Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Summary

Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.

Abstract

L’altération de la fonction adipocytaire contribue à la pathogenèse des maladies métaboliques, y compris le diabète de type 2 et la résistance à l’insuline. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. La modulation de l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes reste très difficile. Cet article décrit un protocole pour différencier les fibroblastes murins en adipocytes matures et pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes matures par transfection inverse en utilisant des oligonucléotides imitant l’ARN (siRNA) et le micro-ARN (miR mimic). Ce protocole de transfection inverse implique l’incubation du réactif de transfection et des oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire à laquelle les adipocytes matures sont ajoutés. Les adipocytes sont ensuite autorisés à se rattenir à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Des analyses fonctionnelles telles que l’étude de la signalisation de l’insuline, de l’absorption du glucose, de la lipogenèse et de la lipolyse peuvent être effectuées sur les adipocytes matures 3T3-L1 transfectés pour étudier l’impact de la manipulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire.

Introduction

L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour de nombreuses maladies métaboliques, y compris la résistance à l’insuline (RI), le diabète de type 2 (DT2) et les maladies^{cardiovasculaires 1.} Les thérapies actuelles n’ont pas réussi à arrêter la prévalence sans cesse croissante de ces maladies, et la prise en charge de l’IR des patients obèses et diabétiques reste un problème clinique important. Le tissu adipeux joue un rôle crucial dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, et son expansion pathologique pendant l’obésité contribue au développement de l’IR et du DT2D2,³

Protocol

REMARQUE: Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes du protocole dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et l’équipement.

1. Différenciation des fibroblastes murins 3T3-L1 en adipocytes

1. Cultiver les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 mm en milieu de culture DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1A). Placer les plats dans un incubateur de culture tissulaire (7% de CO₂ et 37 °C).....

Results

En utilisant la procédure de transfection inverse décrite ici pour moduler l’expression de protéines ou de micro-ARN dans les adipocytes 3T3-L1, il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection (Figure 1B,C). En effet, 2 jours après la transfection, les adipocytes étaient bien étalés et attachés à la plaque et présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires qui sont une caractéristique des adipoc.......

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé pour la différenciation et la transfection des adipocytes matures. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides tels que, mais sans s’y limiter, les siRNA, les imitations de micro-ARN et les anti-micro-ARN en adipocytes 3T3-L1, qui est l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. Cette méthode présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Ce protocole n’est pas .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque de culture tissulaire à 12 puits	Dutscher	353043
2,5 % de trypsine (10x)	Gibco	15090-046	diluée à 5x avec D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-méthylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A7030
Collagène de type I de la peau de veau	Sigma-Aldrich	C8919
Dexaméthasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco’s  ; Milieu Eagles modifié (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L de D-glucose ; L-Glutamine ; pas de pyruvate
Éthanol	Sigma	51976
Témoin négatif si-RNA marqué FAM	Invitrogen	AM4620
Sérum de veau fœtal	Gibco	10270-106
Réactif de glycérol libre	Sigma-Aldrich	F6428
Solution étalon de glycérol	Anticorps Sigma-Aldrich	G7793
HSP90	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 & micro ; g/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insuline humaine recombinante	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-ARN imite Horizon	Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Dosages Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Souris Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Pénicilline et streptomycine	Gibco	15140-122
Anticorps contre la périlipine-1	Signalisation cellulaire	3470	Dilution : 1/1000
Boîte de Pétri 100 mm x 20 mm Anticorps	Dutscher	353003
PKB	Signalisation cellulaire	9272	Dilution : 1/1000
Cellule d’anticorps PKB Phospho Thr308	Signalisation	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Réactif de transfection (INTERFERin)	Polyplus	409-10
&alpha ;-tubuline	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µ ; g/mL
d’anticorps Vamp2	R& D Systems	MAB5136	dilution : 0,1 & micro ; g/mL