Summary
Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.
Abstract
L'alterazione della funzione degli adipociti contribuisce alla patogenesi delle malattie metaboliche tra cui il diabete di tipo 2 e l'insulino-resistenza. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all'obesità. Modulare l'espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti rimane molto impegnativo. Questo articolo descrive un protocollo per differenziare i fibroblasti murini in adipociti maturi e per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti maturi attraverso la trasfezione inversa utilizzando oligonucleotidi a RNA a interferenza piccola (siRNA) e micro-RNA che imitano (miR mimic). Questo protocollo di trasfezione inversa prevede l'incubazione del reagente di trasfezione e degli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare a cui vengono aggiunti gli adipociti maturi. Gli adipociti sono quindi autorizzati a riattaccarsi alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Analisi funzionali come lo studio della segnalazione dell'insulina, dell'assorbimento del glucosio, della lipogenesi e della lipolisi possono essere eseguite sugli adipociti maturi 3T3-L1 trasfetti per studiare l'impatto della manipolazione di proteine o micro-RNA sulla funzione degli adipociti.
Introduction
L'obesità è considerata un importante fattore di rischio per numerose malattie metaboliche, tra cui la resistenza all'insulina (IR), il diabete di tipo 2 (T2D) e le malattie cardiovascolari1. Le terapie attuali non sono riuscite a fermare la prevalenza in costante aumento di queste malattie e la gestione dell'IR di pazienti obesi e diabetici rimane un importante problema clinico. Il tessuto adiposo svolge un ruolo cruciale nel controllo dell'omeostasi energetica e la sua espansione patologica durante l'obesità contribuisce allo sviluppo di IR e T2D2,3. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all'obesità. Molti studi di ricerca hanno studiato il ruolo degli RNA codificanti proteine nella fisiologia degli adipociti e la loro associazione con l'obesità.
Più recentemente, la scoperta di RNA non codificanti (ncRNA), in particolare micro-RNA (miR), ha forgiato nuovi concetti relativi al meccanismo di regolazione dei programmi di espressione genica. Gli studi hanno dimostrato che gli ncRNA sono importanti regolatori della funzione degli adipociti e che la loro disregolazione svolge un ruolo importante nelle malattie metaboliche4. Pertanto, la manipolazione di proteine e ncRNA negli adipociti è cruciale per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro impatto su patologie come il T2D. Tuttavia, manipolare l'espressione di proteine e ncRNA in vivo e negli adipociti primari rimane molto impegnativo, favorendo l'uso di modelli di adipociti in vitro.
I fibroblasti murini 3T3-L1 si differenziano facilmente in adipociti maturi, funzionali e insulino-responsi, che sono una linea cellulare ben caratterizzata utilizzata per studiare la funzione degli adipociti (ad esempio, segnalazione di insulina, assorbimento di glucosio, lipolisi e secrezione di adipochine)5,6,7,8,9,10. Queste proprietà rendono gli adipociti 3T3-L1 un modello interessante per modulare l'espressione di proteina-codifica e nc-RNA per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all'obesità. Sfortunatamente, mentre i fibroblasti 3T3-L1 sono facili da trasfettare utilizzando reagenti disponibili in commercio, gli adipociti 3T3-L1 differenziati sono una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo è il motivo per cui numerosi studi che manipolano l'espressione genica nelle cellule 3T3-L1 si sono concentrati sulla differenziazione degli adipociti piuttosto che sulla funzione degli adipociti.
Per molto tempo, l'unica tecnica efficiente per trasfezionare gli adipociti è stata l'elettroporazione5, che è noiosa, costosa e può causare danni alle cellule. Questo documento riporta una tecnica di trasfezione inversa che utilizza un reagente di trasfezione comune, che riduce il tempo pratico per la trasfezione, non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare ed è molto meno costoso dell'elettroporazione. Questo protocollo è perfettamente adatto per la trasfezione di siRNA e altri oligonucleotidi come i micro-RNA mimics (miR mimics) e anti-miRs. Il principio del protocollo di trasfezione inversa è quello di incubare il reagente di trasfezione e gli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare e quindi seminare gli adipociti maturi nei pozzetti. Quindi, gli adipociti si riattaccano alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Questa metodologia semplice, efficiente e poco costosa consente di studiare il ruolo degli RNA e dei miR codificanti proteine nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all'obesità.
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Protocol
NOTA: Utilizzare tecniche sterili per eseguire tutte le fasi del protocollo in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare. Vedere tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti e le apparecchiature.
1. Differenziazione dei fibroblasti murini 3T3-L1 in adipociti
- Coltivare i fibroblasti 3T3-L1 in piatti da 100 mm in DMEM medio di coltura senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% siero di vitello neonato e 1% di penicillina e streptomicina (Figura 1A). Posizionare i piatti in un incubatore di colture tissutali (7% CO2 e 37 °C).
- Due giorni dopo la confluenza, cambiare il terreno di coltura, sostituendo con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 1% di penicillina e streptomicina integrate con 0,25 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 0,25 μM di desametasone, 5 μg/ml di insulina e 10 μM di rosiglitazone.
NOTA: Ci vogliono 5 giorni per raggiungere la confluenza quando le cellule vengono seminate a 300.000 cellule per piatto da 100 mm. - Due giorni dopo, sostituire il terreno di coltura con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina integrati con 5 μg / mL di insulina e 10 μM di rosiglitazone e incubare per 2 giorni. Quindi, nutrire le cellule ogni 2 giorni con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina (Figura 1B).
- Trasfettate gli adipociti 3T3-L1 7-8 giorni dopo l'inizio del protocollo di differenziazione.
NOTA: È importante raggiungere un alto livello di differenziazione (>80%) prima della trasfezione per evitare la proliferazione dei fibroblasti rimanenti dopo la trasfezione, che porterebbe a una popolazione mista di cellule che potrebbe influenzare i risultati.
2. Preparazione di piastre precoate
- Il giorno prima o poche ore prima della trasfezione, preparare una soluzione di collagene di tipo I a 100 μg/mL in etanolo al 30% da una soluzione stock a 1 mg/mL. Aggiungere 250 μL di collagene per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti e 125 μL per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e distribuire la soluzione sulla superficie del pozzo.
- Lasciare il piatto senza il coperchio sotto il cappuccio della coltura fino a quando il collagene si asciuga. Lavare due volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS).
NOTA: le piastre precoate sono disponibili per l'acquisto.
3. Preparazione della miscela di trasfezione
NOTA: La concentrazione finale di siRNA è compresa tra 1 e 100 nM (da 1 a 100 pmol di siRNA per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti). La concentrazione finale del miR mimic è 10 nM (10 pmol/pozze). Determinare la migliore concentrazione di ciascun siRNA, miR mimic o altro oligonucleotide prima di iniziare l'esperimento per evitare effetti fuori bersaglio. Eseguire esperimenti di trasfezione in triplice copia per facilitare l'analisi statistica dei risultati. Preparare tutti i reagenti in eccesso per tenere conto della normale perdita durante il pipettaggio.
- Mescolare mediante pipettaggio (volume/volume) il siRNA (o altri oligonucleotidi) con minimale essenziale migliorato (Tabella 1). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere il reagente di trasfezione e il minimal essential medium migliorato al siRNA e il pipetto da miscelare (Tabella 1). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (durante questo periodo, procedere al paragrafo 4). Aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzo della piastra rivestita di collagene.
4. Preparazione degli adipociti 3T3-L1
- Lavare le celle nella capsula di Petri da 100 mm due volte con D-PBS. Aggiungere 5x tripsina alle cellule (1 mL per piatto da 100 mm), assicurandosi di coprire tutta la superficie con la tripsina. Attendere 30 s e rimuovere con attenzione la tripsina.
- Incubare la capsula di Petri per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatrice. Toccare la parabola da 100 mm per staccare le celle.
- Aggiungere 10 ml di DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina per neutralizzare la tripsina. Pipettare con cura il mezzo su e giù per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare.
- Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di celle automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 6,25 x 105 celle / mL di mezzo. Seminare 800 μL della sospensione/pozzetti cellulare di una piastra a 12 pozzetti (5 x 105 cellule) o 400 μl della sospensione/pozzettino cellulare di una piastra a 24 pozzetti (2,5 x 105 cellule) contenente la miscela di trasfezione.
NOTA: Una capsula di Petri da 100 mm di adipociti consentirà la preparazione di una piastra da 12 pozzetti o di una piastra da 24 pozzetti. Un piatto da 100 mm di solito contiene 6-7 x10 6 adipociti, che corrispondono a 5 x10 5 adipociti per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. - Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari (7% CO2 e 37 °C) e non disturbare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina.
NOTA: È anche possibile seminare le cellule in piastre a 48 e 96 pozzetti precoate di collagene, ma prendere maggiori precauzioni quando si sostituisce il mezzo per evitare il distacco degli adipociti.
5. Analisi funzionale di adipociti 3T3-L1 trasfettato
- Target di studio knockdown 24-48 h e 48-96 h dopo siRNA o miR mimic delivery per mRNA e proteine, rispettivamente.
- Eseguire analisi funzionali degli adipociti trasfetti per studiare la segnalazione dell'insulina, l'assorbimento del glucosio, la secrezione di adipochine, la lipolisi e la lipogenesi.
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Representative Results
Utilizzando la procedura di reverse-transfection qui descritta per modulare l'espressione di proteine o micro-RNA negli adipociti 3T3-L1, gli adipociti hanno dimostrato di preservare la loro morfologia dopo la trasfezione (Figura 1B,C). Infatti, 2 giorni dopo la trasfezione, gli adipociti erano ben diffusi e attaccati alla piastra e presentavano goccioline lipidiche multiloculari che sono una caratteristica degli adipociti 3T3-L1 maturi. Il contenuto lipidico non era diverso tra gli adipociti trasfettate e non trasfettate (Figura 1D,E). Inoltre, l'espressione dell'mRNA di marcatori di differenziazione come il recettore gamma 2 attivato dal proliferatore del perossisoma (Pparγ2), l'adiponectina (Adipoq), il trasportatore di glucosio 4 o la famiglia di portatori di soluti 2 membro 4 (Slc2a4), il substrato del recettore dell'insulina1( Irs1 ), peripina-1 (Plin1) è rimasta invariata nelle cellule trasfettate rispetto a quella negli adipociti non trasfettate (Figura 1F). Questo protocollo di trasfezione inversa è efficiente in quanto >70% degli adipociti sono stati trasfettate (Figura 1G, H).
La perilipina-1 è una proteina specifica degli adipociti nota per promuovere la formazione di goccioline lipidiche e inibire la lipolisi. Qui, gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con siRNA strapazzato (si-SCR) o siRNA contro Plin1 (si-PLIN1). Tre giorni dopo la trasfezione con si-PLIN1, il livello di mRNA di Plin1 era diminuito del 70% (Figura 2A) e il livello di proteine del 63% (Figura 2B,C). L'espressione di PLIN1 è stata analizzata anche al microscopio a fluorescenza 4 giorni dopo la trasfezione ed è risultata essere diminuita del 92% rispetto alla sua espressione negli adipociti di controllo (Figura 2D-F), dimostrando così l'efficacia sia del protocollo di trasfezione che del si-PLIN1.
Questo protocollo è stato utilizzato anche per eseguire la trasfezione inversa di adipociti con oligonucleotidi che imitano micro-RNA (miR imita) per sovraregolare l'espressione di miR-34a (Figura 3A). La sovraespressione di miR-34a ha portato alla diminuzione dell'espressione della proteina VAMP2 del 50% (Figura 3B,C), un target confermato di miR-34a11,12. Infine, questo studio dimostra che la trasfezione inversa degli adipociti 3T3-L1 preserva la loro funzione e reattività alla stimolazione insulinica. Infatti, l'abbattimento di Plin1 negli adipociti 3T3-L1 ha portato ad un aumento della lipolisi basale (Figura 4A). Inoltre, la sovraespressione di miR-34a negli adipociti 3T3-L1 ha portato all'inibizione della fosforilazione della proteina chinasi B indotta dall'insulina (Figura 4B,C) e all'assorbimento di glucosio (Figura 4D).
Figura 1: Differenziazione dei fibroblasti 3T3-L1 in adipociti maturi. (A) I fibroblasti 3T3-L1 sono stati seminati ad una densità di 3 x 105 cellule per piatto da 100 mm. Immagine rappresentativa 10x in campo luminoso dei fibroblasti 3T3-L1 2 giorni dopo. Duegiorni dopo la confluenza (giorno 0), i fibroblasti 3T3-L1 sono stati differenziati in adipociti utilizzando una miscela cocktail di differenziazione per 4 giorni (fino al giorno 4). Immagine rappresentativa 10x in campo luminoso dei fibroblasti 3T3-L1 differenziati in adipociti (giorno 7). Gli adipociti con goccioline lipidiche multiloculari sono facilmente distinguibili. (C) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-SCR il giorno 7. Immagini rappresentative 10x in campo luminoso di adipociti 3T3-L1 trasfettate (giorno 9). La morfologia degli adipociti trasfettate è paragonabile a quella degli adipociti non trasfettate, il che implica che il metodo di trasfezione è delicato e non tossico per gli adipociti. Barre di scala: 50 μm. (D-E) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-SCR il giorno 7 (pannelli superiori); adipociti non trasfettate (pannelli inferiori). Due giorni dopo, le cellule sono state incubate con Oil Red O per macchiare i lipidi. (D) Vengono mostrate immagini rappresentative delle cellule colorate nella piastra e immagini rappresentative 10x in campo luminoso. Barre di scala: 50 μm. (E) L'olio rosso O incorporato nelle cellule è stato eluito con 2-propanolo e quantificato utilizzando uno spettrofotometro. I dati sono espressi in unità arbitrarie, con l'assorbanza delle cellule non trasfettate normalizzata a 1. I risultati sono espressi come media + SEM di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita dal t-testdello studente. (F) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-SCR. Tre giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte per isolare l'RNA totale. L'espressione dei marcatori di differenziazione degli adipociti è stata misurata mediante qRT-PCR e normalizzata utilizzando livelli di RNA 36B4. I dati rappresentano l'espressione di mRNA nelle cellule trasfettate rispetto a quella nelle cellule non trasfettate (normalizzate a 1, rappresentate dalla linea tratteggiata) e sono espressi come media + SEM di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita dal t-testdello studente. (G–H) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-SCR o colorante fluorescente (FAM) etichettato si-RNA e placcati su coverslip. Gli adipociti 3T3-L1 sono stati analizzati 8 ore dopo al microscopio a fluorescenza. (G) Viene mostrata un'immagine rappresentativa a piano singolo di cellule 3T3-L1 trasfettate. (H) Quantificazione delle cellule FAM-positive rispetto al numero totale di cellule. I dati sono espressi come percentuale di cellule contenenti si-RNA fluorescente. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test di Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abbreviazioni: si-SCR = siRNA strapazzato; SEM = errore standard della media; qRT-PCR = reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa; FAM = fluoresceina amidite; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; si-FAM = si-RNA con etichetta FAM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Silenziamento delle proteine negli adipociti 3T3-L1. Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-RNA strapazzato (si-SCR) o si-RNA contro Plin1 (si-PLIN1). Tregiorni dopo la trasfezione, l'espressione di mRNA di Plin1 è stata misurata mediante qRT-PCR. L'espressione dell'mRNA è stata normalizzata utilizzando livelli di RNA 36B4 ed espressa in unità arbitrarie, con le cellule trattate con si-SCR normalizzate a 1. I risultati sono espressi come la media + SEM di quattro esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-testdello studente, **p < 0,01. (B–C) Tre giorni dopo la trasfezione, i lasati proteici sono stati sottoposti a western blotting con anticorpi diretti contro PLIN1 e HSP90 (controllo del carico). Vengono mostrati immunoblot rappresentativi. (C) La quantità di PLIN1 è stata quantificata mediante analisi di scansione densitometrica e normalizzata utilizzando la quantità di HSP90. I dati sono espressi in unità arbitrarie, con le cellule trattate con si-SCR normalizzate a 1. I risultati sono espressi come la media + SEM di quattro esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-testdello studente, *p < 0,05. (D–F) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-SCR o si-PLIN1 e placcati su coverslip. L'espressione di PLIN1 è stata analizzata 96 ore dopo mediante microscopia a fluorescenza. (D) Vengono mostrate immagini rappresentative a piano singolo di adipociti 3T3-L1 colorati con anticorpo anti-perilipina e un anticorpo coniugato anti-coniglio-Alexa647. Barre di scala = 10 μm. (E) Rendering tridimensionale (3D) del volume degli adipociti 3T3-L1 segmentati in 3D utilizzando software commerciale. Barre di scala = 10 μm. (F) La quantificazione dell'intensità del segnale PLIN1 rispetto al numero totale di celle. I dati sono espressi in unità arbitrarie, con le cellule trattate con si-SCR normalizzate al 100%. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test di Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abbreviazioni: si-SCR = siRNA strapazzato; si-PLIN1 = siRNA contro Plin1; Plin1 = perilipina-1; HSP90 = proteina da shock termico 90; SEM = errore standard della media; qRT-PCR = reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa; FAM = fluoresceina amidite; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; IB = immunoblotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: sovraespressione di micro-RNA negli adipociti 3T3-L1. Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con micro-RNA mimic di controllo (miR-control) o micro-RNA 34a mimic (miR-34a). Tre giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte per l'estrazione di RNA(A)o(B)preparazione di la preparazione di lasati proteici. (A) L'espressione di miR-34a è stata misurata mediante qRT-PCR. L'espressione di miR è stata normalizzata utilizzando piccoli livelli di RNA U6 ed espressa in unità arbitrarie, con le cellule trattate con il controllo miR normalizzate a 1. I risultati sono espressi come media + SEM di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-testdello studente, *p < 0,05. (B) I lasati proteici sono stati sottoposti a western blotting con anticorpi diretti contro VAMP2 e TUBULIN (controllo del carico). Vengono mostrati immunoblot rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (C) La quantità di VAMP2 è stata quantificata mediante analisi di scansione densitometrica e normalizzata utilizzando la quantità di TUBULINA. I dati sono espressi in unità arbitrarie, con le celle di controllo miR normalizzate a 1. I risultati sono espressi come media + SEM di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita dal t-testdello studente, *p < 0,05. Abbreviazioni: SEM = errore standard della media; qRT-PCR = reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa; VAMP2 = proteina di membrana associata alle vescicole 2; IB = immunoblotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti della modulazione di proteine o micro-RNA nella funzione degli adipociti 3T3-L1. (A) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con si-SCR o si-PLIN1. Il mezzo è stato cambiato 24 ore dopo la trasfezione e poi raccolto 48 ore dopo per misurare la lipolisi basale. I risultati sono espressi come glicerolo rilasciato nel mezzo (μg / mL) e come media + SEM di quattro esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-testdello studente, ***p < 0,001. (B) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettato con miR-control o miR-34a. Il mezzo è stato cambiato 24 ore dopo la trasfezione, e poi, 48 ore dopo, il mezzo è stato cambiato nel mezzo di deplezione (DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 1% di penicillina e streptomicina e 0,5% di BSA) per 6 ore. Quindi, le cellule sono state trattate con 0,5 nM di insulina per 5 minuti. Le cellule sono state raccolte per preparare i lasati proteici per il western blotting con anticorpi diretti contro il fosfo-PKB e il PKB (controllo del carico). Vengono mostrati immunoblot rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (C) La quantità di fosfo-PKB è stata quantificata mediante analisi di scansione densitometrica e normalizzata utilizzando la quantità totale di PKB. I dati sono espressi in unità arbitrarie, con le cellule di controllo miR trattate con insulina normalizzata a 1. I risultati sono espressi come media + SEM di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test ANOVA bidirezionale, *p < 0,05 rispetto alle cellule di controllo miR trattate con insulina. (D) Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trasfettate con miR-control o miR-34a. Il supporto è stato cambiato 24 ore dopo la trasfezione, e poi, 48 ore dopo, il mezzo è stato cambiato nel mezzo di esaurimento per 6 ore. Quindi, le cellule sono state trattate con 0,5 nM di insulina per 20 minuti. L'assorbimento di(2-3H)desossiglucosio è stato misurato nell'arco di 3 minuti. I dati sono espressi in unità arbitrarie, con l'assorbimento basale di glucosio nelle cellule trattate con miR-controllo normalizzato a 1. I risultati sono espressi come media + SEM di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test ANOVA bidirezionale, *p < 0,05 rispetto alle cellule di controllo miR trattate con insulina. Abbreviazioni: si-SCR = siRNA strapazzato; si-PLIN1 = siRNA contro Plin1; SEM = errore standard della media; PKB = proteina chinasi B; p-PKB = fosforo-PKB; miR-CTL = miR-controllo; DMEM = il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco; BSA = albumina sierica bovina; ANOVA = analisi della varianza; IB = immunoblotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Per pozzo (piatto da 12 pozzi) | Per pozzo (piatto da 24 pozzi) | |
| Oligonucletidi | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Migliorato Minimal Essential Medium | 20 μL | 10 μL |
| Reagente di trasfezione | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Migliorato Minimal Essential Medium | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Volume totale della miscela di trasfezione | 200 μL | 100 μL |
Tabella 1: Reagenti di trasfezione necessari per i formati di piastre a 12 e 24 pozzi.
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Discussion
Questo documento presenta un protocollo dettagliato per la differenziazione e la trasfezione di adipociti maturi. Questo metodo di trasfezione inversa è un metodo semplice, economico e altamente efficiente per trasfettare oligonucleotidi come, ma non solo, siRNA, imitazioni di micro-RNA e anti-micro-RNA in adipociti 3T3-L1, che è una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo metodo ha alcune limitazioni che devono essere considerate. Questo protocollo non è efficiente per la trasfezione con DNA plasmidico, il che limita l'utilità di questa tecnica per gli studi sul guadagno di funzione. Sebbene le linee cellulari murine, compresa la linea cellulare 3T3-L1, siano state tipicamente utilizzate per studiare la funzione degli adipociti in vitro, i modelli di espressione e le attività del micro-RNA nel tessuto murino sono spesso diversi da quelli osservati nell'uomo; questo è anche il caso delle cellule primarie e delle linee cellulari. Inoltre, il mezzo utilizzato per la differenziazione dei fibroblasti 3T3-L1 in adipociti richiede un cocktail ormonale non fisiologico (insulina, desametasone, IBMX e rosiglitazone), e le cellule differenziate sono morfologicamente distinte dagli adipociti maturi in vivo: presentano goccioline lipidiche multiloculari invece di una goccia lipidica uniloculare. Questo potrebbe spiegare alcune differenze nell'espressione genica e nelle risposte cellulari tra studi in vitro e in vivo.
Un vantaggio dell'utilizzo di questo protocollo di trasfezione inversa rispetto all'elettroporazione è che questo metodo è più economico. In effetti, i reagenti sono meno costosi e l'elevata efficienza della trasfezione inversa diminuisce le quantità di oligonucleotidi necessarie e non c'è bisogno di apparecchiature costose come un elettroporatore. Inoltre, l'utilizzo di una concentrazione inferiore di siRNA è utile in quanto evita effetti fuori bersaglio. Inoltre, questa trasfezione inversa è un metodo di trasfezione facile, veloce, delicato e diretto che richiede meno cellule e garantirà un'eccellente vitalità cellulare e dati più robusti rispetto all'elettroporazione. Sebbene la procedura sopra descritta sia stata ottimizzata per la differenziazione e la trasfezione inversa delle cellule 3T3-L1 del topo, i preadipociti umani possono anche essere differenziati in adipociti5 e facilmente sottoposti a trasfezione inversa utilizzando questo protocollo. Questo rapporto mostra che gli adipociti rimangono vitali, sani e reattivi all'insulina dopo la trasfezione inversa utilizzando una nuova generazione di un reagente di trasfezione anfifila cationica non liposomiale. La trasfezione inversa potrebbe anche essere eseguita utilizzando altri reagenti di trasfezione popolari. Tuttavia, le quantità di oligonucleotidi e reagenti di trasfezione dovrebbero essere ottimizzate per garantire una buona modulazione dell'espressione e nessun effetto negativo sulla vitalità cellulare.
Questo protocollo facilita lo studio del ruolo delle proteine e dei micro-RNA nella funzione degli adipociti, ma potrebbe anche essere utilizzato per modulare altri RNA non codificanti come lnc-RNA, Y-RNA o eRNA. Ci sono passaggi critici nel protocollo che possono influire sull'efficienza della procedura. La differenziazione dei fibroblasti 3T3-L1 in adipociti deve essere attentamente monitorata. È importante raggiungere un alto livello di differenziazione per evitare la proliferazione dei fibroblasti rimanenti dopo la trasfezione, che farebbe influenzare i risultati dell'esperimento. Un altro punto importante è quello di eseguire la trasfezione su adipociti maturi appena differenziati; il momento migliore è 7-8 giorni dopo l'inizio del protocollo di differenziazione, che corrisponde a 3-4 giorni dopo la rimozione del cocktail di differenziazione. Ciò garantirà una robusta efficacia di trasfezione e favorirà un buon riattaccamento degli adipociti alla piastra. Infine, il trattamento degli adipociti con tripsina deve essere attentamente monitorato per garantire il distacco degli adipociti senza danneggiare le cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'INSERM, dall'Université Côte d'Azur e dall'Agenzia Nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso il programma Investimenti per il futuro Laboratorio di Eccellenza (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. è sostenuta da sovvenzioni della Société Francophone du Diabète (SFD), dell'Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), dell'Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e della Fondation Benjamin-Delessert. J.G. è supportato da ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. è sostenuta dalla sovvenzione ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e da una sovvenzione della Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, che è anche supportato dalla GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
