Summary
La aplicación de exosoma es una herramienta emergente para el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Establecemos un protocolo de aislamiento exosoma con alta pureza para aislar exosomas de nuevas células madre identificadas llamadas CB-SC para estudios mecánicos. También coculuramos exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos, lo que lleva a su diferenciación en macrófagos fenotípicamente distintos.
Abstract
La terapia de educador de células madre (SCE) es un nuevo enfoque clínico para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes. La terapia SCE circula las células mononucleares de la sangre del paciente aislado (por ejemplo, linfocitos y monocitos) a través de una máquina de aféresis, co-cultiva las células mononucleares de sangre del paciente con células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) en el dispositivo SCE, y luego devuelve estas células inmunitarias "educadas" a la sangre del paciente. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanonúlgubre entre 30o u2012150 nm existentes en todos los medios de cultivo de biofluidos y células. Para explorar más a fondo los mecanismos moleculares subyacentes a la terapia SCE y determinar las acciones de los exosomas liberados de CB-SC, investigamos qué células fagocitan estos exosomas durante el tratamiento con CB-SC. Al co-cultivar exosomas derivados de CB-SC con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), descubrimos que los exosomas derivados de CB-SC eran tomados predominantemente por monocitos humanos CD14 positivos, lo que llevó a la diferenciación de los monocitos en macrófagos tipo 2 (M2), con morfología similar a un husillo y la expresión de marcadores de superficie moleculares asociados a M2. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y caracterización de exosomas derivados de CB-SC y el protocolo para la cocultura de exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos y el monitoreo de la diferenciación M2.
Introduction
Las células madre de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) son un tipo único de células madre identificadas a partir de la sangre del cordón umbilical humano y se distinguen de otros tipos conocidos de células madre como las células madre mesenquimales (MSC) y las células madre hematopoyéticas (HSC)1. Basándonos en sus propiedades únicas de modulación inmune y su capacidad para adherirnos firmemente a la superficie de los platos petri, desarrollamos una nueva tecnología designada como terapia de educador de células madre (SCE) en ensayos clínicos2,3. Durante el tratamiento con SCE, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente se recogen y distribuyen a través de un separador celular y se co-cultivan con CB-SC adherente in vitro. Estas células "educadas" (PBMC tratada con CB-SC) se devuelven a la circulación del paciente en un sistema de bucle cerrado. Los ensayos clínicos ya han demostrado la seguridad clínica y eficacia del tratamiento SCE para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1 (T1D)2,4 y la alopecia areata (AA)5.
Los exosomas son una familia de nanopartículas con diámetros que oscilan entre los 30o u2012150 nm y existen en todos los medios de cultivo de biofluidos y células6. Los exosomas están enriquecidos con muchas moléculas bioactivas, incluyendo lípidos, ARNm, proteínas y microRNAs (miRNA), y desempeñan un papel importante en las comunicaciones de célula a célula. En los últimos tiempos, los exosomas se han vuelto más atractivos para los investigadores y las compañías farmacéuticas debido a su potencial terapéutico en las clínicas7,8,9. Recientemente, nuestros estudios mecánicos demostraron que los exosomas liberados por CB-SC contribuyen a la modulación inmune de la terapia SCE10.
Aquí, describimos el protocolo para explorar el mecanismo de la terapia SCE dirigida a monocitos por exosomas liberados por CB-SC. En primer lugar, los exosomas liberados por CB-SC se aislaron de los medios condicionados derivados de CB-SC utilizando métodos de ultracentrifugación y se validaron mediante citometría de flujo, mancha occidental (WB) y dispersión dinámica de luz (DLS). En segundo lugar, los exosomas derivados de CB-SC fueron etiquetados con un tinte lipofílico fluorescente verde: Dio. En tercer lugar, se co-cultivaron con PBMC para examinar los porcentajes positivos de exosomas derivados de CB-SC con etiqueta dioda en las diferentes subpoblaciones de PBMC por citometría de flujo. Este protocolo proporciona orientación para estudiar la acción de los exosomas subyacentes a la modulación inmune de las células madre.
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Protocol
El protocolo sigue las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana en center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Las unidades de sangre de capa de buffy humana fueron compradas en el New York Blood Center (Nueva York, NY). Las unidades de sangre de cordón umbilical humano fueron recolectadas de donantes sanos y compradas en el banco de sangre Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto el Centro de Sangre de Nueva York como Cryo-Cell han recibido todas las acreditaciones para la recolección y distribución de sangre, con la aprobación del IRB y han firmado Formularios de Consentimiento de donantes.
1. Cultivo celular y preparación de un medio condicionado derivado de CB-SC
- Transfiera 25 ml de sangre de cordónumbilical (Tabla de materiales)a más de 20 ml de medio de gradiente de densidad (γ a 1.077) a un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar a 1.690 x g durante 20 min a 20oC en un rotor basculante sin freno.
- Transfiera cuidadosamente la capa de celda mononuclear (capa de buffy) a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Llene el tubo cónico con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a 40 ml. Mezclar y centrifugar a las células de pellet a 751 x g durante 10 min a 20 oC.
- Deseche el sobrenadante y agregue 15 ml de tampón de lelisis ACK (Tabla de materiales) al pellet celular. Re-suspenda las células a través del pipeteo. Luego incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Este paso elimina los glóbulos rojos. - Llene el tubo cónico con 25 ml de PBS. Centrifugar a 751 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante para obtener células mononucleares peletificadas.
- Lavar 2x con 40 ml de PBS para eliminar el tampón de lisis restante.
- Centrifugar a 751 x g durante 5 min para peletizar las células.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células mononucleares de sangre del cordón umbilical con 10 ml de medio libre de suero definido por productos químicos(Tabla de materiales)por tubo.
- Combine las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical con un tubo.
- Tomar la suspensión de células de 20 l y mezclar con 20 l de solución azul tripano 0,4%(Tabla de materiales)en un tubo de 1,5 ml.
- Cargue en el portaobjetos de la cámara y cuantifique el número de celda y la viabilidad de la célula con un contador de células automatizado.
NOTA: La suspensión celular se diluye a 1:10 si la concentración celular está por encima de 1 x 107 células/ml. - Células mononucleares de semillas en platos Petri de 150 mm x 15 mm a 1 x 106 células/ml, 25 ml/plato en medio de cultivo celular libre de suero definido por productos químicos.
- Incubar a 37oC bajo condiciones de 8% de CO2 durante 10-u201214 días hasta que CB-SC alcance más del 80% de confluencia.
- Deseche el sobrenadante y lávelo con 15 ml de PBS por plato De Petri; entonces, quite el PBS.
NOTA: CB-SC se unen firmemente a los platos Petri. - Repita el paso 1.14 dos veces.
- Añadir 25 ml de medio libre de suero definido por productos químicos por plato De Petri.
- Incubar a 37oC en condiciones de 8% deCO2 durante 3o3o20124 días.
- Recoger el medio condicionado derivado de CB-SC en tubos cónicos de 50 ml.
2. Caracterización de CB-SC
- Separe CB-SC pipeteando 10 ml del búfer de disociación celular basado en PBS hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 5 ml (Tabla de materiales).
- Centrifugar a 1.690 x g durante 5 min a células de pellet y re-suspender en 200 l de PBS.
- Fijar y permeabilizar las células para la tinción intracelular a través del kit de preparación de la tinción (Tabla de materiales).
- Añadir 5 l de bloqueador Fc(Tabla de Materiales)por muestra e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
NOTA: El bloqueador Fc inhibe la unión no específica al tintar con anticuerpos. - Añadir anticuerpos monoclonales antihumanos conjugados con fluorescencia conjugada con fluorescencia, incluidos CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 y Galectin 9 a 25 g/ml(Tabla de materiales)a un volumen de células de 100 oL. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con protección lumíña.
- Después de la tinción, lavar las células con 1 ml de PBS y centrífuga a 751 x g durante 10 min a las células de pellet.
- Re-suspenda las células con 200 l de PBS y transfiera a un tubo de 5 ml.
- Realizar la citometría de flujo para validar la expresión de CB-SC asociado por encima de marcadores específicos.
3. Aislamiento de exosomas derivados de CB-SC
- Centrifugar el medio acondicionado recogido del paso 1.18 a 300 x g durante 10 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar el sobrenadante recogido del paso 3.1 a 2.000 x g durante 20 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar el sobrenadante recogido del paso 3.2 a 10.000 x g durante 30 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
NOTA: El rotor de ángulo fijo se utiliza para que los pellets celulares se precipiten hacia el lado del tubo. Marque el lado de la tapa y dibuje un círculo en el lado del tubo donde se espera el pellet. - Filtrar los sobrenadantes recogidos del paso 3.3 con un filtro de 0,22 m(Tabla de materiales).
- Transferir 15 ml de soporte a cada unidad de filtro centrífugo de 10 kDa (Tabla de materiales).
- Centrífuga a 4.000 x g durante 30 min para aislar los medios exosoma concentrados.
- Transfiera los exosomas concentrados a un tubo de ultracentrífuga. A continuación, los exosomas de pellets a 100.000 x g durante 80 min a 4 oC.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los exosomas de pellets en 10 ml de PBS.
- Centrifugar a 100.000 x g durante 80 min a 4 oC para recoger el pellet de exosomas.
- Re-suspenda el pellet de exosomas en 200 l de PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
4. Caracterización de exosomas derivados de CB-SC
- Cuantificación de la concentración total de proteínas de la preparación de exosomas mediante el kit de ensayo de ácido bicinchonínico (BCA)
- Pipetear 10 l de cada muestra de exosoma aislado y estándar de albúmina preparada en el paso 3.10 en una placa de 96 pocillos por duplicado.
- Añadir 200 l del reactivo de trabajo del kit BCA a cada pocól. Mezcle bien el contenido de la placa en el agitador de placas durante 10 s.
NOTA: Reactivo de trabajo (WR): Reactivo de 50 partes A con reactivo de 1 parte B. - Cubrir las placas con papel de aluminio e incubarlas a 37oC durante 30 min.
- Enfríe las placas a temperatura ambiente (RT).
- Mida la absorbancia de la muestra a 562 nm a través de un lector de placas.
- Preparación y tinción de exosomas para la citometría de flujo
- Capturar exosomas añadiendo 20 l de perlas magnéticas CD63 antihumanas (tamaño de 4,5 m)(Tabla de materiales)en 25 g de exosomas derivados de CB-SC preparados en el paso 3.10 en un volumen total de 100 l de PBS.
- Incubar el tubo durante la noche (18o u201222 h) a 4oC en la coctelera a 800 rpm.
- Centrifugar el tubo a 300 x g durante 30 s para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.
- Añadir 300 l de tampón de aislamiento (0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS) y mezclar suavemente por pipeteo.
NOTA: Este paso lava los exosomas ligados a cuentas. - Coloque el tubo sobre un soporte de imán durante 1 min (Tabla de Materiales) y deseche el sobrenadante.
- Repita los pasos 4.2.4-u20124.2.5.
- Vuelva a suspender los exosomas ligados al cordón con 400 ml de búfer de aislamiento.
- Aliquot 100 l de exosomas ligados a cuentas a cada tubo.
- Agregue anticuerpos conjugados con fluorescencia (CD9-FITC, CD81-PE y CD63-FITC a 25 g/ml, respectivamente) a cada tubo de flujo con exosomas cd63 capturados con perlas.
NOTA: Los IgG que coinciden con los isotipos sirven como controles negativos. - Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente con protección lumíña en el agitador a 800 rpm.
- Repita los pasos 4.2.4-u20124.2.5.
- Rea suspenda los exosomas ligados al cordón en 200 ml de tampón de aislamiento y transfiera a tubos de flujo de 5 ml.
- Coloque los tubos en el carrusel de muestra del citometro de flujo.
- Abra el protocolo para las pruebas de exosomas.
- Ejecute la muestra automáticamente por citometro de flujo.
- Detección de exosomas por western blot
NOTA: Western blot es un método bien establecido y no entraremos en detalles del método en sí.- Lyse los pellets de exosomas derivados de CB-SC del paso 3.10 con 100 l de tampón RIPA, pipeta 20x, luego colóquelos en hielo durante 5 min.
- Cuantificar la concentración proteica de un matsato por kit de BCA y cargar 25 g de proteína por poc.
- Separe las proteínas por electroforesis de gel durante 40 min a 150 V.
- Transfiera la proteína a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando el método de transferencia semisequeo11.
- Bloquear la membrana con 5% de leche sin grasa durante 30 min.
- Incubar con anticuerpos antihumanos de Calnexina de 2 g/ml(Tabla de materiales)y anticuerpos antihumanos de Calnexina(Tabla de Materiales).
- Detectar la proteína por quimiuminescencia con un sistema de imágenes digitales.
- Validación de exosomas por dispersión de luz dinámica (DLS)
- Diluir 10 g de muestras de exosomas derivadas de CB-SC en 1 ml de PBS.
- Transfiera los 1 ml de muestra diluida a la semi-micro cubeta desechable (Tabla de materiales).
- Coloque la cubeta en el instrumento DLS. Establezca el índice de refracción (RI) como 1,39 para todo el monitor de muestra.
- Ejecuta muestras a 25oC y adquiere tres mediciones por fracción para obtener una distribución de tamaño promedio.
- Validación de exosomas por microscopía electrónica de transmisión (TEM)
- Capa formvar en 300 rejillas de cobre de malla12 (Tabla de materiales).
- Fortalecer el formvar con la capa adicional de carbono evaporado en las rejillas de cobre12.
NOTA: Este enfoque de recubrimiento es excelente para el soporte de muestras. - Cargue 10 ml de muestras de exosomas en rejillas y déjelas secar al aire.
- Tiñe negativamente las muestras con acetato de uranilo durante 5 min.
- Lavar tres veces con agua DI y dejar secar al aire.
- Observar y fotografiar las muestras bajo TEM. Ajuste la tensión de aceleración a 200 kV y el tamaño del punto en 2.
5. Medir exosomas derivados de CB-SC con etiqueta diodo tomados por diferentes subpoblaciones de PBMC
-
Etiqueta CB-SC-derivado exosomas con colorante lipofílico fluorescente verde Dio
- Transfiera 100 g de exosomas derivados de CB-SC (preparados en el paso 3.10) a un tubo centrífugo de 15 ml.
- Diluir la muestra con PBS a 5 mL.
- Añadir colorante lipofílico fluorescente verde Dio (Tabla de Materiales) hasta que la concentración de trabajo alcance los 5 m.
- Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.
- Transfiera la muestra a un tubo ultracentrífugo.
- Centrífuga a 100.000 x g durante 80 min para peletizar exosomas derivados de CB-SC con etiqueta dio.
- Vuelva a suspender los exosomas etiquetados en 200 l de PBS.
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Preparación de PBMC humano
- Transfiera 25 ml de capa de buffy humana (Tabla de Materiales) sobre 20 mL de medio de gradiente de densidad (γ a 1.077) en un tubo cónico de 50 ml.
- Repita los pasos 1.2 a 1.11.
- Transfiera 1 x 106 PBMC a una placa hidrofóbica no tratada con tejido de 24 pozos (1 ml/pozo).
NOTA: Se utilizó una placa no tratada con tejido para evitar la adhesión de monocitos.
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Exosomas etiquetados por Dio con PBMC
- Transfiera exosomas de 40 l con etiqueta de diodo derivados de CB-SC preparados en el paso 5.1.7 a cada pozo que contenga PBMC en una placa de 24 pocillos utilizando una pipeta de 200 l. Agregue el mismo volumen de PBS para controlar pozos.
- Mezclar por pipeteo 10x. Incubar durante 4 h.
- Recoger PBMC tratado con exosoma de 200 l y etiquetar con Hoechst 33342 durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 100 l de PBS.
- Monte las células en las diapositivas del microscopio.
- Observar y fotografiar la interacción de exosomas derivados de CB-SC con PBMC con etiqueta Hoechst 33342 utilizando un microscopio.
- Transfiera las células restantes del paso 5.3.3 a un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 l de PBS.
- Añadir 5 l de bloqueador fc por muestra. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Agregue anticuerpos (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 y CD56 a 25 g/ml)(Tabla de materiales)para manchar PBMC.
NOTA: Los IgG que coinciden con los isotipos sirven como controles negativos. - Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con protección lumíña.
- Añadir 1 ml de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 min a 4 oC para peletizar las células.
- Vuelva a suspender las células con 200 l de PBS. Añadir 5 l de yoduro de propidio.
- Utilice la citometría de flujo para evaluar el nivel de absorción de exosomas con etiqueta de dio en diferentes subpoblaciones de PBMC.
6. Examinar la acción de los exosomas derivados de CB-SC en monocitos
- Aislamiento de monocitos humanos CD14 positivos
- Transfiera 3 x 107 PBMC humano a un tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4oC.
- Coloque la columna de separación (Tabla de materiales) en el separador de imán ( Tabla demateriales).
- Lavar las columnas de separación tres veces con 2 ml de búfer de funcionamiento en frío (Tabla de materiales).
- Vuelva a suspender las células en 300 l de PBS frío. Añadir 60 l de microperlas CD14. Mezclar bien e incubar sobre hielo durante 15 min.
- Añadir 6 ml de PBS frío. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4oC.
- Vuelva a suspender las células peletadas en 500 ml de búfer de funcionamiento en frío.
- Transfiera las celdas a la columna de separación (preparada en el paso 6.14) y déjelas pasar.
- Lave la columna de separación tres veces con 2 ml de tampón de funcionamiento por lavado. Levante la columna del separador de imanes y colóquela en un tubo centrífugo de 15 ml.
NOTA: El tubo de 15 ml debe colocarse sobre hielo debido a la adherencia de monocitos CD14 positivos al tubo a temperatura ambiente. - Transfiera 2 ml de búfer de funcionamiento en frío a la parte superior de la columna y aísle las celdas CD14 positivas en el tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 oC para peletizar las células CD14 positivas.
- Re-suspender las células con 2 ml de medio libre de suero definido por productos químicos fríos (Tabla de materiales).
- Transfiera 50 l de células a un tubo de 1,5 ml.
- Mancha con 10 l de Krome Anom anomante conjugado anomante anhumano CD14 mAb(Tabla de Materiales)durante 20 min.
NOTA: Los IgG que coinciden con los isotipos sirven como controles negativos. - Agregue 1 ml de PBS a las celdas. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a células de pellet.
- Vuelva a suspender las células en 200 l de PBS y transfiéralas a un tubo de 5 ml. Determinar la pureza de los monocitos CD14 positivos por citometría de flujo.
- Tratamiento de monocitos con exosomas derivados de CB-SC
- Semilla 1 x 106 monocitos purificados con medio de cultivo libre de suero definido por productos químicos(Tabla de materiales)en placa de 6 pozos tratada con cultivo de tejido (2 ml/pozo).
- Incubar durante 2 h a 37oC por debajo del 5% de CO2.
- Deseche el sobrenadante con pipeta de 1 ml. Añadir suavemente 2 ml de medio de cultivo libre de suero precalecido por productos químicos de 37oC(Tabla de materiales).
NOTA: Los monocitos se adhirieron a la placa en 2 h. Las células flotantes fueron identificadas como contaminaciones muertas u otras contaminaciones celulares. - Añadir exosomas derivados de CB-SC de 80 g aislados del paso 3.10 a cultivos monocitos en una placa de 6 pocillos con un volumen total de 2 ml.
NOTA: Se agregó el mismo volumen de PBS para controlar pozos. - Incubar a 37oC por debajo del 5% deCO2 durante 3o3o20124 días.
- Fotografiar la morfología celular con un microscopio invertido a 200× aumento(Tabla de Materiales).
- Separe las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo en 1 ml de un búfer de disociación celular basado en PBS con punta de pipeta de 1 ml.
- Cosecha las células unidas restantes a través de un rascador de células.
NOTA: Dado que los monocitos primarios o los macrófagos diferenciados se adhieren firmemente, algunas células permanecen adheridas a la parte inferior después del tratamiento con tampón de disociación. Por lo tanto, estas células se cosechan con un rascador celular. - Recoger celdas a 1.690 x g durante 5 min. Re-suspenda las células en 200 l de PBS.
- Agregue 5 l de bloqueador de Fc (25 g/ml) para bloquear la unión no específica.
- Agregue anticuerpos (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209 a 25 g/ml, tabla de materiales)a las células. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: Los IgG coincidentes con isotipos sirven como control negativo - Añadir 1 ml de PBS a las células y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender con 200 l de PBS.
- Añadir 5 sl de yoduro de propidio por muestra (200 l) y transferir células a un nuevo tubo de flujo de 5 ml.
- Realice la citometría de flujo y evalúe los niveles de expresiones CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209.
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Representative Results
Inicialmente, el fenotipo y la pureza de CB-SC se examinaron mediante citometría de flujo con marcadores asociados a CB-SC como el antígeno común de leucocitos CD45, los factores de transcripción específicos de la célula ES OCT3/4 y SOX2. CB-SC muestra altos niveles de expresión CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y galectina 9, pero ninguna expresión de CD34 (Figura 1A). El análisis de citometría de flujo confirmó la expresión de marcadores específicos de exosomas, incluidos CD9, CD81 y CD63, estaban en exosomas derivados de CB-SC (Figura 1B). La morfología y la distribución del tamaño de los exosomas se caracterizaron por TEM y DLS(Figura 1C,D),con un tamaño de 79,38 ± 20,07 nm. Western blot demostró además la expresión del marcador asociado al exosoma Alix, sin expresión del marcador asociado a ER Calnexin (Figura 1E).
PBMC fueron tratados con CB-SC-Exo con etiqueta dio. La observación de la microscopía demostró la interacción directa de CB-SC-Exo con LA PBMC(Figura 2A). Para definir mejor qué población celular interactuó con el CB-SC-Exo con etiqueta de dio, se ensuñaron diferentes compartimentos celulares con marcadores específicos de celdas como CD3 para células T, CD11c para células dendríticas mieloides (DC), CD14 para monocitos, CD19 para células B y CD56 para células NK (Figura 2B). Después de una incubación durante 4 horas, la citometría de flujo demostró que diferentes compartimentos de células sanguíneas mostraban a diferentes intensidades medianas de fluorescencia (IMF) de exosomas dio positivos(Figura 2C). En particular, los monocitos mostraron una mayor intensidad media de fluorescencia de CB-SC-Exo dio positivo que las de otras células inmunitarias (Figura 2C), destacando que los monocitos fueron blanco principalmente de los exosomas derivados de CB-SC.
Para explorar los efectos directos de los exosomas derivados de CB-SC en monocitos, los monocitos purificados CD14+ fueron co-cultivados con exosomas derivados de CB-SC durante 3 días. El monocitos tratado con exosomas se diferenció con éxito en morfologías similares a los de un husillo(Figura 3A). A continuación, se probaron fenotipos de los monocitos tratados o no tratados con CB-SC-Exo, revelando las expresiones de marcadores asociados a M2, incluidos CD163, CD206, CD209, se incrementaron notablemente entre el grupo tratado con exosomas(Figura 3B,histograma rojo). En comparación con los macrófagos M2 convencionales generados por M-CSF + IL-4, los monocitos tratados con CB-SC-Exo expresaron niveles similares de marcadores asociados a M2 como CD163, CD206, CD209, sin diferencias significativas (Figura 3C). Por lo tanto, los datos indican que los monocitos se diferencian en macrófagos con fenotipo M2 después del tratamiento con exosomas derivados de CB-SC.
Figura 1: Caracterización de exosomas derivados de CB-SC. (A) Caracterización fenotípica de CB-SC, alta expresión de CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y Galectin-9, sin expresión de CD34. (B) Expresiones de marcadores asociados al exosoma (CD63, CD9, CD81) en exosomas derivados de CB-SC. Los IgG coincidentes con isotipos sirvieron como controles para la citometría de flujo (histograma gris). (C) Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de los exosomas derivados de CB-SC. (D) Distribución del tamaño de los exosomas derivados de CB-SC mediante dispersión de luz dinamita (DLS). Lasmanchas occidentales muestran que los exosomas derivados de CB-SC muestran el marcador específico de exosoma Alix, pero negativo para el marcador asociado a la retítula endoplasmática (ER) Calnexin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Interacción de exosomas derivados de CB-SC con diferentes poblaciones de PBMC. (A) La interacción de CB-SC-Exo (verde) con PBMC (azul, La tinción nuclear con Hoechst 33342) fue fotografiada con el microscopio Nikon Eclipse Ti2 con el software NIS-Elements versión 5.11.02, con un alto aumento que muestra la distribución de exosomas etiquetados con diodo (verde) en las células PBMC después de la incubación conjunta para 4 h 5% CO2 en la placa de 24 pocillos no tratada en cultivo de tejido. n 2. (B) Estrategia de ografía para el análisis de citometría de flujo con marcadores de superficie específicos de células para diferentes subpoblaciones en PBMC, incluyendo CD3 para células T, CD14 para monocitos, CD19 para células B, CD56 para células NK y CD11c para DC. (C) Mostrar diferente intensidad de fluorescencia mediana (MFI) de exosoma con etiqueta de dio entre diferentes subpoblaciones de PBMC (por ejemplo, células T, monocitos, células B, células NK, DC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos de exosomas derivados de CB-SC en monocitos. (A) Cambio morfológico de monocitos en las células similares al husillo después del tratamiento con exosomas derivados de CB-SC. (B) Up-regulated the level of M2-associate markers' expression after the treatment with CB-SC-derived exosomes, such as CD163, CD206, and CD209 (línea roja). Los monocitos no tratados (línea verde) sirvieron de control. Los IgG coincidentes con isotipos servían como controles negativos (línea gris). (C) Comparación fenotípica entre los macrófagos M2 convencionales y los macrófagos M2 inducidos por CB-SC-Exo. Para generar los macrófagos M2 convencionales, los monocitos purificados CD14+ fueron tratados con un factor estimulante de colonias de macrófagos de 50 ng/ml (M-CSF) a 37oC, 5% CO2 condiciones durante 7 días, y seguido por el tratamiento nocturno con 10 ng/mL IL-4. Marcadores asociados a M2, incluido CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209 se evaluaron mediante citometría de flujo. La inmunoglobulina glórica G (IgG) coincide con el isotipo sirve como control. Los datos se presentan como la media ± SD; N.o 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La aplicación de exosomas es un campo emergente para el diagnóstico clínico, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre la preparación de exosomas derivados de CB-SC y el estudio funcional de exosomas sobre la diferenciación de monocitos humanos. El protocolo actual demostró que los exosomas funcionales derivados de CB-SC están aislados por centrifugación secuencial y ultracentrifugación con alta pureza y que exhiben la modulación inmune en monocitos.
En comparación con otros protocolos convencionales, la ultrafiltración es un enfoque establecido para el aislamiento y purificación de exosomas de diferentes células o medios, basado en el peso molecular y los tamaños de exclusión que son diferentes de otras vesículas extracelulares (EV). Mientras que el aislamiento de ultrafiltración ahorra más tiempo que la separación basada en ultracentrifugación, puede causar daños estructurales a las vesículas en tamaños grandes. Los exosomas también se pueden recoger mediante precipitaciones mediadas por polietilenglicol (PEG) a bajo costo, aunque este método pone en riesgo la pureza del exosoma debido a las contaminaciones proteicas13,14. Por lo tanto, el protocolo actual era rentable para producir exosomas de alta pureza. Sobre la base de las modulaciones inmunitarias de exosomas derivados de CB-SC10,la caracterización de los exosomas derivados de CB-SC puede ofrecer un valioso biomarcador para evaluar la potencia del educador de células madre con CB-SC antes de las aplicaciones clínicas.
Los macrófagos son células profesionales que presentan antígenos contra infecciones virales y bacterianas, con funciones biológicas y heterogeneidades variadas. En función de sus diferencias en los marcadores de superficie y la función inmune, los macrófagos se clasifican con dos subdesarcales: macrófagos tipo 1 (M1, macrófagos convencionales que causan inflamación) y macrófagos de tipo 2 (M2, que muestran antiinflamación)15. Este estudio estableció que los monocitos humanos purificados se diferenciaron en macrófagos tipo 2 después del tratamiento con exosomas derivados de CB-SC, mostrando un fenotipo antiinflamación10. Los monocitos tratados con exosomas derivados de CB-SC exhibieron la morfología alargada y expresaron los marcadores superficiales asociados a M2 (por ejemplo, CD163, CD206 y CD209), con el fenotipo similar al de los macrófagos M2 convencionales generados utilizando citoquinas M-CSF + IL-4. Estos cambios fenotípicos de los monocitos ponen de relieve el nuevo mecanismo subyacente a la modulación inmune de CB-SC para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes. Durante el tratamiento con SCE, las células inmunitarias de los pacientes fueron co-cultivadas con CB-SC durante alrededor de 8 años u20129 h. Los monocitos tratados con SCE llevaron los exosomas derivados de CB-SC de vuelta al cuerpo, lo que contribuyó a la diferenciación M2 y la expansión de la inducción de la tolerancia inmunitaria, lo que llevó a la mejora de los resultados clínicos después del tratamiento con la terapia SCE.
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Disclosures
El Dr. Zhao es uno de los fundadores de Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr. Zhao es un inventor de la tecnología Stem Cell Educator. Todos los demás autores no tienen intereses financieros que puedan ser relevantes para la obra presentada.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Poddar y al Sr. Ludwig por el generoso apoyo de fondos a través de la Fundación Hackensack UMC. Agradecemos a Laura Zhao por la edición en inglés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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