Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Dit protocol geeft nauwkeurige, stapsgewijze richtlijnen voor het gieten van de longslagader vasculatuur in zowel volwassen als vroege postnatale muizen. Deze techniek stelt gebruikers in staat om het hele vasculaire netwerk volledig te casten voor visualisatie door een verscheidenheid aan methoden, waaronder micro-CT, met behoud van de integriteit van weke delen. Deze techniek is vooral handig voor het kijken naar long-vasculaire morfologie en architectuur, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor de targeting van andere vasculaire bedden.

Net als veel operaties en dissecties, er is geen substituut voor het daadwerkelijk visualiseren van een procedure, en kijkers kunnen profiteren van het zien van een aantal van de meer uitdagende manoeuvres worden uitgevoerd. Zodra het xiphoid proces is blootgesteld, voorzichtig grijpen en verheffen van de ribbenkast. Maak voorzichtig een incisie in het nu blootgestelde, semi-transparante middenrif.

De longen zullen zichtbaar instorten, en terugtrekken uit de buurt van het middenrif. Na het blootstellen van de long en luchtpijp, draad 15 centimeter PE10 buizen op de naaf van een 30-gauge naald. En bevestig dit apparaat aan een spuit van 1 milliliter, met 10 aan de 4 molaire natrium nitroprusside, in PBS.

Ga de zuiger naar de slang prime totdat alle van de lucht is gezuiverd. Als een effectief alternatief voor de tekst, penetreren de top van het hart aan de ene kant, en passeer de uiteinden van gebogen tangen door de spier, en de andere kant van het weefsel. Pak het ene uiteinde van een lengte van 10 centimeter van 7-0 zijde en trek ongeveer twee centimeter door het weefsel.

Na het afbinden van de hechting, gebruik de resterende acht centimeter hechting om het hart caudally te trekken. En plak het einde van de hechting aan de chirurgische raad. Haak de uiteinden van gebogen tang onder zowel de opgaande aorta en longslagader stam.

En trek een lengte van drie centimeter van 7-0 zijde terug door de opening om een single-throw losse hechting te creëren. Gebruik een schaar om een een-tot-twee-millimeter incisie te maken naar de top van het hart, het penetreren van de dunwandige rechter ventrikel. En introduceer de geprimede slang in de rechter ventrikel, voorzichtig het bevorderen van de katheter in de semi-transparante, dunwandige longslagader stam.

Controleer visueel of de katheter niet in de linker- of rechter longtak is gevorderd en niet op het punt van de longslagadertak. Tape het distale gedeelte van de slang aan de chirurgische raad, en draai voorzichtig de losse hechting rond beide grote schepen. Snijd de acht centimeter stuk hechting om het hart terug te keren naar een natuurlijke rustpositie.

En knip het linker orakel van het hart om het perfusaat in staat te stellen de vasculatuur te verlaten. Gebruik vervolgens een spuitpomp om de natrium nitroprusside in te spuiten met een stroomsnelheid van 0,5 ml/min om zowel het bloed te spoelen als de vaatculatuur maximaal te verwijden, totdat het perfusaat helder is. Om de longinflatie-eenheid te construeren, snijdt u de flexibele plastic 24-gauge intraveneuze katheter uit een bad en sluit u aan op de naald van een vlinderinfusieset.

Bevestig dit apparaat aan de stopcock, en bevestig de stopcock aan een open 50-milliliter spuit. Na het laden van de spuit met formaline en priming de katheter, met de stopcock gesloten, plaats de spuit in een ring staan, tot het punt waarop de meniscus is 20 centimeter boven de luchtpijp. Plaats twee losse hechtingen, twee tot vier millimeter uit elkaar, inferieur aan het kraakbeen van cricoïde, en gebruik een schaar om een kleine incisie te maken in de cricothyroid ligament, superieur aan de hechtingen.

Steek de katheter in de opening en zet de punt voorbij de twee losse hechtingen. Draai de hechtingen rond de luchtpijp aan en open de stopcock om de formaline door de zwaartekracht in de longen te laten komen. Wacht vijf minuten tot de longen volledig opblazen.

Als de longen zich hechten aan de ribbenkast tijdens de inflatie, gebruik bot-getipt tangen om de buitenkant van de ribbenkast te grijpen, en beweeg de ribben in alle richtingen om te helpen bij het bevrijden van de lobben zonder direct contact met de longen. Trek na vijf minuten de katheter achter de eerste hechting en ligate in. Trek vervolgens de katheter achter de tweede hechting en ligate in.

De longen moeten nu worden opgeblazen in een gesloten, onder druk staat. Om de vasculatuur te werpen, laadt u een milliliter van een 8-1-1-oplossing van polymeerverwijdend middel in een spuit van één milliliter. En steek voorzichtig de zuiger in.

Met de spuit omgekeerd, druk de zuiger om de lucht te verwijderen, en om de vorming van een meniscus op het puntje van de spuit mogelijk te maken. Verwijder de natrium nitroprusside spuit uit de naaf van de naald, en druppel toevoeging PBS in de hub, om een meniscus te creëren. Sluit de polymeersamenstellingspuit aan bij de naaf en start de infusie op 0,02 millimeter per minuut.

Controleer de verbinding als het beweegt vrij door de slang, wijzend op de spuit volume als het in de longslagader stam. Ga door met de overvloed totdat alle lobben volledig zijn gevuld, tot in het kleinste vat. Stop de pomp, en nogmaals, let nogmaals op de spuit volume.

Bedek de longen met een glasvezel reinigingsdoek, en royaal van toepassing PBS. Laat het monster 30 tot 40 minuten ongestoord zitten bij kamertemperatuur. Zodra het polymeer verbinding is genezen en gehard, verbreken de ledematen en de onderste helft van de muis.

En plaats het hoofd en de thorax in een 50-milliliter conische gevulde 10% gebufferde formaline, ‘s nachts. De volgende ochtend, pak de luchtpijp om voorzichtig te scheiden van het hart en de longen eenheid van de resterende ribbenkast en thorax. Plaats het geoogste weefselblok in een met formalin gevulde scintillatieblad.

Een succesvolle cast zal resulteren in een uniforme vulling van het gehele longslagadernetwerk. Als er schade is aan de long- of long airways, zullen kleine lekken voorkomen dat de longen druk vasthouden. Fragmentarisch of onvolledig vullen kan ontstaan uit een luchtsluis als gevolg van lucht wordt geïntroduceerd in het vasculaire systeem via de katheter, blokkeren stroomafwaartse stroom van de verbinding.

Ondervulling treedt op wanneer er te weinig verbinding in de vasculatuur wordt gebracht. Als alternatief kan overvulling, of de invoering van te veel polymeer verbinding te snel, kan leiden tot arteriële breuk, of, meer in het algemeen, veneuze doorvoer. Het bevorderen van de katheter te ver naar beneden de longstam kan leiden tot de tip te wig in een longslagader tak, het creëren van een onbalans in de stroom, en waardoor de ene kant sneller te vullen dan de andere.

Zorgvuldige prestaties van de techniek zoals aangetoond, met behulp van de juiste directe monitoring van distale vasculatuur eindpunten, en standaard infusie tarieven kunnen resulteren in een optimale vulling van longva vasculatuur. Bovendien kan het aanpassen van deze techniek aan de systemische vasculatuur even gunstige resultaten opleveren in andere vaatbedden. Na het gieten kunnen monsters worden verwerkt voor het scannen van micro-computertomografie.

Voor nabewerking kan een commercieel softwarepakket worden gebruikt om een 3D-volumeweergave van de long-vasculaire boom te genereren. Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, vooral voorzichtig zijn rond de fragiele longen, en de longslagader. Belangrijker nog, vermijd de invoering van lucht in het vasculaire circuit.

Na een succesvolle cast kan een monster worden gescand door micro-CT, en vragen met betrekking tot vasculaire morfometrie en architectuur kunnen worden onderzocht.