Summary
Presentert her er en protokoll for å levere oligonukleotider som små forstyrrende RNA (siRNA), mikro-RNA-etterligninger (miRs) eller antimikro-RNA (anti-miR) i modne adipocytter for å modulere protein og mikro-RNA-uttrykk.
Abstract
Endring av adipocyttfunksjon bidrar til patogenese av metabolske sykdommer, inkludert type 2 diabetes og insulinresistens. Dette understreker behovet for å bedre forstå den molekylære mekanismen som er involvert i adipocyt dysfunksjon for å utvikle nye terapier mot fedmerelaterte sykdommer. Modulering av uttrykket av proteiner og mikro-RNAer i adipocytter er fortsatt svært utfordrende. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å differensiere murinfibroblaster i modne adipocytter og for å modulere uttrykket av proteiner og mikro-RNAer i modne adipocytter gjennom omvendt transfeksjon ved hjelp av små forstyrrende RNA (siRNA) og mikro-RNA-etterligning (miR-etterligning) oligonukleotider. Denne omvendte transfeksjonsprotokollen innebærer inkubasjon av transfeksjonsreagenset og oligonukleotidene for å danne et kompleks i cellekulturplaten som de modne adipocyttene legges til. Adipocyttene får da lov til å feste seg til den festende plateoverflaten i nærvær av oligonukleotider / transfeksjonsreagenskomplekset. Funksjonelle analyser som studiet av insulinsignalering, glukoseopptak, lipogenese og lipolyse kan utføres på de transfiserte 3T3-L1 modne adipocyttene for å studere virkningen av protein- eller mikro-RNA-manipulasjon på adipocyttfunksjon.
Introduction
Fedme regnes som en viktig risikofaktor for mange metabolske sykdommer, inkludert insulinresistens (IR), type 2 diabetes (T2D) og kardiovaskulære sykdommer1. Nåværende terapier har ikke klart å stoppe den stadig økende forekomsten av disse sykdommene, og håndteringen av IR av overvektige og diabetikere er fortsatt et viktig klinisk problem. Fettvev spiller en avgjørende rolle i kontrollen av energi homeostase, og den patologiske ekspansjonen under fedme bidrar til utviklingen av IR og T2D2,3. Dette understreker behovet for å bedre forstå den molekylære mekanismen som er involvert i adipocyt dysfunksjon for å utvikle nye terapier mot fedmerelaterte sykdommer. Mange forskningsstudier har undersøkt rollen som proteinkoding RNAer i adipocytt fysiologi og deres tilknytning til fedme.
Mer nylig har oppdagelsen av ikke-kodende RNAer (ncRNAer), spesielt mikro-RNAer (miRs), smidd nye konsepter knyttet til mekanismen for regulering av genuttrykksprogrammer. Studier har vist at ncRNAer er viktige regulatorer for adipocyttfunksjon, og at deres dysregulering spiller en viktig rolle i metabolske sykdommer4. Dermed er manipulering av proteiner og ncRNAer i adipocytter avgjørende for å dechiffrere sine roller i adipocyttfunksjon og deres innvirkning på patologier som T2D. Imidlertid er manipulering av uttrykket av proteiner og ncRNAer in vivo så vel som i primære adipocytter fortsatt svært utfordrende, og favoriserer bruken av in vitro-adipocyttmodeller.
Murine 3T3-L1 fibroblaster skiller seg lett ut i modne, funksjonelle og insulinresponsive adipocytter, som er en godt karakterisert cellelinje som brukes til å studere adipocyttfunksjon (f.eks. insulinsignalering, glukoseopptak, lipolyse og adipokines sekresjon)5,6,7,8,9,10. Disse egenskapene gjør 3T3-L1 adipocytter til en attraktiv modell for å modulere uttrykket av proteinkoding og nc-RNAer for å dechiffrere sin rolle i adipocyttfunksjon og deres potensielle rolle i fedmerelaterte sykdommer. Dessverre, mens 3T3-L1 fibroblaster er enkle å transfektere ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser, er differensierte 3T3-L1-adipocytter en av de vanskeligste cellelinjene å transfektere. Dette er grunnen til at mange studier som manipulerer genuttrykk i 3T3-L1 celler har fokusert på adipocyttdifferensiering i stedet for på adipocyttfunksjon.
I lang tid var den eneste effektive teknikken for å transfektere adipocytter elektroporasjon5, noe som er kjedelig, dyrt og kan forårsake celleskade. Dette papiret rapporterer en omvendt transfeksjonsteknikk ved hjelp av et vanlig transfeksjonsreagens, som reduserer praktisk tid for transfeksjon, har ingen effekt på celle levedyktighet, og er mye billigere enn elektroporasjon. Denne protokollen er perfekt egnet for transfeksjon av siRNA og andre oligonukleotider som mikro-RNA-etterligninger (miR-etterligninger) og anti-miRs. Prinsippet for omvendt transfeksjonsprotokoll er å inkubere transfeksjonsreagenset og oligonukleotidene for å danne et kompleks i cellekulturplaten og deretter frø de modne adipocyttene inn i brønnene. Deretter festes adipocyttene til den festende plateoverflaten i nærvær av oligonukleotider / transfeksjonsreagenskomplekset. Denne enkle, effektive og rimelige metodikken tillater studiet av rollen som proteinkoding RNAer og miRs i adipocyttfunksjon og deres potensielle rolle i fedmerelaterte sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Bruk sterile teknikker for å utføre alle trinnene i protokollen i en laminær strømningscellekulturhette. Se Materialliste for detaljer om alle reagenser og utstyr.
1. Differensiering av murin 3T3-L1 fibroblaster i adipocytter
- Voks 3T3-L1 fibroblaster i 100 mm retter i kulturmedie-DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% nyfødt kalveserum og 1% penicillin og streptomycin (Figur 1A). Plasser rettene i en vevskulturinkubator (7% CO2 og 37 °C).
- To dager etter samløp, endre kulturmediet, erstatte med DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% fosterkalvserum (FCS) og 1% penicillin og streptomycin supplert med 0,25 mM 3-Isobutyl-1-metylxantin (IBMX), 0,25 μM deksametason, 5 μg/ml insulin og 10 μM roslitison.
MERK: Det tar 5 dager å nå samløp når cellene er sådd ved 300.000 celler per 100 mm tallerken. - To dager senere, erstatt kulturmediet med DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin supplert med 5 μg / ml insulin og 10 μM rosiglitazon og inkubere i 2 dager. Fôr deretter cellene hver annen dag med DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin (Figur 1B).
- Transfekt 3T3-L1-adipocyttene 7-8 dager etter begynnelsen av differensieringsprotokollen.
MERK: Det er viktig å nå et høyt nivå av differensiering (>80%) før transfeksjonen for å unngå spredning av de resterende fibroblaster etter transfeksjonen, noe som vil føre til en blandet populasjon av celler som kan forvrenge resultatene.
2. Tilberedning av forhåndsbelagte plater
- På dagen før eller noen timer før transfeksjonen, lag en løsning av kollagen type I ved 100 μg / ml i 30% etanol fra en lagerløsning ved 1 mg / ml. Tilsett 250 μL kollagen per brønn av en 12-brønns plate og 125 μL per brønn av en 24-brønns plate, og spre løsningen over overflaten av brønnen.
- La platen stå uten lokket under kulturhetten til kollagenet tørker. Vask to ganger med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS).
MERK: Forhåndsbelagte plater kan kjøpes.
3. Forberedelse av transfeksjonsblandingen
MERK: Den endelige konsentrasjonen av siRNA er mellom 1 og 100 nM (1 til 100 pmol siRNA per brønn av en 12-brønns plate). Den endelige konsentrasjonen av miR-etterligningen er 10 nM (10 pmol/brønn). Bestem den beste konsentrasjonen av hver siRNA, miR-etterligning eller annet oligonukleotid før du starter eksperimentet for å unngå off-target effekter. Utfør transfeksjonseksperimenter i triplikat for å lette statistisk analyse av resultatene. Forbered alle reagenser i overkant for å ta høyde for normalt tap under pipettering.
- Bland ved pipettering (volum/volum) siRNA (eller andre oligonukleotider) med forbedret Minimalt viktig medium (Tabell 1). Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett transfeksjonsreagensen og det forbedrede Minimal Essential Medium i siRNA, og pipet som skal blandes (Tabell 1). Inkuber i 20 min ved romtemperatur (i løpet av denne tiden, fortsett til avsnitt 4). Tilsett transfeksjonsblandingen i hver brønn på den kollagenbelagte platen.
4. Forberedelse av 3T3-L1 adipocytter
- Vask cellene i 100 mm Petri-retten to ganger med D-PBS. Tilsett 5x trypsin i cellene (1 ml per 100 mm tallerken), sørg for å dekke hele overflaten med trypsin. Vent i 30 s og fjern forsiktig trypsin.
- Inkuber Petri-retten i 5-10 min ved 37 °C i inkubatoren. Trykk på 100 mm parabolen for å løsne cellene.
- Tilsett 10 ml DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin for å nøytralisere trypsin. Rør forsiktig mediet opp og ned for å løsne cellene og homogenisere celleopphenget.
- Tell cellene ved hjelp av et Malassez tellekammer eller en automatisert celleteller, og juster konsentrasjonen av cellene til 6,25 x 105 celler / ml medium. Frø 800 μL av celleopphenget/brønnen til en 12-brønnsplate (5 x 105 celler) eller 400 μl celleoppheng/brønn på en 24-brønnsplate (2,5 x 105 celler) som inneholder transfeksjonsblandingen.
MERK: En 100 mm Petri tallerken med adipocytter vil tillate tilberedning av en 12-brønns tallerken eller en 24-brønns plate. En 100 mm tallerken inneholder vanligvis 6-7 x 106 adipocytter, som tilsvarer 5 x 105 adipocytter per brønn av en 12-brønns plate. - Inkuber platene i en cellekulturinkubator (7% CO2 og 37 °C), og ikke forstyrr cellene i 24 timer. Neste dag erstatter du forsiktig supernatanten med fersk DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin.
MERK: Det er også mulig å frø cellene i kollagen-precoated 48- og 96-brønnsplater, men ta flere forholdsregler når du bytter ut mediet for å unngå løsrivelse av adipocyttene.
5. Funksjonell analyse av transfiserte 3T3-L1-adipocytter
- Studiemål knockdown 24-48 h og 48-96 h etter siRNA eller miR etterligner levering for henholdsvis mRNA og protein.
- Utføre funksjonelle analyser av transfiserte adipocytter for å studere insulinsignalering, glukoseopptak, adipokine sekresjon, lipolyse og lipogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren for omvendt transfeksjon beskrevet her for å modulere uttrykket av proteiner eller mikro-RNAer i 3T3-L1-adipocytter, har adipocyttene vist seg å bevare sin morfologi etter transfeksjonen (Figur 1B,C). Faktisk, 2 dager etter transfeksjonen, var adipocyttene godt spredt og festet til platen og presenterte flerlokære lipiddråper som er karakteristiske for modne 3T3-L1 adipocytter. Lipidinnholdet var ikke forskjellig mellom de transfiserte og ikke-transfiserte adipocyttene (Figur 1D,E). Videre kan mRNA-uttrykket for differensieringsmarkører som peroksensomproliferatoraktivert reseptor gamma 2 (Pparγ2), adiponektin (Adipoq), glukosetransportør 4 eller løsningsmiddelbærerfamilie 2 medlem 4 (Slc2a4), insulinreseptorsubstrat 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) var uendret i transfiserte celler sammenlignet med det i ikke-transfiserte adipocytter (figur 1F). Denne omvendte transfeksjonsprotokollen er effektiv ettersom >70 % av apokacyttene ble transfektet (Figur 1G,H).
Perilipin-1 er et adipocyttspesifikt protein kjent for å fremme lipiddråpedannelse og hemme lipolyse. Her ble 3T3-L1 adipocytter transfekert med kryptert siRNA (si-SCR) eller siRNA mot Plin1 (si-PLIN1). Tre dager etter transfeksjonen med si-PLIN1 hadde mRNA-nivået av Plin1 gått ned med 70 % (figur 2A) og proteinnivået med 63 % (figur 2B, C). PLIN1-uttrykket ble også analysert ved fluorescensmikroskopi 4 dager etter transfeksjonen og ble funnet å ha redusert med 92% sammenlignet med uttrykket i kontrollapokacytter (Figur 2D-F), og dermed demonstrert effekten av både transfeksjonsprotokollen og si-PLIN1.
Denne protokollen ble også brukt til å utføre omvendt transfeksjon av adipocytter med mikro-RNA-etterligning (miR-etterligninger) oligonukleotider for å oppregulere uttrykket av miR-34a (figur 3A). Overekspressionen av miR-34a førte til nedgangen i VAMP2 proteinuttrykk med 50% (Figur 3B,C), et bekreftet mål på miR-34a11,12. Til slutt viser denne studien at omvendt transfeksjon av 3T3-L1-adipocytter bevarer deres funksjon og respons på insulinstimulering. Faktisk førte nedslag av Plin1 i 3T3-L1-adipocytter til en økning i basal lipolyse (figur 4A). Videre førte overekspressjonen av miR-34a i 3T3-L1-adipocytter til hemming av insulinindusert proteinkinase B fosforylering (figur 4B,C) og glukoseopptak (figur 4D).
Figur 1: Differensiering av 3T3-L1 fibroblaster i modne adipocytter. (A) 3T3-L1 fibroblaster ble sådd med en tetthet på 3 x 105 celler per 100 mm tallerken. Representativt 10x brightfield bilde av 3T3-L1 fibroblasts 2 dager senere. (B) To dager etter samløpet (dag 0) ble 3T3-L1 fibroblaster differensiert til adipocytter ved hjelp av en differensieringscocktailblanding i 4 dager (til dag 4). Representativt 10x brightfield bilde av 3T3-L1 fibroblaster differensiert til adipocytter (dag 7). Adipocytter med flerokulære lipiddråper er lett merkbare. (C) 3T3-L1-adipocyttene ble transfektet med si-SCR på dag 7. Representative 10x brightfield bilder av transfected 3T3-L1 adipocytter (dag 9). Morfologien til de transfiserte adipocyttene er sammenlignbar med de ikke-transfiserte adipocyttene, noe som antyder at transfeksjonsmetoden er mild og ikke giftig for adipocyttene. Skalastenger: 50 μm. (D-E) 3T3-L1 adipocytter ble transfektert med si-SCR på dag 7 (øvre paneler); ikke-transfekerte adipocytter (nedre paneler). To dager senere ble cellene inkubert med Oljerød O for å flekke lipider. (D) Representative bilder av de fargede cellene i platen og representative 10x brightfield-bilder vises. Skalastenger: 50 μm. (E) Oljerød O innlemmet i cellene ble eluted med 2-propanol og kvantifisert ved hjelp av et spektrofotometer. Data uttrykkes i vilkårlige enheter, med absorbansen av de ikke-transfiserte cellene normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved students t-test. (F) 3T3-L1-adipocyttene ble transfektet med si-SCR. Tre dager etter transfeksjonen ble cellene høstet for å isolere total RNA. Uttrykket av adipocytdifferensieringsmarkører ble målt ved qRT-PCR og normalisert ved hjelp av 36B4 RNA-nivåer. Dataene representerer mRNA-uttrykket i transfiserte celler i forhold til det i ikke-transfiserte celler (normalisert til 1, representert av den stiplede linjen) og uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved students t-test. (G–H) 3T3-L1-adipocyttene ble transfektert med si-SCR eller fluorescerende fargestoff (FAM)-merket si-RNA og belagt på deksler. 3T3-L1 adipocytter ble analysert 8 timer senere ved fluorescensmikroskopi. (G) Representativt enkeltplanbilde av transfekterte 3T3-L1-celler vises. (H) Kvantifisering av FAM-positive celler i forhold til totalt antall celler. Data uttrykkes som prosentandel av celler som inneholder fluorescerende si-RNA. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Mann-Whitney test, ****p < 0,0001. Forkortelser: si-SCR = kryptert siRNA; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; qRT-PCR = kvantitativ polymerasekjedereaksjon med omvendt transkripsjon; FAM = fluorescein amidite; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; si-FAM = FAM-merket si-RNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Protein-silencing i 3T3-L1 adipocytter. 3T3-L1 adipocytter ble transfektert med kryptert si-RNA (si-SCR) eller si-RNA mot Plin1 (si-PLIN1). (A) Tre dager etter transfeksjonen ble mRNA-uttrykket til Plin1 målt ved qRT-PCR. mRNA-uttrykket ble normalisert ved hjelp av 36B4 RNA-nivåer og uttrykt i vilkårlige enheter, med si-SCR-behandlede celler normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for fire uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student t-test, **p < 0,01. (B–C) Tre dager etter transfeksjonen ble proteinlysater utsatt for vestlig blotting med antistoffer rettet mot PLIN1 og HSP90 (lastekontroll). Representative immunobloter vises. (C) Mengden PLIN1 ble kvantifisert ved densitometriskanningsanalyse og normalisert ved hjelp av mengden HSP90. Data uttrykkes i vilkårlige enheter, med si-SCR-behandlede celler normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for fire uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student t-test, *p < 0,05. (D–F) 3T3-L1-adipocyttene ble transfektert med si-SCR eller si-PLIN1 og belagt på deksler. Uttrykket av PLIN1 ble analysert 96 timer senere ved fluorescensmikroskopi. (D) Representative enkeltplanbilder av 3T3-L1-adipocytter farget med anti-perilipin antistoff og et anti-kanin-Alexa647-konjugert antistoff vises. Skalastolper = 10 μm. (E) Tredimensjonal (3D) volumgjengivelse av 3T3-L1-adipocytter segmentert i 3D ved hjelp av kommersiell programvare. Skalastenger = 10 μm. (F) Kvantifiseringen av PLIN1-signalintensiteten i forhold til det totale antallet celler. Data uttrykkes i vilkårlige enheter, med si-SCR-behandlede celler normalisert til 100%. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Mann-Whitney test, ****p < 0,0001. Forkortelser: si-SCR = kryptert siRNA; si-PLIN1 = siRNA mot Plin1; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = varmesjokkprotein 90; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; qRT-PCR = kvantitativ polymerasekjedereaksjon med omvendt transkripsjon; FAM = fluorescein amidite; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; IB = immunoblotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: mikro-RNA-overekspressjon i 3T3-L1-adipocytter. 3T3-L1-adipocytter ble transfektert med kontrollmikro-RNA-etterligning (miR-kontroll) eller mikro-RNA 34a-etterligning (miR-34a). Tre dager etter transfeksjonen ble cellene høstet for (A) RNA-ekstraksjon eller (B) fremstilling av proteinlysater. (A) Uttrykket av miR-34a ble målt ved qRT-PCR. MiR-uttrykket ble normalisert ved hjelp av U6 små RNA-nivåer og uttrykt i vilkårlige enheter, med miR-kontrollbehandlede celler normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student t-test, *p < 0,05. (B) Proteinlysater ble utsatt for vestlig blotting med antistoffer rettet mot VAMP2 og TUBULIN (lastkontroll). Representative immunobloter av tre uavhengige eksperimenter vises. (C) Mengden VAMP2 ble kvantifisert ved densitometriskanningsanalyse og normalisert ved hjelp av mengden TUBULIN. Data uttrykkes i vilkårlige enheter, med miR-kontrollcellene normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført av Student t-test,*p < 0,05. Forkortelser: SEM = standardfeil av gjennomsnittet; qRT-PCR = kvantitativ polymerasekjedereaksjon med omvendt transkripsjon; VAMP2 = vesicle-assosiert membranprotein 2; IB = immunoblotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekter av protein- eller mikro-RNA-modulering i 3T3-L1-adipocyttfunksjon. (A) 3T3-L1 adipocytter ble transfektert med si-SCR eller si-PLIN1. Mediet ble endret 24 timer etter transfeksjonen og samlet deretter 48 timer senere for å måle basal lipolyse. Resultatene uttrykkes som glyserol utgitt i media (μg/ml), og som gjennomsnitt + SEM av fire uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student t-test, ***p < 0,001. (B) 3T3-L1 adipocytter ble transfektert med miR-kontroll eller miR-34a. Mediet ble endret 24 timer etter transfeksjonen, og deretter, 48 timer senere, ble mediet endret til uttømmingsmediet (DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 1% penicillin og streptomycin og 0,5% BSA) i 6 timer. Deretter ble cellene behandlet med 0,5 nM insulin i 5 min. Celler ble høstet for å forberede proteinlysater for vestlig blotting med antistoffer rettet mot fosfo-PKB og PKB (lastekontroll). Representative immunobloter av tre uavhengige eksperimenter vises. (C) Mengden fosfo-PKB ble kvantifisert ved densitometriskanningsanalyse og normalisert ved hjelp av den totale mengden PKB. Data uttrykkes i vilkårlige enheter, med miR-kontrollcellene behandlet med insulin normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av toveis ANOVA-test, *p < 0,05 sammenlignet med miR-kontrollceller behandlet med insulin. (D) 3T3-L1 adipocytter ble transfektert med miR-kontroll eller miR-34a. Mediet ble endret 24 timer etter transfeksjonen, og deretter, 48 timer senere, ble mediet endret til uttømmingsmediet i 6 timer. Deretter ble cellene behandlet med 0,5 nM insulin i 20 min. Opptak av (2-3H) deoksyglucose ble målt over 3 min. Data uttrykkes i vilkårlige enheter, med basal glukoseopptak i miR-kontrollbehandlede celler normalisert til 1. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet + SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av toveis ANOVA-test, *p < 0,05 sammenlignet med miR-kontrollceller behandlet med insulin. Forkortelser: si-SCR = kryptert siRNA; si-PLIN1 = siRNA mot Plin1; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; PKB = protein kinase B; p-PKB = fosfor-PKB; miR-CTL = miR-kontroll; DMEM = Dulbeccos modifiserte Eagles medium; BSA = bovint serumalbumin; ANOVA = variansanalyse; IB = immunoblotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Per brønn (12-brønns plate) | Per brønn (24-brønns plate) | |
| Oligonukletider | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Forbedret minimalt viktig medium | 20 μL | 10 μL |
| Reagens for transfeksjon | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Forbedret minimalt viktig medium | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Totalt volum av transfeksjonsblanding | 200 μL | 100 μL |
Tabell 1: Transfeksjonsreagenser kreves for 12-brønns og 24-brønns plateformater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for differensiering og transfeksjon av modne adipocytter. Denne omvendte transfeksjonsmetoden er en enkel, økonomisk og svært effektiv metode for å transfektere oligonukleotider som, men ikke begrenset til, siRNAer, mikro-RNA-etterligninger og antimikro-RNAer til 3T3-L1-adipocytter, som er en av de vanskeligste cellelinjene å transfektere. Denne metoden har noen begrensninger som må vurderes. Denne protokollen er ikke effektiv for transfeksjon med plasmid DNA, noe som begrenser nytten av denne teknikken for funksjonsøkningsstudier. Selv om murincellelinjer, inkludert cellelinjen 3T3-L1, vanligvis har blitt brukt til å studere adipocyttfunksjon in vitro, er mikro-RNA-uttrykksmønstre og aktiviteter i murinvev ofte forskjellige fra de som observeres hos mennesker; Dette er også tilfelle med primærceller og cellelinjer. Videre krever mediet som brukes til differensiering av 3T3-L1 fibroblast i adipocytter en ufysiologisk hormoncocktail (insulin, deksametason, IBMX og rosiglitazon), og de differensierte cellene er morfologisk forskjellige fra in vivo modne adipocytter: de presenterer flerlokære lipiddråper i stedet for en unilocular lipiddråpe. Dette kan forklare noen forskjeller i genuttrykk og cellulære responser mellom in vitro- og in vivo-studier.
En fordel med å bruke denne omvendte transfeksjonsprotokollen sammenlignet med elektroporasjon er at denne metoden er billigere. Faktisk er reagensene billigere, og den høye effektiviteten til omvendt transfeksjon reduserer mengdene oligonukleotider som trengs, og det er ikke behov for dyrt utstyr som en elektroporator. Videre er det gunstig å bruke en lavere konsentrasjon av siRNA, da det unngår off-target effekter. Videre er denne omvendte transfeksjonen en enkel, rask, skånsom og grei metode for transfeksjon som krever færre celler og vil sikre utmerket celle levedyktighet og mer robuste data sammenlignet med elektroporasjon. Selv om prosedyren beskrevet ovenfor er optimalisert for differensiering og omvendt transfeksjon av mus 3T3-L1 celler, kan menneskelige preadipocytter også differensieres til adipocytter5 og lett utsatt for omvendt transfeksjon ved hjelp av denne protokollen. Denne rapporten viser at adipocytter forblir levedyktige, sunne og lydhøre overfor insulin etter omvendt transfeksjon ved hjelp av en ny generasjon av en ikke-liposomal kationisk amfifil transfeksjonsreagens. Omvendt transfeksjon kan også utføres ved hjelp av andre populære transfeksjonsreagenser. Imidlertid må mengdene oligonukleotider og transfeksjonsreagens optimaliseres for å sikre god modulering av uttrykk og ingen bivirkninger på celle levedyktighet.
Denne protokollen letter studiet av rollen som proteiner og mikro-RNAer i adipocyttfunksjon, men den kan også brukes til å modulere andre ikke-kodende RNAer som lnc-RNAer, Y-RNAer eller eRNAer. Det er kritiske trinn i protokollen som kan påvirke effektiviteten til prosedyren. Differensiering av 3T3-L1 fibroblaster i adipocytter bør overvåkes nøye. Det er viktig å nå et høyt nivå av differensiering for å unngå spredning av gjenværende fibroblaster etter transfeksjonen, noe som vil forvrenge resultatene av eksperimentet. Et annet viktig poeng er å utføre transfeksjonen på nydifferensierte modne adipocytter; Den beste timingen er 7-8 dager etter begynnelsen av differensieringsprotokollen, som tilsvarer 3-4 dager etter fjerning av differensieringscocktailen. Dette vil sikre robust transfeksjonseffekt og favorisere god reattachment av adipocyttene til platen. Til slutt bør behandlingen av adipocytter med trypsin overvåkes nøye for å sikre løsrivelse av adipocyttene uten å skade cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Université Côte d'Azur og Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) gjennom programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) og Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. støttes av tilskudd fra Société Francophone du Diabète (SFD), Foreningen Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) og Fondation Benjamin-Deltesert. J.G. støttes av ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. støttes av ANR grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 og et stipend fra Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansiert av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, som også støttes av GIS IBiSA Microscopy og Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
