Summary
Het doel van deze techniek is ex vivo visualisatie van longslagaderlijke netwerken van vroege postnatale en volwassen muizen door middel van longinflatie en injectie van een radio-ondoorzichtige polymeer-gebaseerde verbinding via de longslagader. Mogelijke toepassingen voor gegoten weefsels worden ook besproken.
Abstract
Bloedvaten vormen ingewikkelde netwerken in de 3-dimensionale ruimte. Daarom is het moeilijk om visueel te begrijpen hoe vasculaire netwerken interageren en zich gedragen door het observeren van het oppervlak van een weefsel. Deze methode biedt een middel om de complexe 3-dimensionale vasculaire architectuur van de long te visualiseren.
Om dit te bereiken, wordt een katheter in gebracht in de longslagader en de vasculatuur wordt tegelijkertijd gespoeld van bloed en chemisch verwijd om weerstand te beperken. Longen worden vervolgens opgeblazen door de luchtpijp bij een standaard druk en het polymeer verbinding wordt toegediend in het vasculaire bed met een standaard stroomsnelheid. Zodra het volledige arteriële netwerk is gevuld en mag genezen, kan de longvaatculatuur direct worden gevisualiseerd of op een micro-CT -scanner (μCT) worden afgebeeld.
Wanneer met succes uitgevoerd, kan men waarderen de longslagader netwerk in muizen, variërend van vroege postnatale leeftijden tot volwassenen. Bovendien, terwijl aangetoond in het longslagaderlijk bed, kan deze methode worden toegepast op elk vaatbed met geoptimaliseerde katheter plaatsing en eindpunten.
Introduction
De focus van deze techniek is de visualisatie van longslagaderarchitectuur met behulp van een polymeer-gebaseerde verbinding in muizen. Terwijl uitgebreid werk is uitgevoerd op systemische vasculaire bedden zoals hersenen, hart, en nier1,,2,,3,,4,5, minder informatie beschikbaar is over de voorbereiding en vulling van het longslagadernetwerk. Het doel van deze studie is dan ook om uit te breiden naar eerder werk6,7,8 en een gedetailleerde schriftelijke en visuele referentie te geven die onderzoekers gemakkelijk kunnen volgen om beelden met hoge resolutie van de longslagaderboom te produceren.
Hoewel er tal van methoden bestaan voor etikettering en beeldvorming van de longvaatculatuur, zoals magnetische resonantiebeeldvorming, echocardiografie of CT-angiografie9,10, slagen veel van deze modaliteiten er niet in om de kleine vaten adequaat te vullen en/of vast te leggen, waardoor de reikwijdte van wat kan worden bestudeerd wordt beperkt. Methoden zoals seriële secties en reconstructie bieden een hoge resolutie, maar zijn tijd/arbeidsintensief11,12,13. De omliggende integriteit van weke delen wordt aangetast bij traditionele corrosieafgieten10,13,14,15,16. Zelfs dierlijke leeftijd en grootte worden factoren bij een poging om een katheter in te voeren of, de resolutie ontbreekt. De polymeerinjectietechniek daarentegen vult slagaders tot het capillaire niveau en zorgt in combinatie met μCT voor een ongeëvenaarde resolutie5. Monsters uit muizenlongen zo jong als postnatale dag 14 zijn met succes gegoten8 en verwerkt in een kwestie van uren. Deze kunnen voor onbepaalde tijd opnieuw worden gescand, of zelfs verzonden voor histologische voorbereiding / elektronenmicroscopie (EM) zonder afbreuk te doen aan het bestaande zachte weefsel17. De belangrijkste beperkingen van deze methode zijn de upfront kosten van CT-apparatuur / software, uitdagingen met nauwkeurige monitoring intravasculaire druk, en het onvermogen om gegevens te verwerven in de lengterichting in hetzelfde dier.
Dit papier bouwt voort op bestaand werk om de longslagader injectietechniek verder te optimaliseren en leeftijd/grootte gerelateerde grenzen te verleggen naar postnatale dag 1 (P1) om opvallende resultaten op te leveren. Het is vooral handig voor teams die arteriële vasculaire netwerken willen bestuderen. Daarom bieden we nieuwe richtlijnen voor katheterplaatsing/stabilisatie, meer controle over de vulsnelheid/-volume en wijzen we op opmerkelijke valkuilen voor meer castingsucces. Resulterende afgietsjts kan vervolgens worden gebruikt voor toekomstige karakterisering en morfologische analyse. Misschien nog belangrijker, dit is de eerste visuele demonstratie, voor zover wij weten, dat de gebruiker door deze ingewikkelde procedure leidt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) van het National Heart Lung and Blood Institute.
1. Voorbereiding
- Injecteer de muis intraperitoneally met heparine (1 eenheid /g muis lichaamsgewicht) en laat het ambulate voor 2 min.
- Euthanaseren het dier in een CO2-kamer.
- Schik de muis in een supine positie op een chirurgische raad en zet alle vier de ledematen op het bord met tape. Gebruik vergroting voor fijne dissectie.
2. Bloot longen en luchtpijp
- Spray de ventrale kant van de muis met 70% ethanol om haarinterferentie te minimaliseren.
- Pak de buikhuid met tangen en maak een kleine incisie met een schaar in de navelstreng. Schuif de uiteinden van de schaar in de fasciale laag tussen de buikspier en de huid en beginnen met het scheiden van de twee lagen. Werk rostrally, het verwijderen van de huid uit de buik, ribbenkast, en nek.
- Open het buikspierstelsel met een schaar en snijd zijwaarts aan beide zijden totdat het middenrif wordt blootgesteld.
- Pak het xiphoïde proces voorzichtig vast en til de ribbenkast iets op waardoor het zicht op de staartlongen door het dunne, semitransparante middenrif wordt gemaximaliseerd. Maak voorzichtig een kleine incisie in het middenrif net onder het xiphoidproces. De longen zullen instorten en zich terugtrekken uit het middenrif. Ontleden het middenrif uit de buurt van de ribbenkast, waarbij u ervoor zorgt dat de longen niet worden gejat.
- Zoek en verdring de inferieure vena cava (IVC) en slokdarm waar ze door het middenrif. Gebruik gaas om het samen te ruimen bloed in de borstholte, het vermijden van contact met de longen.
- Pak de xiphoid nog eens vast en til voorzichtig op. Snijd de ribbenkast bilateraal (ongeveer op de midaxillaire lijn) het vermijden van contact met de longen. Verwijder de voorste ribbenkast volledig, waardoor de uiteindelijke snede langs de achtersteven hoek net voor het manubrium.
- Met behulp van een voorgevulde spuit, royaal nat de longen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) om uitdroging te voorkomen. Zet deze routine gedurende de hele procedure voort.
- Met behulp van tangen, pak het manubrium en zachtjes verheffen uit de buurt van het lichaam. Snijd met een schaar 1-2 mm laterale naar het manubrium, doorsnijden van sleutelbeenderen en verwijder. Dit zal de thymus eronder blootleggen.
- Pak elke kwab van de thymus, trek uit elkaar en verwijder. Herhaal deze procedure met de submandibulaire klier. Verwijder ten slotte het spierweefsel dat de luchtpijp bedekt.
OPMERKING: Na de dissectie moeten het hart, de oplopende aorta (AA), de longslagaderlijke romp (PAT) en de luchtpijp zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat de primaire arteriële takken uit de stam niet worden verdeeld of gewond.
3. PA katheterisatie en bloedperfusie
- Voor het monteren van unit 1, rijg 15 cm PE-10 buizen op de naaf van een 30 G naald en bevestig aan een 1 mL spuit voorgevuld met 10-4 M natrium nitroprusside (SNP) in PBS. Prime de slang door het bevorderen van de zuiger totdat alle lucht is gezuiverd uit deze eenheid ( figuur 1).
LET OP: SNP is giftig bij inslikken. Vermijd contact met de huid en ogen. Was de huid grondig na behandeling. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.- U ook unit 2 monteren. Voor muizen postnatale dag 7 (P7) en jonger, gebruik een hemostat om een extra 30 G naald los te maken van de naaf en schroef de naald op het open uiteinde van de slang van eenheid 1 (Figuur 1).
- In plaats van een naald, gebruik gebogen scherpe tangen om een uiteinde van een 10 cm lengte van 7-0 zijde te grijpen. Penetreer de top van het hart binnen die van de ene kant en het passeren van de uiteinden van de tang door de spier en uit de andere kant. Pak de zijde met een andere set tangen en trek ongeveer een lengte van ongeveer 2 cm door en bind af. Neem het resterende 8 cm einde van de hechting, trekken het hart caudally, en tape het einde van de chirurgische raad.
OPMERKING: Dit zal spanning creëren, waardoor de grote bloedvaten verder worden blootleggen en het hart op zijn plaats worden vastgebonden, waardoor de katheter gemakkelijker in de longslagader kan worden geplaatst. - Haak de uiteinden van gebogen tang onder zowel de AA en PAT. Trek een 3 cm lengte van 7-0 zijde terug door de opening en maak een single-throw losse hechting.
- Met behulp van een schaar maak een 1-2 mm incisie in de richting van de top van het hart, penetreren de dunwandige rechter ventrikel (RV), om het inbrengen van de katheter (Unit 1). Controleer voorafgaand aan het inbrengen of er geen lucht in het systeem zit. Introduceer de geprimede slang in de rechter hartkamer en ga voorzichtig verder in de semitransparante dunwandige PAT.
- Controleer visueel of de katheter niet in de linker- of rechter longtak is gevorderd en niet op het vertakking van de longslagader komt. Met behulp van tape, zet het distale gedeelte van de slang aan de chirurgische raad.
OPMERKING: Om de RV te identificeren, gebruik tangen om de rechterkant van het hart te knijpen. In tegenstelling tot de linker ventrikel, moet de relatief dunne vrije muur van de RV gemakkelijk worden begrepen. - Voor muizen jonger dan P7 bevestigt u Unit 2 aan een micromanipulator en introduceert u het naaldeinde van het apparaat in de PAT zoals hierboven beschreven met behulp van de manipulator.
- Controleer visueel of de katheter niet in de linker- of rechter longtak is gevorderd en niet op het vertakking van de longslagader komt. Met behulp van tape, zet het distale gedeelte van de slang aan de chirurgische raad.
- Draai voorzichtig de losse hechting rond beide grote vaten aan en snijd de 8 cm lengte van de hechting die in stap 3.2 is gemaakt om het hart terug te brengen naar een natuurlijke rustpositie. De katheter is nu stevig vastgezet in de PAT.
- Klem de linker oorschelp van het hart om het systeem te laten doordringen.
- Beveilig de SNP-bevattende spuit (eenheid 1 of eenheid 2, grootteafhankelijk) in de spuitpomp en doorslis de oplossing met een snelheid van 0,05 mL/min om het bloed te spoelen en de vaatculatuur maximaal te verwijden. Bloed/perfusate zal verlaten via de afgeknipte oorschelp. Doorgaan perfusie totdat perfusate loopt duidelijk (~ 200 μL in een volwassen muis, minder voor jongere dieren).
OPMERKING: Bij het doorsbrengen van de lage viscositeit PBS/SNP werd een relatief hogere infusiesnelheid gebruikt in het belang van tijdsbesparing. De meer viskeuze polymeer verbinding is toegediend in een langzamer tempo om te voorkomen dat overvulling, breuk, en maximaliseren van de controle over distale eindpunten.
4. Tracheostomie en longinflatie
- Bouw de longinflatie -eenheid (figuur 2).
- Sluit een flexibele plastic 24 G intraveneuze (IV) katheter (naald verwijderd) / vlinder infusie ingesteld op een stopcock, bevestigd aan een open 50 mL spuit (geen zuiger). Hang de spuit aan een ringstandaard.
- Voeg 10% gebufferd formaline toe aan de spuit. Open de stopcock, waardoor formaline in de slang en zuiveren alle lucht uit het systeem. Sluit de stopcock en hef de spuit tot de meniscus 20 cm boven de luchtpijp8ligt.
LET OP: Formaline is ontvlambaar, kankerverwekkend, acuut giftig bij inname, en veroorzaakt huidirritatie, ernstig oogletsel, huidsensibilisatie en kiemcelmutagee. Vermijd inname en contact met huid en ogen. Vermijd inademing van de damp of mist. Blijf uit de buurt van ontstekingsbronnen. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Plaats twee losse hechtingen inferieur aan het cricoïde kraakbeen 2-4 mm uit elkaar.
- Met behulp van een schaar, maak een kleine incisie in de cricothyroid ligament superieur aan de hechtingen.
- Steek de INTheter in de opening en ga verder dan de twee losse hechtingen.
- Draai de hechtingen rond de luchtpijp aan en open de stopcock. Laat de formaline in de longen door de zwaartekracht en wacht 5 minuten voor de longen volledig opblazen. Als de longen zich hechten aan de ribbenkast tijdens de inflatie, pak de buitenkant van de ribbenkast met botte fuitjes en bewegen in alle richtingen om te helpen bij het bevrijden van de lobben. Maak geen direct contact met de longen.
- Na 5 min, terug de IV katheter na de eerste hechting en ligate. Herhaal dit voor de tweede hechting. De longen zijn nu opgeblazen in een gesloten, onder druk staat.
5. Gieten van de vasculatuur
- Bereid in een buis van 1,5 mL 1 mL van een 8:1:1-oplossing8 van polymeer:verdunningsmiddel:uithardingsmiddel en draai het meerdere keren voorzichtig om om een goede menging te garanderen.
- Haal de zuiger uit een spuit van 1 cc, bedek het tegenovergestelde uiteinde met een gehandschoende vinger en giet de polymeerverbinding in de spuit. Plaats de zuiger voorzichtig opnieuw, omkeert en ga de zuiger vooruit om alle lucht te verwijderen en een meniscus te vormen op het puntje van de spuit.
- Verwijder de SNP/PBS spuit uit de naaf van de naald en druppel extra PBS in de naaf om een meniscus te maken. Controleer de hub zorgvuldig op gevangen lucht, verjagen indien nodig, en hervorm de meniscus. Sluit de hub aan bij de spuit gevuld met de polymeerverbinding.
OPMERKING: Het maken van een meniscus aan beide uiteinden vermindert de kans dat lucht in het systeem komt aanzienlijk. - Bevestig de met polymeersamenstelling gevulde spuit aan de spuitpomp en beslever op 0,02 mL/min.
OPMERKING: Voor kleinere longen kan een langzamer tarief nuttig zijn om overvulling te voorkomen, maar het is niet essentieel. - Controleer de verbinding als het vrij beweegt de PE-slang en let op de spuit volume als het gaat om de PAT. Blijven vullen totdat alle lobben volledig zijn gevuld tot aan het capillaire niveau en stop de spuitpomp. Controleer het spuitvolume nog eens.
OPMERKING: Na verschillende runs kan een geschat volume worden gebruikt om een bij benadering eindpunt te meten (~35 μL voor een volwassen muis en ~ 5 μL voor een P1-pup). Nadat de pomp is gestopt, blijft de restdruk in het systeem de polymeerverbinding in de longslagaders duwen. Alle longlobben moeten in een vergelijkbaar tempo worden gevuld. - Bedek de longen met een glasvezel reinigingsdoek, royaal toe te passen PBS, en laat het karkas te zitten ongestoord voor 30-40 min op kamertemperatuur. Tijdens deze periode zal de polymeerverbinding genezen en uitharden.
- Verwijder de katheter, verbreed de armen/onderste helft van de muis en plaats het hoofd/thorax in een conische conische 50 mL gevuld met 10% gebufferde formaline 's nachts.
- Na fixatie, pak de luchtpijp en voorzichtig scheiden van het hart / long eenheid van de resterende ribbenkast en thorax. Plaats het hart/longblok in een formaline gevulde scintillatie flacon. Gooi de rest weg.
6. Alternatieve vaatbedden voor het gieten (tabel 1)
OPMERKING: Elk doel vasculaire bed kan vereisen verschillende katheter plaatsingen, infusie tarieven, en optimale vultijden. Zo zullen meerdere dieren nodig zijn om meerdere organen te werpen.
- Voor systemische vaatbedden superieur of inferieur aan het middenrif volg stappen 1.1-2.5 zoals hierboven. Zie aanvullende notities over het portaalsysteem en het middenrif(tabel 1).
- Pak het xiphoïde proces met een hemostat en snijd de ribbenkast bilateraal (ongeveer in de midaxillaire lijn) net voor de interne thoracale slagaders.
- Vouw de nog verbonden ribbenkast over zodanig dat het rust op de nek van het dier / hoofd, volledig bloot de borstholte.
- Volg stap 3.1 hierboven en verwijder vervolgens de longen. Zodra de thoracale aorta (TA) zichtbaar is, haak de uiteinden van gebogen tangen eronder, ~ 10 mm superieur aan het middenrif. Pak een lengte van 3 cm van 7-0 zijde, trek terug door de opening onder de TA, en maak een single-throw losse hechting. Herhaal deze procedure ~ 8 mm boven het middenrif.
- Voor structuren die superieur zijn aan het middenrif, gebruik de veerschaar om een klein gaatje (~ 30% van de totale omtrek) te maken op het ventrale gedeelte van de TA, ~ 2 mm inferieur aan de losse hechtingen geplaatst in stap 6.4.
- Voor structuren inferieur aan het middenrif, in plaats daarvan, maak een klein gat ~ 2 mm superieur aan de losse hechtingen.
- Breng afhankelijk van de grootte van het dier eenheid 1 of 2 in het vat, ga verder dan losse hechtingen en ligate het vat voorzichtig.
- Volg stap 3.7, stel de spuitpomp in op een snelheid van 1,0 mL/min en perfusing een minimum van 5 mL. Perfusate zal verlaten via het IVC.
- Volg de stappen 5.1 - 5.4 waarbij de infusiesnelheid wordt aangepast aan 0,05 mL/min, waarbij het doelweefsel visueel wordt gecontroleerd in real-time.
LET OP: Het infusievolume is orgaan- en dierleeftijdsspecifiek. Het volume kan verder worden beperkt door het ligateren van arteriële takken die leiden tot niet-doel vasculaire bedden (dat wil zeggen, hersenen, lever, nier, darm). - Volg 5.6 verwijder vervolgens doelweefsel en plaats in formaline.
7. Monster mount, scan, en reconstructie voor micro-CT
- Met behulp van paraffine film, maak een vlakke ondergrond op het scanbed en het centrum van de natte monster op dit oppervlak (Figuur 3A).
OPMERKING: Als bewegingsartefact wordt gedetecteerd, moet het monster mogelijk verder stabiliseren. - Licht tent/dekselmonster met extra paraffinefilm om uitdroging te voorkomen. Zorg er met speciale zorg voor dat u de paraffinefilm niet op het monster laat rusten en het weefsel vervormt(figuur 3B).
- Scan het voorbeeld met behulp van de in tabel 2 beschreven instellingen en standaardiseer deze parameters binnen een bepaald experiment.
OPMERKING: Dit is afhankelijk van het experiment/eindpunt. Standaardiseer de gekozen parameters voor het gemak van vergelijking tussen monsters. - Breng de gereconstrueerde scans over voor nabewerking en analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle cast zal vertonen uniforme vulling van het gehele longslagadernetwerk. We tonen dit aan in C57Bl/6J muizen variërend in leeftijd: Postnatale dag P90 (Figuur 4A),P30 (Figuur 4B), P7 (Figuur 4C), en P1 (Figuur 4D). Door de snelheid van de stroom te regelen en de vulling in real-time visueel te monitoren, werden betrouwbare eindpunten van de meest desalische vasculatuur bereikt (figuur 5A).
Veelvoorkomende uitdagingen zijn schade aan de longen, onvolledige vulling, ondervulling of overvulling, het wedging van de katheter en de grootte van het dier.
Als er schade is aan de long/luchtwegen, zullen kleine lekken voorkomen dat de longen druk houden(figuur 5B,C). Bij gebrek aan volledige inflatie wordt het moeilijk om nauwkeurige kwantitatieve en ruimtelijke vergelijkingen te maken tussen monsters. Om het risico voor de longen parenchyma te minimaliseren, vermijd snijden te dicht bij de longen bij het verwijderen van de ribbenkast en houd de longen vochtig met PBS tijdens de procedure om uitdroging en hechting aan de omliggende structuren te voorkomen. Als een kwab zich tijdens de inflatie aan de ribbenkast hecht, moet u de buitenkant van de ribbenkast (weg van de long) voorzichtig vastpakken met tangen en deze in een richting bewegen om de lobben te bevrijden. Als alternatief kan een stomp instrument, zoals een spatel, met een gladde rand worden gebruikt om de opgeblazen long weg te tillen of weg te duwen van de ribbenkast. Bij het opblazen van de longen, zich houden aan de voorgestelde druk parameters en te voorkomen dat over-inflatie als dit kan leiden tot breuk van de luchtwegen. Ten slotte, verwijder de longen niet uit de borstholte totdat de post-fixatie is voltooid. De luchtpijp, longen en hart moeten en bloc worden verwijderd uit de resterende delen van de borstholte.
Fragmentarisch (Figuur 5D) of onvolledig (Figuur 5E) vulling kan ontstaan uit een "luchtsluis", waarin lucht wordt geïntroduceerd in het vasculaire systeem via de katheter, blokkeren stroomafwaartse stroom van de verbinding. Om de kans op een luchtsluis te minimaliseren, moet u lucht voorzichtig zuiveren uit het puntje van de katheter voorafgaand aan het inbrengen (stap 3.4) en tijdens de spuitovergang van SNP/PBS naar polymeerverbinding. Als de vulling fragmentarisch of onvolledig blijft, kan dit een indicatie zijn van verhoogde vasculaire weerstand als gevolg van focal/long segment stenose of tortuosity. Bloedstolsels kunnen ook leiden tot onvolledige vulling en worden gemakkelijk vermeden door heparine te gebruiken voorafgaand aan de procedure.
Onjuist injectievolume leidt tot ondervulling of overvulling. Ondervulling treedt op wanneer er te weinig verbinding in de vasculatuur wordt binnengebracht(figuur 5F). Als alternatief kan overvulling of te veel polymeerverbinding te snel leiden tot een arteriële breuk(figuur 5G)of, meer in het algemeen, veneuze doorvoer(figuur 5H). Beide problemen kunnen worden verholpen door het gebruik van een spuitpomp. Onderzoekers moeten zich zorgvuldig houden aan de voorgestelde tarief- en volumebeperkingen of hun eigen tarieven vaststellen op basis van hun specifieke model en optimalisatie. Monitoring polymeer samengestelde perfusie in real time onder vergroting is van cruciaal belang, en het vullen van kleine slagaders / haarvaten moet worden gebruikt als eindpunt.
Het bevorderen van de katheter te ver naar beneden de longstam kan leiden tot de tip te wig in een longslagader tak en creëren een onbalans in de stroom. Als gevolg hiervan vult de ene kant sneller dan de andere(figuur 5I), wat vaak leidt tot overvulling in de ene long en ondervulling in de andere. Terwijl katheter wedging is de meest waarschijnlijke reden in dit scenario, "luchtsluis" en gebrek aan heparine kan ook bijdragende factoren.
Ten slotte presenteren kleinere dieren hun eigen reeks extra obstakels. Jongere dieren eisen vaste handen en kleine fouten zijn minder vergevingsgezind. Instrumenten van hoge kwaliteit, speciaal ontworpen voor microchirurgie, worden belangrijker op vroege postnatale tijdpunten. Het gebruik van een micromanipulator helpt sterk bij het niet alleen plaatsen, maar ook bij het voorkomen van katheterdislocatie. Het is ook essentieel om de spuitpomp op kleine dieren te gebruiken om eindpunten nauwkeurig te controleren en te beheren.
Hoewel deze procedure specifiek is aangetoond voor de longvaatculatuur, kan deze procedure ook gemakkelijk worden toegepast op systemische doelvasculaire bedden(tabel 1). Naast de hierboven genoemde uitdagingen is het kiezen van het juiste ingangspunt van cruciaal belang. Gieten via de thoracale aorta levert uitstekende resultaten op voor de meeste vaatbedden. Opgemerkt moet echter worden dat het inbrengen van de katheter zo proximaal naar de doelplaats mogelijk en ligating niet-doel vasculatuur helpt bij de stroom en volumeregeling. Deze verfijningen in combinatie met de juiste directe monitoring van distale vasculaire eindpunten(figuur 6A-F)en standaard infusiesnelheden optimaliseren de vulling. Vele voorbeelden van dergelijke het gieten methodes bestaan in de literatuur en zijn te talrijk voor het volledige verwijzen. Aanvullende gegevens zijn echter te vinden in orgaanspecifieke teksten zoalsdeze 4,5,77,18,19,20,21.
Na het gieten kunnen monsters worden verwerkt voor μCT scanning(figuur 7A,B). Voor nabewerking, een commerciële software pakket (zie Tabel van materialen) produceerde een 3D-volume rendering van de longvasculaire boom gepresenteerd als stilstaande beelden ( Figuur7C), of films. Verdere statistische analyses die vasculaire kenmerken zoals segmentlengte en aantal, tortuosity, orde (generatie of rang), volume, en arcadelengte onderzoeken kunnen ook worden uitgevoerd. Naast μCT-scanning kunnen de gegoten monsters ook worden gewist om brutobeelden te verkrijgen of verwerkt en gesneden voor histologische analyse8.
Figuur 1: Katheter en naaldopstelling. De spuiten worden getoond met bijgevoegde buizen en naalden (Eenheid1 en Eenheid2). Inzet: close-up van naald en slang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Longinflatie. Ringstandaard, klem, een spuit gevuld met formaline en slang met een katheter bevestigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Micro-CT monstervoorbereiding pre-scan. (A) Hier was het monster gecentreerd op een paraffine filmbasis, (B) Hier werd het monster gecentreerd en bedekt op de parafilmbasis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Vasculaire gegoten longen in verschillende ontwikkelingsstadia van 3 maanden tot 1 dag oud. Dorsale weergave van de longen, (A) P90, (B) P30, (C) P7, en (D) P1 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van ideale vulling en veelvoorkomende fouten tijdens polymeersamenstellingsinfusie. (A) Bij het bereiken van het eindpunt werd een robuust en fijn vasculair netwerk waargenomen. (B) Volledig opgeblazen formaline geperfundeerde longen worden weergegeven door een witte stippellijn, (C) Ondergeflatteerde /leeggelopen longen worden weergegeven. Dit werd waargenomen als gevolg van een gecompromitteerde longluchtweg. De oorspronkelijke opgeblazen positie wordt vertegenwoordigd door een witte stippellijn en de leeggelopen positie wordt vertegenwoordigd door een zwarte stippellijn, (D) Fragmentarische vulling: de vasculatuur van delen van de kwab blijft ongevuld terwijl andere gebieden volledig werden gevuld, (E) Onvolledige vulling: de polymeerverbinding niet door te dringen hele delen van de long, (F) Ondervulling: het polymeer verbinding niet te vullen distale vasculatuur, (G) Breuk: de pijl wijst naar het polymeer verbinding geëxtrudeerd uit vasculatuur, (H) Veneuze vulling: let op de pijl wijzend naar de slagaderlijke segmenten volledig gevuld en uit te breiden tot het veneuze systeem. Aders en venules waren van aanzienlijk groter kaliber, (I) Katheter wig: Hier de katheter werd shunted in een slagader voorkomen dat de vasculatuur van de rechter lobben volledig te vullen, terwijl de linker kwab was overvol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Vasculaire giet- en eindpunten in extra organen. (A) Nier: het punctaatuitschijn van polymeersamenstelling in de glomerulus vormde het eindpunt. (B) Lever: let op de kleine vaten zichtbaar aan de randen van het orgaan. (C) Maag: kleine vaten waren zichtbaar en volledig gevuld. (D) Dikke darm: Kleine bloedvaten zijn gemakkelijk te identificeren en gevuld. (E) Diafragma: de spier hier is dun en doorschijnend met kleine gevulde vaten zichtbaar. (F). Hersenen: kleine bloedvaten waren zichtbaar in de cortex. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7. CT-beelden en 3D-volumeweergave van polymeersamenstelling gevulde longen. (A) Een enkele grijs-schaal gereconstrueerde long slice, (B) Dit was een maximale intensiteit projectie van een CT-scan geproduceerd uit polymeer gevulde longen, (C) Een 3D-volume weergave van de vasculaire arcade werd gegenereerd met behulp van commercieel beschikbare software (zie Tabel van materialen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Doel arteriële vasculaire bed | Katheterplaatsing | Infusierichting | Infusiesnelheid | Notities |
| Hersenen | Thoracale aorta die cranially richt | Retrograde in de halsslagaders | .05ml/min | Cannulate thoracale aorta, flip muis naar de gevoelige positie, open hoofdhuid, en visueel toezicht op de voortgang van polymeer door de schedel. |
| Diafragma | Linker Ventrical | Anterograde in interne thoracale, phrenic, en intercostale | .05ml/min | Open een raam in de zijkant van de ribbenkast, waardoor het grootste deel van de ribbenkast en het middenrif intact blijven. Cannulate linker ventrical, clip rechter atrium, en monitor de voortgang van de caudal kant van het middenrif. |
| Bovenste ledematen spierstelsel | Thoracale aorta die cranially richt | Retrograde in de brachiocephalic en links subclavian | .02ml/min | Om de ledemaatstroom te optimaliseren, bindt u de halsslagaders af en verwijdert u de huid van ledematen om visuele controle van polymeerdoorvoer in het spierstelsel van de ledematen mogelijk te maken. |
| Nier | Thoracale aorta die caudally richt | Anterograde in nierslagaders | .05ml/min | De interne vasculatuur is blindelings gevuld. Om veneuze doorvoer te voorkomen, stop met injecteren wanneer polymeer zichtbaar is in een uniform punctaatpatroon over de nier. |
| Portal-systeem | Portaalader | Anterograde in portaalsysteem | .02ml/min | Vouw de lever voorzichtig op om de poortader bloot te leggen. |
| Hepatische | Thoracale aorta die caudally richt | Anterograde in de leverslagader | .05ml/min | Bind portaalader af voorafgaand aan de infusie om te voorkomen dat veneuze doorvoer van darmen in de lever stroomt. |
| Maag/darm | Thoracale aorta die caudally richt | Anterograde in de coeliakie, superieure mesenteric en/of inferieur mesenteric | .05ml/min | Sommige gebieden van de darm worden geleverd door meerdere slagaders en kunnen vullen op verschillende tijdstippen. Om veneuze doorvoer te voorkomen, bind slagaders af die niet nodig zijn voor interessegebieden en controleer visueel de voortgang van het polymeer. |
| Intra-abdominale vetpads | Thoracale aorta die caudally richt | Anterograde, maar vat is afhankelijk van vet pad wordt bestudeerd | .05ml/min | Vetpads worden geleverd door meerdere slagaders en kunnen op verschillende tijdstippen worden gevuld. Om veneuze doorvoer te voorkomen, bind slagaders af die niet nodig zijn voor een nauwkeurig interessegebied en houden ze de voortgang van het polymeer visueel in de gaten. |
| Onderste ledematen spierstelsel | Infraroodaorta die caudally richt | Anterograde in de dijbeenslagaders | .02ml/min | Verwijder de huid van ledematen om visuele controle van polymeer doorgang in het spierstelsel van de ledematen mogelijk te maken. |
Tabel 1. Het gieten van alternatieve vaatbedden.
| CT-instellingen | |
| Kvp | 90 |
| Doelmateriaal | Wolfraam |
| Macht | 8W |
| Filtratie | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Projectienummer | 6424 |
| Detectorgrootte | Flatpanel CMOS - 2944 x 2352 pixels |
| Gezichtsveld (FOV) | 36 mm |
| Voxel-grootte | 72 μm |
| Ruimtelijke resolutie | voxelmaat x 1,5 |
| Overnametijd | 14 min |
| Wederopbouw | FBP en commercieel algoritme |
| Binning | 1x1 |
Tabel 2. μCT-scanparameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode wordt goed uitgevoerd en levert opvallende beelden op van longslagadernetwerken, waardoor vergelijking en experimenten in knaagdiermodellen mogelijk zijn. Verschillende kritische stappen onderweg zorgen voor succes. Eerst moeten onderzoekers het dier in de voorbereidende fase inbrengen om te voorkomen dat bloedstolsels zich vormen in de longvaatculatuur en kamers van het hart. Dit zorgt voor de volledige arteriële doorvoer van polymeer verbinding. Ten tweede, bij het doorboren van het middenrif en het verwijderen van de ribbenkast, zorg ervoor dat de longen te beschermen tegen onbedoelde schade, snijwonden of letsel. Elk lek in de luchtwegen voorkomt volledige inflatie en maakt vergelijkingen tussen monsters onjuist. Ten derde, tethering het hart aan de top helpt katheter plaatsing. Ten vierde zal het gebruik van een sterke vaatverwijdende rol als SNP helpen bij zowel het verwijderen van bloed als het volledig vullen van slagaders en haarvaten5,8. Ten vijfde, bij het plaatsen van de katheter in de PAT, zorg ervoor dat de tip niet te begraven in de splitsing. Dit zal leiden tot een onbalans in de stroom, rangeren polymeer verbinding aan de linker-of rechterkant, waardoor een ongelijke druk gradiënt. Ten zesde, het gebruik van een spuitpomp zal de gebruiker in staat stellen om de snelheid te regelen en titer het volume om zowel muis stam en leeftijd. Laat ten slotte het hart/de longen aan de rest van de borstholte bevestigen, 's nachts repareren en de volgende dag verwijderen. De longen zullen goed worden vastgesteld en het potentieel voor deflatie als gevolg van toevallige inkepingen tijdens de scheiding zal worden geminimaliseerd.
Hoewel deze methode de gewenste resultaten bereikt, kunnen alternatieve technieken nuttig zijn voor sommige gebruikers. Om te helpen bij de plaatsing van de katheter, kan een micromanipulator worden gebruikt. We kozen voor een versie met een klein profiel en magnetische basis om de aantasting in een toch al beperkt werkgebied te minimaliseren, terwijl we een stabiele basis bieden (bij gebruik van een magnetische basis zorg ervoor dat u een stalen plaat onder de werkruimte plaatst om de magneet in staat te stellen deel te nemen). Hierdoor kan de gebruiker de punt van de katheter precies in de PAT plaatsen in een hoek die de natuurlijke baan van de slagader volgt. Bovendien is de katheter veilig en heeft het minder risico om los te komen. Een andere optie is het gebruik van een trompettist tip8. Hoewel niet triviaal te creëren, een trompettist is veel veiliger en minder geneigd om per ongeluk glijden uit de PAT. Het veranderen van de verhouding van polymeer:verdunningsge zot verandert de viscositeit en het gemak waarmee kleine vaten zijn gevuld. Afhankelijk van de doelvaatculatuur en experimentele eindpunten kan dit een waardevolle overweging zijn. Euthanasie via CO2 kan bij een klein percentage dieren longbloeding veroorzaken en is afhankelijk van22. Overweeg een alternatief euthanasieprotocol als dit gevolgen heeft voor experimentele eindpunten. Bij het opblazen van de longen helpt het gebruik van formaline fixatie van het orgaan op zijn plaats bij de gegeven druk. Een fysiologisch neutrale buffer kan worden vervangen indien perifere vaten in een niet-vaste toestand moeten worden ingevuld. Als infusiesnelheid en controle van minder belang zijn voor een bepaald experiment, is perfusie met de hand ook mogelijk. Handinjectie vereist praktijk en real-time monitoring onder vergroting om overvulling of vaartuigbreuk te voorkomen8. Ten slotte moeten de weefselmount/voorwaarden, scanparameters en minimale nabewerking die we voor dit papier hebben gebruikt, slechts als uitgangspunt dienen. Verschillende scanners, weefsels, experimentele eindpunten/gebruikersbehoeften kunnen alternatieve parameters vereisen.
Hoewel de vasculaire beelden gegenereerd uit deze techniek indrukwekkend zijn, zijn er beperkingen. In de eerste plaats is de bovenstaande methode suboptimaal voor het meten van vasculair kaliber vanwege het onvermogen om intravasculaire druk tijdens de infusie te controleren en te controleren. Andere groepen zijn erin geslaagd om deze drukproblemen in systemische vasculatuur enigszins aan te pakken door de rijdruk4,23te controleren, maar dergelijke zorgen worden aan de longzijde verder versterkt als gevolg van de relatief dunne longslagaderwanden die gemakkelijk te ontzien zijn met kleine veranderingen in druk24 en het onvermogen om de longtramonaire druk nauwkeurig te meten en statisch te controleren.
Een tweede beperking van deze methode is dat het een postmortem, single timepoint experiment blijft, het beperken van het nut ervan in studies die echt fysiologische omstandigheden of een tijdscursus vereisen. Andere, levende dierlijke maatregelen, zoals CT-longogiografie (CTPA) of contrast-enhanced μCT (CE-CT) bieden de mogelijkheid van functionele en morfologische maatregelen. Herhaalde scans/longitudinale studies en metingen op verschillende punten in de hart/longcyclus kunnen worden onderzocht10,25,26,27,28. Deze methoden kunnen betrouwbaar worden gebruikt, naast echocardiografie, om het arteriële kaliber te meten. Zowel ctpa- als echocardiografiemaatregelen zijn momenteel echter beperkt tot de beoordeling van de proximale vasculatuur. Voor echocardiogram, de beoordeling is beperkt tot de longstam, terwijl CTPA maakt een adequate berekening van de tak longslagader kaliber potentieel 1-2 bestellingen verder, maar resolutie is beperkt, verduisterende distale delen van de vasculatuur7. Stralingsdosering is ook een punt van zorg dat zorgvuldig moet worden gecontroleerd bij het gebruik van CT, vooral in multi-scan longitudinale studies29,30. Voor een van deze toepassingen kunnen μCT-apparatuur, scantijd en analysesoftware duur zijn en gespecialiseerde personeelstraining vereisen. De kernfaciliteiten van animal imaging bij sommige instellingen kunnen deze last verlichten.
Als alternatief voor deze verbinding maken sommige groepen gebruik van traditionele corrosiegiettechnieken die gepaard gaan met verwijdering van weke delen31,32. Deze methoden leveren resultaten op die vergelijkbaar zijn met deze polymeerverbinding, maar het eindproduct is broos, wat leidt tot potentieel artefact15. Bovendien elimineert het verwijderen van zacht weefsel het potentieel voor toekomstige histologie33. Een andere optie is om het zachte weefsel intact te laten en een vervolgstap uit te voeren waarbij het zachte weefsel wordt "gewist" waardoor het monster vrijwel transparantwordt 34,35. Weefselclearing geeft de gebruiker de mogelijkheid om dieper in een monster te kijken, maar blijft over het algemeen inferieur aan μCT omdat het niet dezelfde 3D-visualisatie kan bieden. Seriële histologische sectioning en array tomografie zijn methoden die een uitzonderlijk hoge resolutie bieden. Hoewel deze techniek de deur opent naar spannende nieuwe mogelijkheden, is de werklast exponentieel hoger en niet bijzonder bevorderlijk voor grote cohorten11,12. 3D x-ray histologie is een niet-destructieve benadering die zowel μCT als traditionele histologie koppelt of zelfs EM36,37,38. Het neemt een meer hoog niveau beeld van pathologie door gebruik te maken van μCT om wereldwijd te identificeren en nauwkeurig scout regio's van belang die vervolgens worden opgevolgd met routine histologie39. Het vervangen van contrastmiddelen met een lagere resolutie (of in sommige gevallen geen contrast) met polymeersamenstelling in de vasculatuur kan dienen om beide technieken waar mogelijk te verheffen. Een andere niet-destructieve benadering die rekenkundig intensief is, maar mogelijk het contrast verbetert, is fase-retrieval μCT imaging40,41. Deze methode kan waardevol zijn wanneer gebruikt op luidruchtige gegevens waar het contrast zwak of niet mogelijk is42. De polymeerverbinding die in deze techniek wordt gebruikt, heeft echter geen last van deze beperking. Dat gezegd hebbende, kan het snel ophalen nuttig zijn wanneer de polymeerverbinding mogelijk wordt verdund, bijvoorbeeld in distale vasculatuur43. Ten slotte is stereologie al jaren een standaard in longreve kwantitatieve structurele analyse44. Het maakt gebruik van willekeurige, systematische bemonstering op dwarsdoorsnedes van weefsel om 3D gevolgtrekkingen te maken ervan uitgaande dat de gekozen monsters voldoende representatief zijn. Terwijl een krachtig hulpmiddel, het heeft het potentieel om te leiden tot fouten en bias. Het combineren van CT-beeldvorming met stereologie, echter, houdt grote belofte45.
De geschetste methode is relatief eenvoudig en met training is een slagingspercentage van >90% haalbaar. Eenmaal onder de knie, het zorgt voor de volledige en betrouwbare gieten van longvaatculatuur. In fixatief blijven weefsel en polymeer voor onbepaalde tijd stabiel voor toekomstige scans, potentiële histologie of EM46,47. We hebben aangetoond dat deze techniek kan worden gebruikt bij dieren zo jong als P1 door volwassenheid en geloven embryonale gieten, via de longslagader, is binnen handbereik. Opgemerkt moet worden dat deze techniek kan worden toegepast op vrijwel elk ander vaatbed door simpelweg het ingangspunt van de katheter te veranderen en de juiste eindpunten te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door het NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). We willen de NIH Mouse Imaging Facility bedanken voor de begeleiding bij het verwerven en analyseren van afbeeldingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
