Summary
Здесь представлен протокол для доставки олигонуклеотидов, таких как малоинтерферная РНК (siRNA), микро-РНК-мимики (miRs) или анти-микро-РНК (anti-miR) в зрелые адипоциты для модуляции экспрессии белка и микро-РНК.
Abstract
Изменение функции адипоцитов способствует патогенезу метаболических заболеваний, включая диабет 2 типа и резистентность к инсулину. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Модуляция экспрессии белков и микро-РНК в адипоцитах остается очень сложной задачей. В данной работе описан протокол дифференцировки мышиных фибробластов в зрелые адипоциты и модуляции экспрессии белков и микро-РНК в зрелых адипоцитах посредством обратной трансфекции с использованием малоинтерферирующих РНК (siRNA) и микро-РНК, имитирующих (miR-mimic) олигонуклеотидов. Этот протокол обратной трансфекции включает инкубацию трансфекционного реагента и олигонуклеотидов с образованием комплекса в пластине клеточной культуры, к которой добавляются зрелые адипоциты. Затем адипоцитам дают повторно прикрепиться к поверхности адгезивной пластины в присутствии комплекса олигонуклеотидов/трансфекционных реагентов. Функциональные анализы, такие как изучение передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза, могут быть выполнены на трансфектированных зрелых адипоцитах 3T3-L1 для изучения влияния манипуляций с белком или микро-РНК на функцию адипоцитов.
Introduction
Ожирение считается основным фактором риска для многочисленных метаболических заболеваний, включая резистентность к инсулину (IR), диабет 2 типа (T2D) и сердечно-сосудистые заболевания1. Современные методы лечения не смогли остановить постоянно растущую распространенность этих заболеваний, и управление ИК пациентов с ожирением и диабетом остается важной клинической проблемой. Жировая ткань играет важнейшую роль в контроле энергетического гомеостаза, а ее патологическое расширение при ожирении способствует развитию ИК иСД22,3. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Многие исследования изучали роль кодирующих белок РНК в физиологии адипоцитов и их связь с ожирением.
Совсем недавно открытие некодирующих РНК (ncRNAs), особенно микро-РНК (miRs), создало новые концепции, связанные с механизмом регуляции программ экспрессии генов. Исследования показали, что нРНК являются важными регуляторами функции адипоцитов, и что их дисрегуляция играет важную роль при метаболических заболеваниях4. Таким образом, манипуляции с белками и ncРНК в адипоцитах имеют решающее значение для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их влияния на такие патологии, как СД2. Тем не менее, манипулирование экспрессией белков и ncRNAs in vivo, а также в первичных адипоцитах остается очень сложным, что способствует использованию моделей адипоцитов in vitro.
Мышиные фибробласты 3T3-L1 легко дифференцируются в зрелые, функциональные и инсулин-чувствительные адипоциты, которые представляют собой хорошо охарактеризованные клеточные линии, используемые для изучения функции адипоцитов (например, передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липолиза и секреции адипокинов)5,6,7,8,9,10. Эти свойства делают адипоциты 3T3-L1 привлекательной моделью для модуляции экспрессии кодирующих белок и nc-РНК для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их потенциальной роли в заболеваниях, связанных с ожирением. К сожалению, в то время как фибробласты 3T3-L1 легко трансфектируются с использованием коммерчески доступных реагентов, дифференцированные адипоциты 3T3-L1 являются одной из самых сложных клеточных линий для трансфектации. Вот почему многочисленные исследования, манипулируя экспрессией генов в клетках 3T3-L1, были сосредоточены на дифференцировке адипоцитов, а не на функции адипоцитов.
Долгое время единственным эффективным методом трансфектации адипоцитов была электропорация5,которая утомительна, дорога и может вызвать повреждение клеток. В этой статье сообщается о методе обратной трансфекции с использованием общего трансфекционного реагента, который сокращает практическое время для трансфекции, не влияет на жизнеспособность клеток и намного дешевле, чем электропорация. Этот протокол идеально подходит для трансфекции siRNA и других олигонуклеотидов, таких как микро-РНК-мимики (miR-мимики) и антимир-мимики. Принцип протокола обратной трансфекции заключается в инкубации трансфекционного реагента и олигонуклеотидов для образования комплекса в пластине клеточной культуры, а затем посева зрелых адипоцитов в колодцы. Затем адипоциты повторно прикрепляются к поверхности адгезивной пластинки в присутствии комплекса реагентов олигонуклеотидов/трансфекции. Эта простая, эффективная и недорогая методология позволяет изучать роль кодирующих белок РНК и миР в функции адипоцитов и их потенциальную роль в заболеваниях, связанных с ожирением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные методы для выполнения всех этапов протокола в ламинарной проточной культуре клеток. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах и оборудовании.
1. Дифференцировка фибробластов мысиной 3T3-L1 в адипоциты
- Выращивают фибробласты 3T3-L1 в посуде по 100 мм в культуральном среде-ДМЭМ без пирувата, глюкозы 25 мМ, 10% сыворотки новорожденных телят и 1% пенициллина и стрептомицина(рисунок 1А). Поместите посуду в инкубатор для культивации тканей (7% CO2 и 37 °C).
- Через два дня после слияния изменяют культуральную среду, заменяя ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% сыворотки для телят плода (FCS) и 1% пенициллина и стрептомицина, дополненных 0,25 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), 0,25 мкМ дексаметазона, 5 мкг / мл инсулина и 10 мкМ росиглитазона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения слияния требуется 5 дней, когда клетки засеиваются по 300 000 клеток на чашку размером 100 мм. - Через два дня замените культуральный среду ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина с добавлением инсулина 5 мкг/мл и 10 мкМ росиглитазона и инкубата в течение 2 дней. Затем кормите клетки каждые 2 дня ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина(Рисунок 1B).
- Трансфектируют адипоциты 3T3-L1 через 7-8 дней после начала протокола дифференцировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно достичь высокого уровня дифференцировки (>80%) до трансфекции, чтобы избежать пролиферации оставшихся фибробластов после трансфекции, что приведет к смешанной популяции клеток, которые могут сузить результаты.
2. Подготовка плит с предварительным покрытием
- За сутки до или за несколько часов до трансфекции готовят раствор коллагена I типа по 100 мкг/мл в 30% этаноле из запасного раствора по 1 мг/мл. Добавьте 250 мкл коллагена на скважину 12-скважинной пластины и 125 мкл на скважину 24-скважинной пластины и распределите раствор по поверхности скважины.
- Оставьте тарелку без крышки под культуральным капюшоном до тех пор, пока коллаген не высохнет. Дважды промыть фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (D-PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты с покрытием доступны для покупки.
3. Приготовление трансфекционной смеси
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация siRNA составляет от 1 до 100 нМ (от 1 до 100 пмоль siRNA на скважину 12-скважинной пластины). Конечная концентрация miR-мимики составляет 10 нМ (10 пмоль/колодец). Определите наилучшую концентрацию каждой siRNA, miR-мимики или другого олигонуклеотида до начала эксперимента, чтобы избежать нецелевых эффектов. Проводите трансфекционные эксперименты в трех количествах, чтобы облегчить статистический анализ результатов. Подготовьте все реагенты в избытке, чтобы учесть нормальные потери во время пипетки.
- Смешайте путем пипетирования (объем/объем) siRNA (или других олигонуклеотидов) с улучшенной минимальной существенной средой(таблица 1). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте трансфекционный реагент и улучшенную минимальную необходимую среду к siRNA и пипетку для смешивания(таблица 1). Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (в течение этого времени переходить к разделу 4). Добавьте трансфекционную смесь в каждый кладезы коллагеновой пластины.
4. Получение адипоцитов 3T3-L1
- Дважды вымойте ячейки в 100-миллиметровой чашке Петри с помощью D-PBS. Добавьте в ячейки 5 трипсина (1 мл на 100 мм тарелки), обязательно покрывая трипсином всю поверхность. Подождите 30 с и аккуратно удалите трипсин.
- Высиживать чашку Петри в течение 5-10 мин при 37 °C в инкубаторе. Коснитесь тарелки 100 мм, чтобы отсоедать ячейки.
- Добавьте 10 мл DMEM без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина для нейтрализации трипсина. Осторожно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы отсоедать клетки и гомогенизировать клеточную суспензию.
- Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Malassez или автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 6,25х 10 5 клеток / мл среды. Посев 800 мкл клеточной суспензии/скважины 12-скважинной пластины (5 х 105 ячеек) или 400 мкл клеточной суспензии/скважины 24-скважинной пластины (2,5 х 105 клеток), содержащей трансфекционную смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна 100-миллиметровая чашка Петри адипоцитов позволит подготовить одну 12-скважинную пластину или одну 24-скважинную пластину. Тарелка толщиной 100 мм обычно содержит 6-7 х 106 адипоцитов, что соответствует 5 х 105 адипоцитов на колодец 12-колодезной пластины. - Инкубируют пластины в инкубаторе клеточной культуры (7% CO2 и 37 °C) и не нарушают работу клеток в течение 24 ч. На следующий день осторожно замените супернатант свежим ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно засеять клетки в коллагеновые предварительно покрытые 48- и 96-колодезными пластинами, но принять больше мер предосторожности при замене среды, чтобы избежать отслоения адипоцитов.
5. Функциональный анализ трансфектированных адипоцитов 3T3-L1
- Исследование целевого нокдауна через 24-48 ч и 48-96 ч после симумической доставки siRNA или miR для мРНК и белка соответственно.
- Выполняйте функциональный анализ трансфефицированных адипоцитов для изучения передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, секреции адипокина, липолиза и липогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанную здесь процедуру обратной трансфекции для модуляции экспрессии белков или микро-РНК в адипоцитах 3T3-L1, было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции(рисунок 1B,C). Действительно, через 2 дня после трансфекции адипоциты были хорошо распределены и прикреплены к пластинке и представляли собой многолокулярные липидные капли, характерные для зрелых адипоцитов 3T3-L1. Содержание липидов не отличалось между трансфефедными и неперепраженными адипоцитами(Рисунок 1D,E). Кроме того, экспрессия мРНК маркеров дифференцировки, таких как пероксисомный пролифератор-активированный рецептор гамма2 (Pparγ2),адипонектин (Adipoq),транспортер глюкозы 4 или растворенный носитель семейства 2 член 4(Slc2a4),субстрат рецептора инсулина 1(Irs1),перилипин-1(Plin1),не изменился в трансфектированных клетках по сравнению с таковой в нетрансфектированных адипоцитах(рисунок 1F). Этот протокол обратной трансфекции эффективен, так как >70% адипоцитов были трансфектражировались(рисунок 1G,H).
Перилипин-1 является адипоцит-специфическим белком, который, как известно, способствует образованию липидных капель и ингибирует липолиз. Здесь адипоциты 3T3-L1 трансфектировали скремблированной siRNA (si-SCR) или siRNA против Plin1 (si-PLIN1). Через три дня после трансфекции si-PLIN1 уровень мРНК Plin1 снизился на 70%(Рисунок 2A),а уровень белка на 63%(Рисунок 2B,C). Экспрессия PLIN1 также была проанализирована с помощью флуоресцентной микроскопии через 4 дня после трансфекции и было обнаружено, что она снизилась на 92% по сравнению с ее экспрессией в контрольных адипоцитах(рисунок 2D-F),тем самым демонстрируя эффективность как протокола трансфекции, так и si-PLIN1.
Этот протокол также использовался для выполнения обратной трансфекции адипоцитов с микро-РНК-имитированием (miR-мимика) олигонуклеотидов для повысивания экспрессии miR-34a(рисунок 3A). Сверхэкспрессия miR-34a приводила к снижению экспрессии белка VAMP2 на 50%(Рисунок 3B,C),подтвержденной мишени miR-34a11,12. Наконец, это исследование показывает, что обратная трансфекция адипоцитов 3T3-L1 сохраняет их функцию и реакцию на стимуляцию инсулина. Действительно, нокдаун Plin1 в адипоцитах 3T3-L1 привел к увеличению базального липолиза(рисунок 4A). Более того, сверхэкспрессия miR-34a в адипоцитах 3T3-L1 привела к ингибированию инсулин-индуцированного фосфорилирования протеинкиназы B(Рисунок 4B,C)и поглощения глюкозы(Рисунок 4D).
Рисунок 1: Дифференцировка фибробластов 3T3-L1 в зрелые адипоциты. (A)Фибробласты 3T3-L1 высеивали при плотности 3 х 105 клеток на 100 мм чашки. Репрезентативное 10-кратное изображение фибробластов 3T3-L1 через 2 дня. Черездва дня после слияния (день 0) фибробласты 3T3-L1 дифференцировали в адипоциты с использованием коктейльной смеси дифференцировки в течение 4 дней (до 4-го дня). Репрезентативное 10-кратное изображение фибробластов 3T3-L1, дифференцированных в адипоциты (день 7). Адипоциты с многочелюстными липидными каплями легко различимы. (C) Адипоциты 3T3-L1 были трансфектражировались si-SCR на 7-й день. Репрезентативные 10-кратные изображения трансфектированных адипоцитов 3T3-L1 (день 9). Морфология трансфектированных адипоцитов сопоставима с морфологией непереферированных адипоцитов, подразумевая, что метод трансфекции является щадящим и не токсичным для адипоцитов. Шкала стержней: 50 мкм.(D–E)Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали si-SCR на 7-й день (верхние панели); неперенофециты адипоцитов (нижние панели). Два дня спустя клетки были инкубированы с Oil Red O для окрашивания липидов. (D)Показаны репрезентативные изображения окрашенных клеток на пластине и репрезентативные 10-кратные изображения яркого поля. Шкала: 50 мкм.(E)Масло Red O, включенное в клетки, элюировалось 2-пропанолом и количественно оценивалось с помощью спектрофотометра. Данные выражаются в произвольных единицах, при этом абсорбционные неперераженные клетки нормализуются до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводился с помощью t-тестаСтудента. (F)Адипоциты 3T3-L1 были трансфектированные si-SCR. Через три дня после трансфекции клетки были собраны для выделения общей РНК. Экспрессию маркеров дифференцировки адипоцитов измеряли с помощью qRT-PCR и нормализовали с использованием уровней РНК 36B4. Данные представляют экспрессию мРНК в трансфекционных клетках относительно экспрессии в непереражённых клетках (нормализованных до 1, представленных пунктирной линией) и экспрессируются как среднее + SEM трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводился с помощью t-тестаСтудента. (G–H) Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали si-SCR или флуоресцентным красителем (FAM), меченым si-RNA, и покрывали на покровных листах. Адипоциты 3T3-L1 анализировали через 8 ч с помощью флуоресцентной микроскопии. (G) Показано репрезентативное одноплоскостное изображение трансфектированных клеток 3T3-L1. (H) Количественная оценка FAM-положительных клеток относительно общего числа клеток. Данные выражаются в процентах клеток, содержащих флуоресцентную си-РНК. Статистический анализ проводили с помощью теста Манна-Уитни, ****p < 0,0001. Сокращения: si-SCR = скремблированная siRNA; SEM = стандартная погрешность среднего значения; qRT-PCR = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; FAM = флуоресцеин амидит; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; si-FAM = FAM-меченая si-РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Глушение белка в адипоцитах 3T3-L1. Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали скремблированной si-РНК (si-SCR) или si-РНК против Plin1 (si-PLIN1). Черезтри дня после трансфекции экспрессия мРНК Plin1 измерялась с помощью qRT-PCR. Экспрессию мРНК нормализовали с использованием уровней РНК 36B4 и экспрессировали в произвольных единицах, при этом клетки, обработанные si-SCR, нормализовались до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM четырех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием t-тестаСтьюденса, **p < 0,01. (B–C) Через три дня после трансфекции белковые лизаты подвергали вестерн-блоттингу антителами, направленными против PLIN1 и HSP90 (контроль нагрузки). Показаны репрезентативные иммуноблоты. (C) Количество PLIN1 было количественно определено с помощью денситометрического сканирования и нормализовано с использованием количества HSP90. Данные экспрессируются в произвольных единицах, при этом клетки, обработанные si-SCR, нормализуются до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM четырех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием t-тестаСтьюденса, *p < 0,05. (D–F) Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали si-SCR или si-PLIN1 и покрывали на покровах. Экспрессия PLIN1 была проанализирована через 96 ч с помощью флуоресцентной микроскопии. (D)Показаны репрезентативные одноплоскостные изображения адипоцитов 3T3-L1, окрашенных антиперилипиновым антителом и анти-rabbit-Alexa647-конъюгированным антителом. Шкала стержней = 10 мкм.(E)Трехмерная (3D) объемная визуализация 3T3-L1 адипоцитов, сегментированных в 3D с использованием коммерческого программного обеспечения. Шкала баров = 10 мкм. (F) Количественная оценка интенсивности сигнала PLIN1 относительно общего числа ячеек. Данные экспрессируются в произвольных единицах, при этом клетки, обработанные si-SCR, нормализуются до 100%. Статистический анализ проводили с помощью теста Манна-Уитни, ****p < 0,0001. Сокращения: si-SCR = скремблированная siRNA; si-PLIN1 = siRNA против Plin1; Plin1 = перилипин-1; HSP90 = белок теплового шока 90; SEM = стандартная погрешность среднего значения; qRT-PCR = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; FAM = флуоресцеин амидит; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; IB = иммуноблоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: сверхэкспрессия микро-РНК в 3T3-L1 адипоцитах. Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали контрольной микро-мимикой РНК (miR-контроль) или микро-РНК 34a мимикой (miR-34a). Через три дня после трансфекции клетки собирали для экстракции(А)РНК или(В)получения белковых лизатов. (A) Экспрессия miR-34a измерялась с помощью qRT-PCR. Экспрессию miR нормализовали с использованием малых уровней РНК U6 и экспрессировали в произвольных единицах, при этом клетки, обработанные miR-контролем, нормализовались до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием t-тестаСтьюденса, *p < 0,05. (B)Белковые лизаты подвергали вестерн-блоттингу антителами, направленными против VAMP2 и TUBULIN (контроль нагрузки). Показаны репрезентативные иммуноблоты трех независимых экспериментов. (C) Количество VAMP2 было количественно определено с помощью денситометрического сканирующего анализа и нормализовано с использованием количества ТУБУЛИНА. Данные выражаются в произвольных единицах, при этом miR-контрольные ячейки нормализуются до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводился с помощью t-тестаСтудента, *p < 0,05. Сокращения: SEM = стандартная погрешность среднего значения; qRT-PCR = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; VAMP2 = везикулоаци ассоциированный мембранный белок 2; IB = иммуноблоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние модуляции белка или микро-РНК на функцию 3T3-L1 адипоцитов. (A)адипоциты 3T3-L1 трансфектировали si-SCR или si-PLIN1. Среду изменяли через 24 ч после трансфекции, а затем собирали через 48 ч для измерения базального липолиза. Результаты выражаются в виде глицерина, высвобождаемого в среде (мкг/мл), и как среднее значение + SEM четырех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием t-тестаСтьюденса, ***p < 0,001. (B)Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали miR-контролем или miR-34a. Среду изменяли через 24 ч после трансфекции, а затем, через 48 ч, среду меняли на обедненную среду (ДМЭМ без пирувата, глюкозы 25 мМ, 1% пенициллина и стрептомицина и 0,5% BSA) в течение 6 ч. Затем клетки обрабатывали инсулином 0,5 нМ в течение 5 мин. Клетки были собраны для приготовления белковых лизатов для западного блоттинга с антителами, направленными против фосфо-ПКБ и ПКБ (контроль нагрузки). Показаны репрезентативные иммуноблоты трех независимых экспериментов. (C) Количество фосфо-ПКБ было количественно определено с помощью денситометрического сканирующего анализа и нормализовано с использованием общего количества ПКБ. Данные экспрессируются в произвольных единицах, при этом miR-контрольные клетки, обработанные инсулином, нормализуются до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего теста ANOVA, *p < 0,05 по сравнению с miR-контрольными клетками, обработанными инсулином. (D)Адипоциты 3T3-L1 трансфектировали miR-контролем или miR-34a. Среду меняли через 24 ч после трансфекции, а затем, через 48 ч, среду меняли на среду истощения в течение 6 ч. Затем клетки обрабатывали инсулином 0,5 нМ в течение 20 мин. Поглощение(2-3H)дезоксиглюкозы измеряли в течение 3 мин. Данные экспрессируются в произвольных единицах, при этом поглощение базальной глюкозы в клетках, обработанных miR-контролем, нормализуется до 1. Результаты выражаются как среднее + SEM трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего теста ANOVA, *p < 0,05 по сравнению с miR-контрольными клетками, обработанными инсулином. Сокращения: si-SCR = скремблированная siRNA; si-PLIN1 = siRNA против Plin1; SEM = стандартная погрешность среднего значения; ПКБ = протеинкиназа В; p-PKB = люминофор-PKB; miR-CTL = miR-контроль; DMEM = модифицированная среда Орла Дульбекко; BSA = бычёвый сывороточный альбумин; ANOVA = дисперсионный анализ; IB = иммуноблоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| На скважину (плита из 12 скважин) | На скважину (плита из 24 скважин) | |
| Олигонуклетиды | 20 мкл | 10 мкл |
| (si-РНК, miR...) | ||
| Улучшенный минимальный основной носитель | 20 мкл | 10 мкл |
| Трансфекционный реагент | 5.6 мкл | 2.8 мкл |
| Улучшенный минимальный основной носитель | 154.4 мкл | 77.2 мкл |
| Общий объем трансфекционной смеси | 200 мкл | 100 мкл |
Таблица 1: Трансфекционные реагенты, необходимые для 12-скважинных и 24-скважинных пластинчатых форматов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе представлен подробный протокол дифференцировки и трансфекции зрелых адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, siRNAs, микро-РНК-мимика и анти-микро-РНК в 3T3-L1 адипоциты, что является одной из самых сложных клеточных линий для трансфекции. Этот метод имеет некоторые ограничения, которые необходимо учитывать. Этот протокол не эффективен для трансфекции плазмидной ДНК, что ограничивает полезность этого метода для исследований усиления функции. Хотя мышиные клеточные линии, включая клеточную линию 3T3-L1, обычно используются для изучения функции адипоцитов in vitro, паттерны экспрессии микро-РНК и активность в мышиной ткани часто отличаются от тех, которые наблюдаются у людей; это также относится к первичным клеткам и клеточным линиям. Более того, среда, используемая для дифференцировки фибробластов 3T3-L1 в адипоциты, требует нефизиологического гормонального коктейля (инсулин, дексаметазон, IBMX и росиглитазон), а дифференцированные клетки морфологически отличаются от зрелых адипоцитов in vivo: они представляют собой мультилокулярные липидные капли вместо унилокулярной липидной капли. Это может объяснить некоторые различия в экспрессии генов и клеточных реакциях между исследованиями in vitro и in vivo.
Одним из преимуществ использования этого протокола обратной трансфекции по сравнению с электропорацией является то, что этот метод дешевле. Действительно, реагенты дешевле, а высокая эффективность обратной трансфекции уменьшает количество необходимых олигонуклеотидов, и нет необходимости в дорогостоящем оборудовании, таком как электропоратор. Кроме того, использование более низкой концентрации siRNA полезно, поскольку оно позволяет избежать нецелевого воздействия. Кроме того, эта обратная трансфекция является простым, быстрым, мягким и простым методом трансфекции, который требует меньшего количества клеток и обеспечит отличную жизнеспособность клеток и более надежные данные по сравнению с электропорацией. Хотя процедура, описанная выше, была оптимизирована для дифференцировки и обратной трансфекции клеток мыши 3T3-L1, преадипоциты человека также могут быть дифференцированы в адипоциты5 и легко подвергнуты обратной трансфекции с использованием этого протокола. Этот отчет показывает, что адипоциты остаются жизнеспособными, здоровыми и чувствительными к инсулину после обратной трансфекции с использованием нового поколения нелипосомального катионного трансфектного реагента. Обратная трансфекция также может быть выполнена с использованием других популярных трансфекционных реагентов. Однако количество олигонуклеотидов и трансфекционного реагента необходимо оптимизировать, чтобы обеспечить хорошую модуляцию экспрессии и отсутствие неблагоприятного воздействия на жизнеспособность клеток.
Этот протокол облегчает изучение роли белков и микро-РНК в функции адипоцитов, но он также может быть использован для модуляции других некодирующих РНК, таких как lnc-РНК, Y-РНК или эРНК. В протоколе есть критические шаги, которые могут повлиять на эффективность процедуры. Дифференцировка фибробластов 3T3-L1 в адипоциты должна тщательно контролироваться. Важно достичь высокого уровня дифференцировки, чтобы избежать пролиферации оставшихся фибробластов после трансфекции, что привело бы к смещению результатов эксперимента. Другим важным моментом является выполнение трансфекции на вновь дифференцированных зрелых адипоцитах; оптимальные сроки – 7-8 дней после начала протокола дифференцировки, что соответствует 3-4 дням после снятия дифференцировки коктейля. Это обеспечит надежную эффективность трансфекции и будет способствовать хорошему повторному присоединению адипоцитов к пластине. Наконец, лечение адипоцитов трипсином должно тщательно контролироваться, чтобы обеспечить отслоение адипоцитов без повреждения клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана INSERM, Университетом Лазурного берегу и Французским национальным исследовательским агентством (ANR) в рамках программы «Инвестиции для будущей Лаборатории передового опыта» (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) и «Инициатива передового опыта» (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. поддерживается грантами От Французского сообщества диаспоры (SFD), Французской ассоциации исследований и исследований в области обезите (AFERO), Института технологий мультигезитов в санте (ITMO) и Фонда Бенджамина-Делессерта. J.G. поддерживается ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. поддерживается грантом ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 и грантом Фонда по области ремерче-едикаля (Equipe FRM, DEQ20180839587). Мы также благодарим Центр визуализации C3M, финансируемый Департаментом Приморских Альп и Région PACA, который также поддерживается платформой микроскопии и визуализации GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
