कॉर्टेक्स में छोटे जहाज दिखाई दे रहे थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। सीटी छवियों और बहुलक यौगिक भर फेफड़ों के 3 डी मात्रा प्रतिपादन। (A)एक एकल ग्रे-स्केल्ड खंगाला फेफड़ों का टुकड़ा,(ख)यह बहुलक भरे फेफड़ों से उत्पादित सीटी स्कैन का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण था,(C)व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके संवहनी आर्केड का 3डी वॉल्यूम प्रतिपादन उत्पन्न किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लक्ष्य धमनी संवहनी बिस्तर कैथेटर प्लेसमेंट जलसेक दिशा जलसेक दर नोट्स
मस्तिष्क थोरेसिक महाधमनी कपाल की ओर इशारा करते हुए कैरोटिड्स में प्रतिगामी .05 मिलीलीटर/न्यूनतम कैनुलेट थोरेसिक महाधमनी, प्रवण स्थिति के लिए माउस फ्लिप, खुली खोपड़ी, और नेत्रहीन खोपड़ी के माध्यम से बहुलक की प्रगति की निगरानी।
डायाफ्राम लेफ्ट वेंट्रिकल आंतरिक वक्ष, फ्रेनिक और इंटरकोस्टल में एंटेरोग्रेड .05 मिलीलीटर/न्यूनतम रिबकेज के किनारे में एक खिड़की खोलें, जिससे अधिकांश रिबकेज और डायाफ्राम बरकरार रहे।  कैनुलेट लेफ्ट वेंट्रिकल, क्लिप राइट एट्रियम, और डायाफ्राम के कौडल साइड से प्रगति की निगरानी करें।
ऊपरी अंग मांसपेशी थोरेसिक महाधमनी कपाल की ओर इशारा करते हुए ब्रैकिओसेफेलिक और बाएं सबक्लेवियन में प्रतिगामी .02 मिलीलीटर/न्यूनतम अंग प्रवाह को अनुकूलित करने के लिए, कैरोटिड धमनियों को बांधें और अंग की त्वचा को हटा दें ताकि अंग मांसपेशी में बहुलक पारगमन की दृश्य निगरानी की अनुमति दी जा सके।
गुर्दे थोरेसिक महाधमनी कौड़ी की ओर इशारा करते हुए गुर्दे की धमनियों में एंटेरोग्रेड .05 मिलीलीटर/न्यूनतम आंतरिक वाक्यूल्चर आंख मूंदकर भरा जाता है।  शिन्हें पारगमन से बचने के लिए, जब पॉलीमर गुर्दे में एक समान पंचम पैटर्न में दिखाई देता है तो इंजेक्शन लगाना बंद करें।
पोर्टल सिस्टम पोर्टल नस पोर्टल प्रणाली में एंटेरोग्रेड .02 मिलीलीटर/न्यूनतम पोर्टल नस को बेनकाब करने के लिए धीरे-धीरे जिगर को मोड़ें।
यकृत थोरेसिक महाधमनी कौड़ी की ओर इशारा करते हुए हेपेटिक धमनी में एंटेरोग्रेड .05 मिलीलीटर/न्यूनतम जिगर में बहने वाले आंत से शिरा पारगमन से बचने के लिए जलसेक से पहले पोर्टल नस को बंद करें।
पेट/आंत थोरेसिक महाधमनी कौड़ी की ओर इशारा करते हुए सीलिएक में एंटेरोग्रेड, बेहतर मेसेंटेरिक और/या अवर मेसेनटेरिक .05 मिलीलीटर/न्यूनतम आंत के कुछ क्षेत्रों में कई धमनियों द्वारा आपूर्ति की जाती है और अलग-अलग समय पर भर सकते हैं।  शिरस पारगमन से बचने के लिए, ब्याज के क्षेत्रों के लिए आवश्यक धमनियों को बांधें और नेत्रहीन बहुलक की प्रगति की निगरानी करें।
इंट्रा-पेट फैट पैड थोरेसिक महाधमनी कौड़ी की ओर इशारा करते हुए एंटेरोग्रेड लेकिन पोत वसा पैड पर निर्भर करता है अध्ययन किया जा रहा है .05 मिलीलीटर/न्यूनतम वसा पैड कई धमनियों द्वारा आपूर्ति कर रहे हैं और अलग अलग समय पर भर सकते हैं।  शिरस पारगमन से बचने के लिए, ब्याज के सटीक क्षेत्र के लिए आवश्यक धमनियों को बंद कर दें और नेत्रहीन बहुलक की प्रगति की निगरानी करें।
निचले अंग मांसपेशी इन्फ्रारेडल महाधमनी कौड़ी की ओर इशारा करते हुए फेमोरल धमनियों में एंटेरोग्रेड .02 मिलीलीटर/न्यूनतम अंग मांसपेशी में बहुलक पारगमन की दृश्य निगरानी की अनुमति देने के लिए अंग त्वचा को हटा दें।

तालिका 1. वैकल्पिक संवहनी बिस्तरों की कास्टिंग।

सीटी सेटिंग्स
केवीपी 90
लक्ष्य सामग्री टंगस्टन
शक्ति 8w
निस्पंदन Cu 0.06 मिमी + अल 0.5 मिमी
प्रोजेक्शन नंबर 6424
डिटेक्टर आकार फ्लैट पैनल CMOS - 2944 x 2352 पिक्सल
फील्ड ऑफ व्यू (FOV) 36 मिमी
वोक्सल आकार 72 माइक्रोन
स्थानिक संकल्प स्वर आकार x 1.5
अधिग्रहण का समय 14 मिनट
पुनर्निर्माण एफबीपी और वाणिज्यिक एल्गोरिदम
बिनिंग 1x1

तालिका 2. μCT स्कैनिंग पैरामीटर।

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Discussion

ठीक से निष्पादित, यह विधि फेफड़े की धमनी नेटवर्क की हड़ताली छवियों को पैदा करता है, जो कृंतक मॉडल में तुलना और प्रयोग की अनुमति देता है। जिस तरह से सफलता सुनिश्चित करने के साथ कई महत्वपूर्ण कदम । सबसे पहले, जांचकर्ताओं को प्रारंभिक चरण में जानवर को फेफड़े के वास्कुलेचर और दिल के कक्षों में बनाने से रक्त के थक्के को रोकने के लिए heparinize चाहिए । यह बहुलक यौगिक के पूर्ण धमनी पारगमन के लिए अनुमति देता है। दूसरा, डायाफ्राम को पंचर करते समय और रिबकेज को हटाते समय, फेफड़ों को अनजाने में नुकसान, कटौती या चोट से बचाने का ख्याल रखें। वायुमार्ग में कोई भी रिसाव पूर्ण मुद्रास्फीति को रोकेगा और नमूनों के बीच तुलना गलत प्रदान करेगा। तीसरा, शीर्ष एड्स कैथेटर प्लेसमेंट में दिल tethering । चौथा, एसएनपी जैसे मजबूत वासोडिलेटर का उपयोग रक्त को हटाने और धमनियों और केशिकाओं5,,8के पूर्ण भरने में सहायता करेगा। पांचवां, कैथेटर को पैट में रखते समय, ध्यान रखें कि टिप को विभाजन में न दफनाया जाए। यह प्रवाह में असंतुलन का कारण बनेगा, बाएं या दाईं ओर बहुलक यौगिक शंटिंग करेगा, जिससे असमान दबाव ढाल निकलेगा। छठा, एक सिरिंज पंप का उपयोग उपयोगकर्ता दर को नियंत्रित करने और माउस तनाव और उम्र दोनों के लिए मात्रा को टाइटर करने की अनुमति देगा। अंत में, वक्ष गुहा के शेष से जुड़े दिल/फेफड़ों को छोड़ दें, रात भर ठीक करें, और अगले दिन हटा दें। फेफड़े अच्छी तरह से तय हो जाएगा और जुदाई के दौरान आकस्मिक nicks के कारण संकुचन के लिए क्षमता को कम किया जाएगा ।

हालांकि यह पद्धति वांछित परिणाम प्राप्त करती है, वैकल्पिक तकनीक कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकती है। कैथेटर के प्लेसमेंट में सहायता करने के लिए, एक माइक्रोमैनीपुलेटर नियोजित किया जा सकता है। हमने एक स्थिर आधार प्रदान करते समय पहले से ही सीमित कार्य क्षेत्र में अतिक्रमण को कम करने के लिए एक छोटे प्रोफ़ाइल और चुंबकीय आधार के साथ एक संस्करण चुना (यदि चुंबकीय आधार का उपयोग करके चुंबक को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए काम करने की जगह के नीचे स्टील प्लेट रखना सुनिश्चित करें)। यह उपयोगकर्ता को पैट में कैथेटर की नोक को एक कोण पर ठीक से रखने की अनुमति देता है जो धमनी के प्राकृतिक प्रक्षेपवक्र का अनुसरण करता है। इसके अतिरिक्त, कैथेटर सुरक्षित है और उखाड़ फेंका जा रहा है की कम जोखिम में । एक अन्य विकल्प तुरही कैथेटर टिप8का उपयोग है। जबकि बनाने के लिए तुच्छ नहीं है, एक तुरही कैथेटर कहीं अधिक सुरक्षित है और कम गलती से पैट से बाहर स्लाइड करने के लिए इच्छुक है । बहुलक के अनुपात को बदलने: मंदक चिपचिपाहट बदल और आसानी से जिसके साथ छोटे जहाजों भर रहे हैं । लक्ष्य वाक्यूलेचर और प्रयोगात्मक अंत बिंदुओं के आधार पर यह एक मूल्यवान विचार हो सकता है। सीओ2 के माध्यम से इच्छामृत्यु से जानवरों के एक छोटे प्रतिशत में फेफड़े के रक्तस्राव हो सकते हैं और यह तनाव निर्भरहै 22. एक वैकल्पिक इच्छामृत्यु प्रोटोकॉल पर विचार इस प्रभाव प्रयोगात्मक अंत बिंदुओं चाहिए । फेफड़ों को फुलाते समय, दिए गए दबाव पर जगह में अंग के फॉर्मेलिन एड्स निर्धारण का उपयोग। एक शारीरिक तटस्थ बफर प्रतिस्थापित किया जा सकता है परिधीय जहाजों को एक अनसर्गित राज्य में भरने की आवश्यकता होनी चाहिए। यदि किसी दिए गए प्रयोग के लिए जलसेक दर और नियंत्रण का कम महत्व है, तो हाथ से पर्फ्यूजन भी संभव है। हाथ के इंजेक्शन को ओवरफिलिंग या पोतटूटनेसे बचने के लिए आवर्धन के तहत अभ्यास और वास्तविक समय की निगरानी की आवश्यकता होती है। अंत में, ऊतक माउंट/शर्तों, स्कैनिंग मापदंडों, और ंयूनतम पोस्ट प्रसंस्करण हम इस कागज के लिए नियोजित केवल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा करनी चाहिए । विभिन्न स्कैनर, ऊतक, प्रायोगिक अंत बिंदु/उपयोगकर्ता की जरूरत वैकल्पिक मापदंडों की मांग कर सकते हैं ।

जबकि इस तकनीक से उत्पन्न संवहनी छवियां प्रभावशाली हैं, सीमाएं हैं। मुख्य रूप से, जलसेक के दौरान इंट्रावैस्कुलर दबाव की निगरानी और नियंत्रण करने में असमर्थता के कारण नाड़ी कैलिबर को मापने के लिए उपरोक्त विधि उप-अनुकूल है। अन्य समूह ड्राइविंग दबाव4,,23की निगरानी करके प्रणालीगत संवहनी में इन दबाव चिंताओं को कुछ हद तक दूर करने में कामयाब रहे हैं, हालांकि, अपेक्षाकृत पतली फेफड़े की धमनी की दीवारों के कारण फेफड़े की ओर ऐसी चिंताएं और परिलक्षित होती हैं जो दबाव24 में छोटे परिवर्तनों के साथ आसानी से अव्यवस्थित होती हैं और फेफड़े के इंट्रावैस्कुलर दबाव को ठीक से मापने और स्थिर रूप से नियंत्रित करने में असमर्थता होती है।

इस विधि के लिए एक दूसरी सीमा यह है कि यह एक पोस्टमॉर्टम, एकल समय बिंदु प्रयोग रहता है, अध्ययन में अपनी उपयोगिता सीमित है कि वास्तव में शारीरिक स्थितियों या एक समय पाठ्यक्रम की आवश्यकता है । अन्य, सीटी पल्मोनरी एंजियोग्राफी (सीटीपीए) या कंट्रास्ट-एन्हांस्ड माइक्रोनसीटी (सीई-सीटी) जैसे जीवित पशु उपाय कार्यात्मक और मॉर्फोलॉजिक उपायों की संभावना प्रदान करते हैं। बार-बार स्कैन/अनुदैर्ध्य अध्ययन के साथ-साथ हृदय/फेफड़े के चक्र में विभिन्न बिंदुओं पर माप,10,25, 26,,,27,,,28का पता लगाया जा सकता है ।27 इन तरीकों का मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है, इकोकार्डियोग्राफी के अलावा, धमनी क्षमता को मापने के लिए। हालांकि, सीटीपीए और इकोकार्डियोग्राफी दोनों उपाय वर्तमान में समीपस्थ वास्कुलेचर के आकलन तक सीमित हैं। इकोकार्डियोग्राम के लिए, मूल्यांकन फेफड़े के ट्रंक तक सीमित है, जबकि सीटीपीए शाखा फेफड़े की धमनी कैलिबर संभावित 1-2 आदेशों की पर्याप्त गणना की अनुमति देता है, लेकिन संकल्प सीमित है, वेक्यूलेचर7के डिस्टल भागों को अस्पष्ट करता है। विकिरण की खुराक भी एक चिंता का विषय है कि सीटी का उपयोग करते समय ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए, विशेष रूप से बहु स्कैन देशांतर अध्ययनमें 29,,30। इन अनुप्रयोगों में से किसी के लिए, μCT उपकरण, स्कैन समय, और विश्लेषण सॉफ्टवेयर महंगा हो सकता है और विशेष कर्मचारियों के प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। कुछ संस्थानों में पशु इमेजिंग कोर सुविधाएं इस बोझ को कम कर सकती हैं ।

इस यौगिक के विकल्प के रूप में, कुछ समूह पारंपरिक जंग कास्टिंग तकनीकों का उपयोग नरम ऊतक हटाने31,32के साथकरतेहैं। इन तरीकों से इस बहुलक यौगिक के समान परिणाम निकलते हैं, लेकिन अंतिम उत्पाद भंगुर है, जिससे संभावित विरूपण साक्ष्य15 होताहै। इसके अलावा, मुलायम ऊतक को हटाने से भविष्य के हिसल विज्ञान की क्षमतासमाप्त हो गईहै। एक अन्य विकल्प यह है कि मुलायम ऊतक को अक्षुण्ण छोड़ दिया जाए और अनुवर्ती कदम उठाया जाए जिसमें मुलायम ऊतक को "मंजूरी" दी जाए , जिससे नमूना लगभग पारदर्शी34,,35हो जाए . ऊतक समाशोधन उपयोगकर्ता को एक नमूने के भीतर गहरा देखने की क्षमता देता है, लेकिन, पूरे पर, μCT से कम रहता है क्योंकि यह एक ही 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन प्रदान नहीं कर सकता है। धारावाहिक हिस्टोलॉजिक सेक्शनिंग और सरणी टोमोग्राफी ऐसे तरीके हैं जो असाधारण रूप से उच्च संकल्प प्रदान करते हैं। हालांकि यह तकनीक रोमांचक नई संभावनाओं का दरवाजा खोलती है, लेकिन कार्यभार तेजी से अधिक है और बड़े साथियों के लिए विशेष रूप से अनुकूल नहीं है11,,12। 3 डी एक्स-रे हिसटोलॉजी एक गैर-विनाशकारी दृष्टिकोण है जो μCT और पारंपरिक हिक्टोलॉजी या यहां तक कि ईएम36,37, 38,38दोनों जोड़ों।, यह पैथोलॉजी का अधिक उच्च स्तरीय दृष्टिकोण लेता है ताकि विश्व स्तर पर रुचि के क्षेत्रों की पहचान करने और सही ढंग से स्काउट किया जा सके , जिसका नियमित हिस्टोलॉजी39के साथ पालन किया जाता है । कम संकल्प विपरीत एजेंटों (या कुछ मामलों में कोई विपरीत नहीं) को प्रतिस्थापन करने के साथ बहुलक यौगिक के साथ वाक्यूल्चर में संभव होने पर दोनों तकनीकों को ऊंचा करने की सेवा कर सकते हैं। एक और गैर विनाशकारी दृष्टिकोण जो अभी तक गणनात्मक रूप से गहन है, संभावित रूप से इसके विपरीत को बढ़ाता है, चरण-पुनर्प्राप्ति μCT इमेजिंग40,,41है। शोर - शराबे वाले आंकड़ों पर नियोजित होने पर यह विधि मूल्यवान हो सकती है , जहां विपरीत कमजोर है यासंभवनहीं है । इस तकनीक में नियोजित बहुलक यौगिक, हालांकि, इस सीमा से पीड़ित नहीं है। उस ने कहा, चरण-पुनर्प्राप्ति उपयोगी हो सकती है जहां बहुलक यौगिक संभवतः पतला होता है, उदाहरण के लिए डिस्टल वैक्यूलेचर43में। अंत में, स्टीरियोलॉजी44वर्षों से फेफड़ों के मात्रात्मक संरचनात्मक विश्लेषण में एक मानक रहा है। यह ऊतक के पार वर्गों पर यादृच्छिक, व्यवस्थित नमूने का उपयोग करता है 3-डी अनुमान यह मानते हुए कि चुने हुए नमूने पर्याप्त प्रतिनिधि हैं। जबकि एक शक्तिशाली उपकरण, यह त्रुटि और पूर्वाग्रह के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है । स्टीरियोलॉजी के साथ सीटी इमेजिंग का संयोजन, हालांकि, महान वादा45रखती है।

उल्लिखित विधि अपेक्षाकृत सरल है और प्रशिक्षण के साथ >90% की सफलता दर प्राप्त की जा सकती है। एक बार महारत हासिल होने के बाद, यह फेफड़ों के वाक्यूलेचर की पूर्ण और विश्वसनीय कास्टिंग के लिए अनुमति देता है। फिक्सेटिव में, ऊतक और बहुलक भविष्य के स्कैन, संभावित हिस्ता विज्ञान, याईएम 46,,47के लिए अनिश्चित काल तक स्थिर रहते हैं। हमने दिखाया है कि इस तकनीक वयस्कता के माध्यम से P1 के रूप में युवा के रूप में जानवरों में इस्तेमाल किया जा सकता है और विश्वास भ्रूण कास्टिंग, फेफड़े की धमनी के माध्यम से, पहुंच के भीतर है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तकनीक को कैथेटर प्रवेश बिंदु में फेरबदल करके और उचित एंडपॉइंट निर्धारित करके लगभग किसी अन्य संवहनी बिस्तर पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

इस शोध को एनएचएलबीआई इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम (डीआईआर एचएल-006247) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम छवि अधिग्रहण और विश्लेषण में मार्गदर्शन के लिए NIH माउस इमेजिंग सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1cc syringe Becton Dickinson 309659
20ml Glass Scintillation Vials Fisher 03-340-25P
30G Needle Becton Dickinson 305106
50mL conical tubes Cornin 352098 For sample Storage and scanning
60cc syringe Becton Dickinson 309653
7-0 silk suture Teleflex 103-S
Analyze 12.0 Software AnalyzeDirect Inc. N/A Primary Software
Amira 6.7 Software Thermo Scientific N/A Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm Fine Science tools 14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps Fine Science tools 11272-50
CO2 Tank Robert's Oxygen Co. n/a
Dual syringe pump Cole Parmer EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps Fine Science tools 11200-14
Ethanol Pharmco 111000200
Formalin Sigma - Life Sciences HT501128
Gauze Covidien 441215
Hemostat Fine Science tools 13013-14
Heparin (1000USP Units/ml) Hospira NDC 0409-2720-01
Horos Software Horos Project N/A Alternative Sofware
induction chamber n/a n/a
Kimwipe Fisher 06-666 fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape Fisher 15966
Magnetic Base Kanetec N/A
Micro-CT system PerkinElmer Quantum GX
Microfil (Polymer Compound) Flowech Inc. Kit B - MV-122 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator Stoelting 56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe Covidien 1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth Fine Science tools 11042-08
Parafilm Bemis company, Inc. #PM999
PE-10 tubing Instech BTPE-10
Phospahte buffered Saline BioRad #161-0780
Ring Stand Fisher S13747 Height 24in.
Sodium Nitroprusside sigma 71778-25G
Steel Plate N/A N/A 16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors Fine Science tools 15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter Santa Cruz Biotechnology 360103
Surgical Board Fisher 12-587-20 This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp Fisher S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing Nipro PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope Zeiss n/a

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