Summary
Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.
Abstract
La alteración de la función de los adipocitos contribuye a la patogénesis de enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Modular la expresión de proteínas y micro-ARN en los adipocitos sigue siendo un gran desafío. Este artículo describe un protocolo para diferenciar los fibroblastos murinos en adipocitos maduros y para modular la expresión de proteínas y micro-ARN en adipocitos maduros a través de la transfección inversa utilizando oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeña (siRNA) y micro-ARN imitador (miR mimic). Este protocolo de transfección inversa implica la incubación del reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular al que se añaden los adipocitos maduros. Luego se permite que los adipocitos se vuelvan a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Se pueden realizar análisis funcionales como el estudio de la señalización de insulina, la captación de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis en los adipocitos maduros 3T3-L1 transfectados para estudiar el impacto de la manipulación de proteínas o microARN en la función de los adipocitos.
Introduction
La obesidad se considera un factor de riesgo importante para numerosas enfermedades metabólicas, incluida la resistencia a la insulina (RI), la diabetes tipo 2 (DT2) y las enfermedades cardiovasculares1. Las terapias actuales no han logrado detener la prevalencia en constante aumento de estas enfermedades, y el manejo de la RI de pacientes obesos y diabéticos sigue siendo un problema clínico importante. El tejido adiposo juega un papel crucial en el control de la homeostasis energética, y su expansión patológica durante la obesidad contribuye al desarrollo de IR y DT22,3. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Muchos estudios de investigación han investigado el papel de los ARN codificantes de proteínas en la fisiología de los adipocitos y su asociación con la obesidad.
Más recientemente, el descubrimiento de los ARN no codificantes (NCRNAs), especialmente los micro-RNAs (miRs), ha forjado conceptos novedosos relacionados con el mecanismo de regulación de los programas de expresión génica. Los estudios han demostrado que los ncRNAs son importantes reguladores de la función de los adipocitos, y que su desregulación juega un papel importante en las enfermedades metabólicas4. Así, la manipulación de proteínas y ncRNAs en adipocitos es crucial para descifrar sus papeles en la función de los adipocitos y su impacto en patologías como la DT2. Sin embargo, la manipulación de la expresión de proteínas y ncRNAs in vivo, así como en adipocitos primarios sigue siendo un gran desafío, favoreciendo el uso de modelos de adipocitos in vitro.
Los fibroblastos murinos 3T3-L1 se diferencian fácilmente en adipocitos maduros, funcionales y sensibles a la insulina, que son una línea celular bien caracterizada utilizada para estudiar la función de los adipocitos (por ejemplo, señalización de insulina, captación de glucosa, lipólisis y secreción de adipoquinas)5,6,7,8,9,10. Estas propiedades hacen de los adipocitos 3T3-L1 un modelo atractivo para modular la expresión de los arneses codificantes de proteínas y nc-ARN para descifrar su papel en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad. Desafortunadamente, mientras que los fibroblastos 3T3-L1 son fáciles de transfectar utilizando reactivos disponibles comercialmente, los adipocitos 3T3-L1 diferenciados son una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Esta es la razón por la que numerosos estudios que manipulan la expresión génica en células 3T3-L1 se han centrado en la diferenciación de adipocitos en lugar de en la función de los adipocitos.
Durante mucho tiempo, la única técnica eficiente para transfectar adipocitos fue la electroporación5,que es tediosa, costosa y puede causar daño celular. Este artículo informa una técnica de transfección inversa que utiliza un reactivo de transfección común, que reduce el tiempo práctico para la transfección, no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular y es mucho menos costoso que la electroporación. Este protocolo es perfectamente adecuado para la transfección de siRNA y otros oligonucleótidos como imitadores de micro-ARN (imitadores de miR) y anti-miRs. El principio del protocolo de transfección inversa es incubar el reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular y luego sembrar los adipocitos maduros en los pozos. Luego, los adipocitos se vuelven a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Esta metodología simple, eficiente y económica permite estudiar el papel de los ARN y miR codificantes de proteínas en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad.
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Protocol
NOTA: Utilice técnicas estériles para realizar todos los pasos del protocolo en una campana de cultivo celular de flujo laminar. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos y equipos.
1. Diferenciación de fibroblastos murinos 3T3-L1 en adipocitos
- Cultivar los fibroblastos 3T3-L1 en platos de 100 mm en cultivo medio-DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero de ternero recién nacido, y 1% de penicilina y estreptomicina (Figura 1A). Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos (7% CO2 y 37 °C).
- Dos días después de la confluencia, cambie el medio de cultivo, reemplazando con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero fetal de terneros (FCS) y 1% de penicilina y estreptomicina suplementados con 0.25 mM de 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.25 μM de dexametasona, 5 μg / ml de insulina y 10 μM de rosiglitazona.
NOTA: Se necesitan 5 días para alcanzar la confluencia cuando las células se siembran a 300,000 células por plato de 100 mm. - Dos días después, reemplace el medio de cultivo con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina suplementada con 5 μg / ml de insulina y 10 μM de rosiglitazona e incube durante 2 días. Luego, alimente las células cada 2 días con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina(Figura 1B).
- Transfectar los adipocitos 3T3-L1 7-8 días después del inicio del protocolo de diferenciación.
NOTA: Es importante alcanzar un alto nivel de diferenciación (>80%) antes de la transfección para evitar la proliferación de los fibroblastos restantes después de la transfección, lo que llevaría a una población mixta de células que podría sesgar los resultados.
2. Preparación de placas preestutuadas
- El día anterior o unas horas antes de la transfección, prepare una solución de colágeno tipo I a 100 μg/mL en etanol al 30% a partir de una solución stock a 1 mg/mL. Agregue 250 μL de colágeno por pozo de una placa de 12 pozos y 125 μL por pozo de una placa de 24 pozos, y extienda la solución sobre la superficie del pozo.
- Deje la placa sin la tapa debajo de la campana de cultivo hasta que el colágeno se seque. Lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS).
NOTA: Las placas preestuadas están disponibles para su compra.
3. Preparación de la mezcla de transfección
NOTA: La concentración final de siRNA está entre 1 y 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por pozo de una placa de 12 pozos). La concentración final del imitador miR es de 10 nM (10 pmol/pozo). Determine la mejor concentración de cada siRNA, imitación de miR u otro oligonucleótido antes de comenzar el experimento para evitar efectos fuera del objetivo. Realizar experimentos de transfección por triplicado para facilitar el análisis estadístico de los resultados. Prepare todos los reactivos en exceso para tener en cuenta la pérdida normal durante el pipeteo.
- Mezclar mediante pipeteo (volumen/volumen) el siRNA (u otros oligonucleótidos) con el Medio Esencial Mínimo mejorado (Tabla 1). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir el reactivo de transfección y el Medio Esencial Mínimo mejorado al siRNA, y pipet a la mezcla (Tabla 1). Incubar durante 20 min a temperatura ambiente (durante este tiempo, continúe con la sección 4). Agregue la mezcla de transfección a cada pozo de la placa recubierta de colágeno.
4. Preparación de los adipocitos 3T3-L1
- Lave las celdas en la placa de Petri de 100 mm dos veces con D-PBS. Agregue 5x tripsina a las células (1 ml por plato de 100 mm), asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 s y retire cuidadosamente la tripsina.
- Incubar la placa de Petri durante 5-10 min a 37 °C en la incubadora. Toque el plato de 100 mm para separar las celdas.
- Añadir 10 ml de DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% FCS, y 1% de penicilina y estreptomicina para neutralizar la tripsina. Pipetee cuidadosamente el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular.
- Cuente las células utilizando una cámara de conteo de Malassez o un contador de células automatizado, y ajuste la concentración de las células a 6.25 x 105 celdas / ml de medio. Sembrar 800 μL de la suspensión celular/pozo de una placa de 12 pozos (5 x 105 células) o 400 μl de la suspensión celular/pozo de una placa de 24 pozos (2,5 x 105 células) que contiene la mezcla de transfección.
NOTA: Una placa de Petri de 100 mm de adipocitos permitirá la preparación de una placa de 12 pozos o una placa de 24 pozos. Un plato de 100 mm generalmente contiene 6-7 x 106 adipocitos, que corresponden a 5 x 105 adipocitos por pozo de una placa de 12 pozos. - Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular (7% CO2 y 37 °C), y no perturbar las células durante 24 h. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina.
NOTA: También es posible sembrar las células en placas de 48 y 96 pozos precubiertas de colágeno, pero tome más precauciones al reemplazar los medios para evitar el desprendimiento de los adipocitos.
5. Análisis funcional de adipocitos 3T3-L1 transfectados
- El objetivo del estudio es derribar 24-48 h y 48-96 h después de la administración de imitación de siRNA o miR para ARNm y proteína, respectivamente.
- Realizar análisis funcionales de adipocitos transfectados para estudiar la señalización de insulina, la captación de glucosa, la secreción de adipoquinas, la lipólisis y la lipogénesis.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento de transfección inversa descrito aquí para modular la expresión de proteínas o micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, se ha demostrado que los adipocitos preservan su morfología después de la transfección(Figura 1B,C). De hecho, 2 días después de la transfección, los adipocitos estaban bien diseminados y unidos a la placa y presentaban gotas lipídicas multiloculares que son una característica de los adipocitos 3T3-L1 maduros. El contenido de lípidos no fue diferente entre los adipocitos transfectados y no transfectados (Figura 1D,E). Además, la expresión de ARNm de marcadores de diferenciación como el receptor gamma 2 activado por el proliferador de peroxisomas (Pparγ2), la adiponectina (Adipoq), el transportador de glucosa 4 o el portador de solutos de la familia 2 miembro 4 (Slc2a4), el sustrato del receptor de insulina 1 (Irs1), la perilipina-1 (Plin1) no se modificó en las células transfectadas en comparación con la de los adipocitos no transfectados (Figura 1F). Este protocolo de transfección inversa es eficiente ya que >70% de los adipocitos fueron transfectados (Figura 1G,H).
La perilipina-1 es una proteína específica de adipocitos conocida por promover la formación de gotas lipídicas e inhibir la lipólisis. Aquí, los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con siRNA revuelto (si-SCR) o siRNA contra Plin1 (si-PLIN1). Tres días después de la transfección con si-PLIN1, el nivel de ARNm de Plin1 había disminuido en un 70%(Figura 2A)y el nivel de proteína en un 63%(Figura 2B,C). La expresión de PLIN1 también se analizó mediante microscopía de fluorescencia 4 días después de la transfección y se encontró que había disminuido en un 92% en comparación con su expresión en adipocitos de control(Figura 2D-F),demostrando así la eficacia tanto del protocolo de transfección como del si-PLIN1.
Este protocolo también se utilizó para realizar la transfección inversa de adipocitos con micro-ARN imitando (miR imita) oligonucleótidos para regular al alza la expresión de miR-34a(Figura 3A). La sobreexpresión de miR-34a condujo a la disminución de la expresión de la proteína VAMP2 en un 50%(Figura 3B,C),un objetivo confirmado de miR-34a11,12. Finalmente, este estudio muestra que la transfección inversa de los adipocitos 3T3-L1 preserva su función y capacidad de respuesta a la estimulación de la insulina. De hecho, el derribo de Plin1 en los adipocitos 3T3-L1 condujo a un aumento de la lipólisis basal(Figura 4A). Además, la sobreexpresión de miR-34a en los adipocitos 3T3-L1 condujo a la inhibición de la fosforilación de la proteína quinasa B inducida por insulina(Figura 4B,C)y la absorción de glucosa(Figura 4D).
Figura 1: Diferenciación de fibroblastos 3T3-L1 en adipocitos maduros. (A) Los fibroblastos 3T3-L1 se sembraron a una densidad de 3 x 105 células por plato de 100 mm. Imagen representativa de campo brillante 10x de fibroblastos 3T3-L1 2 días después. (B) Dos días después de la confluencia (día 0), los fibroblastos 3T3-L1 se diferenciaron en adipocitos utilizando una mezcla de cóctel de diferenciación durante 4 días (hasta el día 4). Imagen representativa de campo brillante 10x de fibroblastos 3T3-L1 diferenciados en adipocitos (día 7). Los adipocitos con gotas lipídicas multiloculares son fácilmente discernibles. (C) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-SCR el día 7. Imágenes representativas de campo brillante 10x de adipocitos 3T3-L1 transfectados (día 9). La morfología de los adipocitos transfectados es comparable a la de los adipocitos no transfectados, lo que implica que el método de transfección es suave y no tóxico para los adipocitos. Barras de escala: 50 μm. (D–E) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-SCR el día 7 (paneles superiores); adipocitos no transfectados (paneles inferiores). Dos días después, las células se incubaron con Oil Red O para teñir los lípidos. (D) Se muestran imágenes representativas de las células teñidas en la placa e imágenes representativas de campo brillante de 10x. Barras de escala: 50 μm. (E) El aceite rojo O incorporado en las células fue eluido con 2-propanol y cuantificado mediante un espectrofotómetro. Los datos se expresan en unidades arbitrarias, con la absorbancia de las células no transfectadas normalizadas a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba tde Student. (F) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-SCR. Tres días después de la transfección, las células fueron recolectadas para aislar el ARN total. La expresión de los marcadores de diferenciación de adipocitos se midió mediante qRT-PCR y se normalizó utilizando niveles de ARN 36B4. Los datos representan la expresión de ARNm en células transfectadas en relación con la de células no transfectadas (normalizadas a 1, representadas por la línea punteada) y se expresan como la media + SEM de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba tde Student. (G–H) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-SCR o si-ARN etiquetado con colorante fluorescente (FAM) y chapados en fundas. Los adipocitos 3T3-L1 fueron analizados 8 h después mediante microscopía de fluorescencia. (G) Se muestra una imagen representativa de un solo plano de células 3T3-L1 transfectadas. (H) Cuantificación de las células FAM-positivas en relación con el número total de células. Los datos se expresan como porcentaje de células que contienen si-ARN fluorescente. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abreviaturas: si-SCR = siRNA revuelto; SEM = error estándar de la media; qRT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa; FAM = amidita de fluoresceína; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; si-FAM = si-ARN etiquetado con FAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Silenciamiento de proteínas en adipocitos 3T3-L1. Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-ARN revuelto (si-SCR) o si-ARN contra Plin1 (si-PLIN1). (A) Tres días después de la transfección, la expresión de ARNm de Plin1 se midió mediante qRT-PCR. La expresión de ARNm se normalizó utilizando niveles de ARN 36B4 y se expresó en unidades arbitrarias, con las células tratadas con si-SCR normalizadas a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de cuatro experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba tde Student, **p < 0,01. (B–C) Tres días después de la transfección, los lisatos de proteínas fueron sometidos a western blotting con anticuerpos dirigidos contra PLIN1 y HSP90 (control de carga). Se muestran inmunoblots representativos. (C) La cantidad de PLIN1 se cuantificó mediante análisis de exploración por densitometría y se normalizó utilizando la cantidad de HSP90. Los datos se expresan en unidades arbitrarias, con las células tratadas con si-SCR normalizadas a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de cuatro experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba tde Student, *p < 0,05. (D–F) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-SCR o si-PLIN1 y chapados en fundas. La expresión de PLIN1 fue analizada 96 h posteriormente mediante microscopía de fluorescencia. (D) Se muestran imágenes representativas de un solo plano de adipocitos 3T3-L1 teñidos con anticuerpo anti-perilipina y un anticuerpo anti-conejo-Alexa647-conjugado. Barras de escala = 10 μm. (E) Representación tridimensional (3D) del volumen de adipocitos 3T3-L1 segmentados en 3D utilizando software comercial. Barras de escala = 10 μm. (F) Cuantificación de la intensidad de la señal PLIN1 en relación con el número total de células. Los datos se expresan en unidades arbitrarias, con las células tratadas con si-SCR normalizadas al 100%. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abreviaturas: si-SCR = siRNA revuelto; si-PLIN1 = siRNA contra Plin1; Plin1 = perilipina-1; HSP90 = proteína de choque térmico 90; SEM = error estándar de la media; qRT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa; FAM = amidita de fluoresceína; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; IB = inmunoblotting. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: sobreexpresión de micro-ARN en adipocitos 3T3-L1. Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con imitación de micro-ARN de control (miR-control) o imitación de micro-ARN 34a (miR-34a). Tres días después de la transfección, las células fueron recolectadas para (A) extracción de ARN o (B) preparación de lisados de proteínas. (A) La expresión de miR-34a se midió mediante qRT-PCR. La expresión de miR se normalizó utilizando niveles pequeños de ARN U6 y se expresó en unidades arbitrarias, con las células tratadas con control de miR normalizadas a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba tde Student, *p < 0,05. (B) Los lisatos de proteínas fueron sometidos a western blotting con anticuerpos dirigidos contra VAMP2 y TUBULIN (control de carga). Se muestran inmunoblots representativos de tres experimentos independientes. (C) La cantidad de VAMP2 se cuantificó mediante análisis de escaneo por densitometría y se normalizó utilizando la cantidad de TUBULINA. Los datos se expresan en unidades arbitrarias, con las celdas de control miR normalizadas a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t deStudent, *p < 0,05. Abreviaturas: SEM = error estándar de la media; qRT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa; VAMP2 = proteína de membrana asociada a vesículas 2; IB = inmunoblotting. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de la modulación de proteínas o micro-ARN en la función de los adipocitos 3T3-L1. (A) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con si-SCR o si-PLIN1. El medio se cambió 24 h después de la transfección y luego se recolectó 48 h más tarde para medir la lipólisis basal. Los resultados se expresan como glicerol liberado en el medio (μg/mL), y como la media + SEM de cuatro experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba tde Student, ***p < 0,001. (B) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con miR-control o miR-34a. El medio se cambió 24 h después de la transfección, y luego, 48 h después, el medio se cambió al medio de agotamiento (DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 1% de penicilina y estreptomicina, y 0,5% de BSA) durante 6 h. Luego, las células fueron tratadas con insulina 0.5 nM durante 5 min. Las células se recolectaron para preparar lisados de proteínas para western blotting con anticuerpos dirigidos contra fosfo-PKB y PKB (control de carga). Se muestran inmunoblots representativos de tres experimentos independientes. (C) La cantidad de fosfo-PKB se cuantificó mediante análisis de escaneo por densitometría y se normalizó utilizando la cantidad total de PKB. Los datos se expresan en unidades arbitrarias, con las células de control miR tratadas con insulina normalizadas a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba ANOVA bidireccional, *p < 0,05 en comparación con las células control miR tratadas con insulina. (D) Los adipocitos 3T3-L1 fueron transfectados con miR-control o miR-34a. El medio se cambió 24 h después de la transfección, y luego, 48 h más tarde, el medio se cambió al medio de agotamiento durante 6 h. Luego, las células fueron tratadas con insulina de 0,5 nM durante 20 min. La absorción de(2-3H)desoxiglucosa se midió durante 3 min. Los datos se expresan en unidades arbitrarias, con la absorción basal de glucosa en las células tratadas con control miR normalizada a 1. Los resultados se expresan como la media + SEM de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba ANOVA bidireccional, *p < 0,05 en comparación con las células control miR tratadas con insulina. Abreviaturas: si-SCR = siRNA revuelto; si-PLIN1 = siRNA contra Plin1; SEM = error estándar de la media; PKB = proteína quinasa B; p-PKB = fósforo-PKB; miR-CTL = miR-control; DMEM = Medio de Eagle modificado de Dulbecco; BSA = albúmina sérica bovina; ANOVA = análisis de varianza; IB = inmunoblotting. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Por pozo (placa de 12 pozos) | Por pozo (placa de 24 pozos) | |
| Oligonucleótidos | 20 μL | 10 μL |
| (si-ARN, miR...) | ||
| Medio esencial mínimo mejorado | 20 μL | 10 μL |
| Reactivo de transfección | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Medio esencial mínimo mejorado | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Volumen total de la mezcla de transfección | 200 μL | 100 μL |
Tabla 1: Reactivos de transfección necesarios para los formatos de placa de 12 y 24 pozos.
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Discussion
Este trabajo presenta un protocolo detallado para la diferenciación y transfección de adipocitos maduros. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos como, entre otros, siRNAs, imitadores de micro-ARN y anti-micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, que es una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Este método tiene algunas limitaciones que deben considerarse. Este protocolo no es eficiente para la transfección con ADN plásmido, lo que limita la utilidad de esta técnica para estudios de ganancia de función. Aunque las líneas celulares murinas, incluida la línea celular 3T3-L1, se han utilizado típicamente para estudiar la función de los adipocitos in vitro, los patrones de expresión de microARN y las actividades en el tejido murino a menudo son diferentes de los observados en humanos; este es también el caso de las células primarias y las líneas celulares. Además, el medio utilizado para la diferenciación de fibroblastos 3T3-L1 en adipocitos requiere un cóctel hormonal no psicológico (insulina, dexametasona, IBMX y rosiglitazona), y las células diferenciadas son morfológicamente distintas de los adipocitos maduros in vivo: presentan gotas lipídicas multiloculares en lugar de una gota lipídica unilocular. Esto podría explicar algunas diferencias en la expresión génica y las respuestas celulares entre los estudios in vitro e in vivo.
Un beneficio de usar este protocolo de transfección inversa en comparación con la electroporación es que este método es más barato. De hecho, los reactivos son menos costosos, y la alta eficiencia de la transfección inversa disminuye las cantidades de oligonucleótidos necesarios, y no hay necesidad de equipos costosos como un electroporador. Además, el uso de una menor concentración de siRNA es beneficioso, ya que evita efectos fuera del objetivo. Además, esta transfección inversa es un método de transfección fácil, rápido, suave y directo que requiere menos células y garantizará una excelente viabilidad celular y datos más robustos en comparación con la electroporación. Aunque el procedimiento detallado anteriormente se ha optimizado para la diferenciación y transfección inversa de células 3T3-L1 de ratón, los preadipocitos humanos también se pueden diferenciar en adipocitos5 y someterse fácilmente a transfección inversa utilizando este protocolo. Este informe muestra que los adipocitos siguen siendo viables, sanos y responden a la insulina después de la transfección inversa utilizando una nueva generación de un reactivo de transfección anfifílica catiónica no liposomal. La transfección inversa también podría realizarse utilizando otros reactivos de transfección populares. Sin embargo, las cantidades de oligonucleótidos y reactivos de transfección tendrían que optimizarse para garantizar una buena modulación de la expresión y sin efectos adversos sobre la viabilidad celular.
Este protocolo facilita el estudio del papel de las proteínas y los micro-ARN en la función de los adipocitos, pero también podría usarse para modular otros ARN no codificantes como los ARN-LN, los ARN-Y o los ARNe. Hay pasos críticos en el protocolo que pueden afectar la eficiencia del procedimiento. La diferenciación de los fibroblastos 3T3-L1 en adipocitos debe ser monitoreada cuidadosamente. Es importante alcanzar un alto nivel de diferenciación para evitar la proliferación de fibroblastos restantes después de la transfección, lo que sesgaría los resultados del experimento. Otro punto importante es realizar la transfección sobre adipocitos maduros recién diferenciados; el mejor momento es 7-8 días después del inicio del protocolo de diferenciación, que corresponde a 3-4 días después de eliminar el cóctel de diferenciación. Esto asegurará una eficacia de transfección robusta y favorecerá una buena reensociación de los adipocitos a la placa. Finalmente, el tratamiento de los adipocitos con tripsina debe ser monitoreado cuidadosamente para asegurar el desprendimiento de los adipocitos sin dañar las células.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, la Université Côte d'Azur y la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través del programa Inversiones para el futuro Laboratorio de Excelencia (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelencia (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. cuenta con el apoyo de subvenciones de la Société Francophone du Diabète (SFD), la Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), el Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) y la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. cuenta con el apoyo de ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. cuenta con el apoyo de la subvención ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 y una subvención de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). También agradecemos la Instalación Central de Imágenes de C3M financiada por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imágenes GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
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- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
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