Summary
Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.
Abstract
L’altération de la fonction adipocytaire contribue à la pathogenèse des maladies métaboliques, y compris le diabète de type 2 et la résistance à l’insuline. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. La modulation de l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes reste très difficile. Cet article décrit un protocole pour différencier les fibroblastes murins en adipocytes matures et pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes matures par transfection inverse en utilisant des oligonucléotides imitant l’ARN (siRNA) et le micro-ARN (miR mimic). Ce protocole de transfection inverse implique l’incubation du réactif de transfection et des oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire à laquelle les adipocytes matures sont ajoutés. Les adipocytes sont ensuite autorisés à se rattenir à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Des analyses fonctionnelles telles que l’étude de la signalisation de l’insuline, de l’absorption du glucose, de la lipogenèse et de la lipolyse peuvent être effectuées sur les adipocytes matures 3T3-L1 transfectés pour étudier l’impact de la manipulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire.
Introduction
L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour de nombreuses maladies métaboliques, y compris la résistance à l’insuline (RI), le diabète de type 2 (DT2) et les maladiescardiovasculaires 1. Les thérapies actuelles n’ont pas réussi à arrêter la prévalence sans cesse croissante de ces maladies, et la prise en charge de l’IR des patients obèses et diabétiques reste un problème clinique important. Le tissu adipeux joue un rôle crucial dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, et son expansion pathologique pendant l’obésité contribue au développement de l’IR et du DT2D2,3. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. De nombreuses études ont étudié le rôle des ARN codant pour les protéines dans la physiologie des adipocytes et leur association avec l’obésité.
Plus récemment, la découverte d’ARN non codants (ARNnc), en particulier de micro-ARN (miR), a forgé de nouveaux concepts liés au mécanisme de régulation des programmes d’expression génique. Des études ont montré que les ARNnc sont d’importants régulateurs de la fonction adipocytaire, et que leur dérèglement joue un rôle important dans les maladies métaboliques4. Ainsi, la manipulation des protéines et des ARNnc dans les adipocytes est cruciale pour déchiffrer leurs rôles dans la fonction adipocytaire et leur impact sur des pathologies telles que le DT2. Cependant, la manipulation de l’expression des protéines et des ARNnc in vivo ainsi que dans les adipocytes primaires reste très difficile, favorisant l’utilisation de modèles adipocytaires in vitro.
Les fibroblastes murins 3T3-L1 se différencient facilement en adipocytes matures, fonctionnels et sensibles à l’insuline, qui sont une lignée cellulaire bien caractérisée utilisée pour étudier la fonction adipocytaire (par exemple, la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipolyse et la sécrétion d’adipokines)5,6,7,8,9,10. Ces propriétés font des adipocytes 3T3-L1 un modèle attrayant pour moduler l’expression des protéines codant et des ARN nc afin de déchiffrer leur rôle dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité. Malheureusement, alors que les fibroblastes 3T3-L1 sont faciles à transfecter à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce, les adipocytes 3T3-L1 différenciés sont l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. C’est pourquoi de nombreuses études manipulant l’expression des gènes dans les cellules 3T3-L1 se sont concentrées sur la différenciation des adipocytaires plutôt que sur la fonction adipocytaire.
Pendant longtemps, la seule technique efficace pour transfecter les adipocytes était l’électroporation5, qui est fastidieuse, coûteuse et peut causer des dommages cellulaires. Cet article rapporte une technique de transfection inverse utilisant un réactif de transfection commun, qui réduit le temps de transfection pratique, n’a aucun effet sur la viabilité cellulaire et est beaucoup moins coûteuse que l’électroporation. Ce protocole est parfaitement adapté à la transfection de siRNA et d’autres oligonucléotides tels que les mimiques de micro-ARN (miR mimics) et les anti-miR. Le principe du protocole de transfection inverse est d’incuber le réactif de transfection et les oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire, puis d’ensemencer les adipocytes matures dans les puits. Ensuite, les adipocytes se rattachent à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Cette méthodologie simple, efficace et peu coûteuse permet d’étudier le rôle des ARN et des miR codant pour les protéines dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité.
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Protocol
REMARQUE: Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes du protocole dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et l’équipement.
1. Différenciation des fibroblastes murins 3T3-L1 en adipocytes
- Cultiver les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 mm en milieu de culture DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1A). Placer les plats dans un incubateur de culture tissulaire (7% de CO2 et 37 °C).
- Deux jours après la confluence, changer le milieu de culture, en remplaçant par du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 1 % de pénicilline et de streptomycine complétées par 0,25 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 0,25 μM de dexaméthasone, 5 μg/mL d’insuline et 10 μM de rosiglitazone.
REMARQUE: Il faut 5 jours pour atteindre la confluence lorsque les cellules sont ensemencées à 300 000 cellules par plat de 100 mm. - Deux jours plus tard, remplacer le milieu de culture par du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine complétées par 5 μg/mL d’insuline et 10 μM de rosiglitazone et incuber pendant 2 jours. Ensuite, nourrissez les cellules tous les 2 jours avec du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% FCS, et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1B).
- Transfecter les adipocytes 3T3-L1 7-8 jours après le début du protocole de différenciation.
NOTE: Il est important d’atteindre un niveau élevé de différenciation (>80%) avant la transfection pour éviter la prolifération des fibroblastes restants après la transfection, ce qui conduirait à une population mixte de cellules qui pourrait biaiser les résultats.
2. Préparation des plaques prélaquées
- La veille ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 μg/mL dans de l’éthanol à 30 % à partir d’une solution type à 1 mg/mL. Ajouter 250 μL de collagène par puits d’une plaque de 12 puits et 125 μL par puits d’une plaque de 24 puits, et étaler la solution sur la surface du puits.
- Laissez la plaque sans couvercle sous la hotte de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Laver deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco.
REMARQUE: Des plaques pré-revêtues sont disponibles à l’achat.
3. Préparation du mélange de transfection
REMARQUE: La concentration finale de siRNA est comprise entre 1 et 100 nM (1 à 100 pmol de siRNA par puits d’une plaque de 12 puits). La concentration finale de l’imitation miR est de 10 nM (10 pmol/puits). Déterminez la meilleure concentration de chaque siRNA, miR mimique ou autre oligonucléotide avant de commencer l’expérience pour éviter les effets hors cible. Effectuer des expériences de transfection en trois exemplaires pour faciliter l’analyse statistique des résultats. Préparez tous les réactifs en excès pour tenir compte de la perte normale pendant le pipetage.
- Mélanger par pipetage (volume/volume) le siRNA (ou d’autres oligonucléotides) avec un milieu essentiel minimal amélioré(tableau 1). Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi, et pipeter pour mélanger (Tableau 1). Incuber pendant 20 min à température ambiante (pendant ce temps, passer à la section 4). Ajouter le mélange de transfection à chaque puits de la plaque enduite de collagène.
4. Préparation des adipocytes 3T3-L1
- Lavez les cellules dans la boîte de Petri de 100 mm deux fois avec du D-PBS. Ajouter 5x trypsine aux cellules (1 mL par plat de 100 mm), en veillant à couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 s et retirez soigneusement la trypsine.
- Incuber la boîte de Petri pendant 5-10 min à 37 °C dans l’incubateur. Appuyez sur le plat de 100 mm pour détacher les cellules.
- Ajouter 10 ml de DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de FCS et 1% de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine. Pipetez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire.
- Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur de cellules automatisé et ajustez la concentration des cellules à 6,25 x10 5 cellules/mL de milieu. Ensemencer 800 μL de la suspension/puits cellulaire d’une plaque de 12 puits (5 x10 5 cellules) ou 400 μl de la suspension cellulaire/puits d’une plaque de 24 puits (2,5 x 105 cellules) contenant le mélange de transfection.
REMARQUE: Une boîte de Petri de 100 mm d’adipocytes permettra la préparation d’une plaque de 12 puits ou d’une plaque de 24 puits. Un plat de 100 mm contient généralement 6-7 x 106 adipocytes, ce qui correspond à 5 x 105 adipocytes par puits d’une plaque de 12 puits. - Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (7% de CO2 et 37 °C), et ne pas perturber les cellules pendant 24 h. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de FCS et 1% de pénicilline et de streptomycine.
REMARQUE: Il est également possible d’ensemencer les cellules dans des plaques de 48 et 96 puits précoucheuses de collagène, mais prenez plus de précautions lors du remplacement du milieu pour éviter le détachement des adipocytes.
5. Analyse fonctionnelle des adipocytes 3T3-L1 transfectés
- L’étude cible knockdown 24-48 h et 48-96 h après l’administration d’ARNs ou de miR pour l’ARNm et la protéine, respectivement.
- Effectuer des analyses fonctionnelles des adipocytes transfectés pour étudier la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la sécrétion d’adipokine, la lipolyse et la lipogenèse.
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Representative Results
En utilisant la procédure de transfection inverse décrite ici pour moduler l’expression de protéines ou de micro-ARN dans les adipocytes 3T3-L1, il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection (Figure 1B,C). En effet, 2 jours après la transfection, les adipocytes étaient bien étalés et attachés à la plaque et présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires qui sont une caractéristique des adipocytes matures 3T3-L1. La teneur en lipides n’était pas différente entre les adipocytes transfectés et non transfectés (Figure 1D, E). De plus, l’expression de l’ARNm de marqueurs de différenciation tels que le récepteur gamma 2 activé par les proliférateurs de peroxysomes(Pparγ2),l’adiponectine (Adipoq),le transporteur de glucose 4 ou la famille de porteurs de solutés 2 membres 4 (Slc2a4), le substrat du récepteur de l’insuline1( Irs1 ), la perilipine-1(Plin1)était inchangée dans les cellules transfectées par rapport à celle des adipocytes non transfectés(Figure 1F). Ce protocole de transfection inverse est efficace car >70% des adipocytes ont été transfectés(Figure 1G,H).
La pérililipine-1 est une protéine spécifique des adipocytaires connue pour favoriser la formation de gouttelettes lipidiques et inhiber la lipolyse. Ici, les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec du siRNA brouillé (si-SCR) ou du siRNA contre Plin1 (si-PLIN1). Trois jours après la transfection avec si-PLIN1, le taux d’ARNm de Plin1 avait diminué de 70 % (Figure 2A) et le niveau de protéines de 63 % (Figure 2B,C). L’expression de PLIN1 a également été analysée par microscopie à fluorescence 4 jours après la transfection et s’est avérée avoir diminué de 92% par rapport à son expression dans les adipocytes témoins(Figure 2D-F),démontrant ainsi l’efficacité du protocole de transfection et du si-PLIN1.
Ce protocole a également été utilisé pour effectuer une transfection inverse des adipocytes avec des oligonucléotides imitant le micro-ARN (miR mimics) afin de régularier à la hausse l’expression de miR-34a(Figure 3A). La surexpression de miR-34a a entraîné une diminution de l’expression de la protéine VAMP2 de 50%(Figure 3B,C),une cible confirmée de miR-34a11,12. Enfin, cette étude montre que la transfection inverse des adipocytes 3T3-L1 préserve leur fonction et leur réactivité à la stimulation de l’insuline. En effet, l’élimination de Plin1 dans les adipocytes 3T3-L1 a entraîné une augmentation de la lipolyse basale(Figure 4A). De plus, la surexpression de miR-34a dans les adipocytes 3T3-L1 a conduit à l’inhibition de la phosphorylation de la protéine kinase B induite par l’insuline(Figure 4B,C)et de l’absorption du glucose(Figure 4D).
Figure 1 : Différenciation des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes matures. (A) Les fibroblastes 3T3-L1 ont été ensemencés à une densité de 3 x 105 cellules par plat de 100 mm. Image représentative en champ lumineux 10x des fibroblastes 3T3-L1 2 jours plus tard. (B) Deux jours après la confluence (jour 0), les fibroblastes 3T3-L1 ont été différenciés en adipocytes à l’aide d’un mélange de cocktail de différenciation pendant 4 jours (jusqu’au jour 4). Image représentative en champ lumineux 10x de fibroblastes 3T3-L1 différenciés en adipocytes (jour 7). Les adipocytes avec des gouttelettes lipidiques multiloculaires sont facilement discernables. (C) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés par si-SCR le jour 7. Images représentatives 10x en champ clair d’adipocytes 3T3-L1 transfectés (jour 9). La morphologie des adipocytes transfectés est comparable à celle des adipocytes non transfectés, ce qui implique que la méthode de transfection est douce et non toxique pour les adipocytes. Barres d’échelle: 50 μm. (D–E) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec si-SCR le jour 7 (panneaux supérieurs); adipocytes non transfectés (panneaux inférieurs). Deux jours plus tard, les cellules ont été incubées avec de l’huile Red O pour tacher les lipides. (D) Des images représentatives des cellules colorées dans la plaque et des images représentatives 10x en champ clair sont montrées. Barres d’échelle: 50 μm. (E) L’huile Rouge O incorporée dans les cellules a été éluée avec du 2-propanol et quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre. Les données sont exprimées en unités arbitraires, l’absorbance des cellules non transfectées faisant l’objet d’une normalisation à 1. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + MEB de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée par le test tde Student. (F) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec si-SCR. Trois jours après la transfection, les cellules ont été prélevées pour isoler l’ARN total. L’expression des marqueurs de différenciation adipocytaire a été mesurée par qRT-PCR et normalisée à l’aide de niveaux d’ARN 36B4. Les données représentent l’expression de l’ARNm dans les cellules transfectées par rapport à celle des cellules non transfectées (normalisées à 1, représentées par la ligne pointillée) et sont exprimées comme la moyenne + SEM de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée par le test tde Student. (G–H) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec du si-SCR ou un colorant fluorescent (FAM) marqué si-ARN et plaqués sur des couvercles. Les adipocytes 3T3-L1 ont été analysés 8 heures plus tard par microscopie à fluorescence. (G) Une image mono-plan représentative des cellules 3T3-L1 transfectées est montrée. (H) Quantification des cellules FAM positives par rapport au nombre total de cellules. Les données sont exprimées en pourcentage de cellules contenant de l’ARN si fluorescent. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test de Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abréviations : si-SCR = siRNA brouillé ; SEM = erreur-type de la moyenne; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative par polymérase à transcription inverse; FAM = fluorescéine amidite; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; si-FAM = SI-ARN marqué par FAM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Silençage des protéines dans les adipocytes 3T3-L1. Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec du si-ARN brouillé (si-SCR) ou du si-ARN contre Plin1 (si-PLIN1). (A) Trois jours après la transfection, l’expression de l’ARNm de Plin1 a été mesurée par qRT-PCR. L’expression de l’ARNm a été normalisée à l’aide de niveaux d’ARN 36B4 et exprimée en unités arbitraires, les cellules traitées au si-SCR faisant l’effet normalisées à 1. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + SEM de quatre expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test tde Student, **p < 0,01. (B–C) Trois jours après la transfection, les lysates de protéines ont été soumis à un transfert western avec des anticorps dirigés contre PLIN1 et HSP90 (contrôle de la charge). Des immunoblots représentatifs sont montrés. (C) La quantité de PLIN1 a été quantifiée par analyse de densitométrie et normalisée à l’aide de la quantité de HSP90. Les données sont exprimées en unités arbitraires, les cellules traitées au si-SCR faisant l’une de la 1. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + SEM de quatre expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test tde Student, *p < 0,05. (D–F) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec si-SCR ou si-PLIN1 et plaqués sur des couvercles. L’expression de PLIN1 a été analysée 96 h plus tard par microscopie à fluorescence. (D) Des images mono-plan représentatives d’adipocytes 3T3-L1 colorés avec un anticorps anti-périilipine et un anticorps conjugué anti-lapin-Alexa647 sont montrées. Barres d’échelle = 10 μm. (E) Rendu volumique tridimensionnel (3D) des adipocytes 3T3-L1 segmentés en 3D à l’aide d’un logiciel commercial. Barres d’échelle = 10 μm. (F) Quantification de l’intensité du signal PLIN1 par rapport au nombre total de cellules. Les données sont exprimées en unités arbitraires, les cellules traitées au si-SCR faisant l’une de la 100 %. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test de Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abréviations : si-SCR = siRNA brouillé ; si-PLIN1 = siRNA contre Plin1; Plin1 = périlipine-1; HSP90 = protéine de choc thermique 90; SEM = erreur-type de la moyenne; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative par polymérase à transcription inverse; FAM = fluorescéine amidite; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; IB = immunoblotting. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : surexpression du micro-ARN dans les adipocytes 3T3-L1. Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec un mimique de micro-ARN de contrôle (miR-control) ou un micro-ARN 34a mimétique (miR-34a). Trois jours après la transfection, les cellules ont été récoltées pour l’extraction de l’ARN(A)ou(B)la préparation de lysates de protéines. (A) L’expression de miR-34a a été mesurée par qRT-PCR. L’expression de miR a été normalisée à l’aide de petits niveaux d’ARN U6 et exprimée en unités arbitraires, les cellules traitées par miR-contrôle faisant l’effet normalisés à 1. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + MEB de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test tde Student, *p < 0,05. (B) Les lysates de protéines ont été soumis à un transfert western avec des anticorps dirigés contre VAMP2 et TUBULIN (contrôle de la charge). Des immunoblots représentatifs de trois expériences indépendantes sont montrés. (C) La quantité de VAMP2 a été quantifiée par analyse de densitométrie et normalisée à l’aide de la quantité de TUBULIN. Les données sont exprimées en unités arbitraires, les cellules miR-témoins 1 faisant l’un de l’autre. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + MEB de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée par le test t-de Student, *p < 0,05. Abréviations : SEM = erreur-type de la moyenne ; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative par polymérase à transcription inverse; VAMP2 = protéine membranaire associée aux vésicules 2; IB = immunoblotting. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effets de la modulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire 3T3-L1. (A) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec si-SCR ou si-PLIN1. Le milieu a été changé 24 h après la transfection, puis recueilli 48 h plus tard pour mesurer la lipolyse basale. Les résultats sont exprimés sous forme de glycérol libéré dans le milieu (μg/mL) et sous forme de moyenne + MEB de quatre expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test tde Student, ***p < 0,001. (B) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec miR-control ou miR-34a. Le milieu a été changé 24 h après la transfection, puis, 48 h plus tard, le milieu a été changé en milieu d’épuisement (DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 1 % de pénicilline et de streptomycine, et 0,5 % de BSA) pendant 6 h. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 0,5 nM d’insuline pendant 5 min. Des cellules ont été récoltées pour préparer des lysates de protéines pour le transfert western avec des anticorps dirigés contre le phospho-PKB et le PKB (contrôle de la charge). Des immunoblots représentatifs de trois expériences indépendantes sont montrés. (C) La quantité de phospho-PKB a été quantifiée par analyse de densitométrie et normalisée en utilisant la quantité totale de PKB. Les données sont exprimées en unités arbitraires, les cellules miR-témoins traitées avec de l’insuline faisant l’emploi faisant l’emploi normalisées à 1. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + MEB de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test ANOVA bidirectionnel, *p < 0,05 par rapport aux cellules miR-témoins traitées à l’insuline. (D) Les adipocytes 3T3-L1 ont été transfectés avec miR-control ou miR-34a. Le support a été changé 24 h après la transfection, puis, 48 h plus tard, le milieu a été changé en milieu d’épuisement pendant 6 h. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 0,5 nM d’insuline pendant 20 min. L’absorption de(2-3H)désoxyglucose a été mesurée sur 3 min. Les données sont exprimées en unités arbitraires, l’absorption basale du glucose dans les cellules traitées par miR-control pouvant être normalisée à 1. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne + MEB de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test ANOVA bidirectionnel, *p < 0,05 par rapport aux cellules miR-témoins traitées à l’insuline. Abréviations : si-SCR = siRNA brouillé ; si-PLIN1 = siRNA contre Plin1; SEM = erreur-type de la moyenne; PKB = protéine kinase B; p-PKB = phosphore-PKB; miR-CTL = miR-control; DMEM = milieu d’Eagle modifié de Dulbecco; BSA = albumine sérique bovine; ANOVA = analyse de la variance; IB = immunoblotting. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Par puits (plaque de 12 puits) | Par puits (plaque de 24 puits) | |
| Oligonuclétides | 20 μL | 10 μL |
| (si-ARN, miR...) | ||
| Minimal Essential Medium amélioré | 20 μL | 10 μL |
| Réactif de transfection | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Minimal Essential Medium amélioré | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Volume total du mélange de transfection | 200 μL | 100 μL |
Tableau 1 : Réactifs de transfection requis pour les formats de plaques à 12 et 24 puits.
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Discussion
Cet article présente un protocole détaillé pour la différenciation et la transfection des adipocytes matures. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides tels que, mais sans s’y limiter, les siRNA, les imitations de micro-ARN et les anti-micro-ARN en adipocytes 3T3-L1, qui est l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. Cette méthode présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Ce protocole n’est pas efficace pour la transfection avec de l’ADN plasmidique, ce qui limite l’utilité de cette technique pour les études de gain de fonction. Bien que les lignées cellulaires murines, y compris la lignée cellulaire 3T3-L1, aient été généralement utilisées pour étudier la fonction adipocytaire in vitro, les modèles et les activités d’expression des micro-ARN dans le tissu murin sont souvent différents de ceux observés chez l’homme; c’est également le cas des cellules primaires et des lignées cellulaires. De plus, le milieu utilisé pour la différenciation du fibroblaste 3T3-L1 en adipocytes nécessite un cocktail d’hormones nonphysiologiques (insuline, dexaméthasone, IBMX et rosiglitazone), et les cellules différenciées sont morphologiquement distinctes des adipocytes matures in vivo : elles présentent des gouttelettes lipidiques multiloculaires au lieu d’une gouttelette lipidique uniloculaire. Cela pourrait expliquer certaines différences dans l’expression des gènes et les réponses cellulaires entre les études in vitro et in vivo.
L’un des avantages de l’utilisation de ce protocole de transfection inverse par rapport à l’électroporation est que cette méthode est moins chère. En effet, les réactifs sont moins chers, et la grande efficacité de la transfection inverse diminue les quantités d’oligonucléotides nécessaires, et il n’y a pas besoin d’équipements coûteux tels qu’un électroporateur. De plus, l’utilisation d’une concentration plus faible de siRNA est bénéfique car elle évite les effets hors cible. De plus, cette transfection inverse est une méthode de transfection facile, rapide, douce et simple qui nécessite moins de cellules et assurera une excellente viabilité cellulaire et des données plus robustes par rapport à l’électroporation. Bien que la procédure détaillée ci-dessus ait été optimisée pour la différenciation et la transfection inverse des cellules 3T3-L1 de souris, les préadipocytes humains peuvent également être différenciés en adipocytes5 et facilement soumis à une transfection inverse en utilisant ce protocole. Ce rapport montre que les adipocytes restent viables, sains et sensibles à l’insuline après la transfection inverse en utilisant une nouvelle génération d’un réactif de transfection amphiphile cationique non liposomale. La transfection inverse pourrait également être effectuée à l’aide d’autres réactifs de transfection populaires. Cependant, les quantités d’oligonucléotides et de réactif de transfection devraient être optimisées pour assurer une bonne modulation de l’expression et aucun effet néfaste sur la viabilité cellulaire.
Ce protocole facilite l’étude du rôle des protéines et des micro-ARN dans la fonction adipocytaire, mais il pourrait également être utilisé pour moduler d’autres ARN non codants tels que les ARN lnc, les ARN Y ou les ARNe. Il y a des étapes critiques dans le protocole qui peuvent avoir un impact sur l’efficacité de la procédure. La différenciation des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes doit être surveillée attentivement. Il est important d’atteindre un haut niveau de différenciation pour éviter la prolifération des fibroblastes restants après la transfection, ce qui biaiserait les résultats de l’expérience. Un autre point important est d’effectuer la transfection sur des adipocytes matures nouvellement différenciés; le meilleur moment est de 7 à 8 jours après le début du protocole de différenciation, ce qui correspond à 3 à 4 jours après la suppression du cocktail de différenciation. Cela assurera une efficacité de transfection robuste et favorisera une bonne réattachement des adipocytes à la plaque. Enfin, le traitement des adipocytes avec de la trypsine doit être surveillé attentivement pour assurer le détachement des adipocytes sans endommager les cellules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par l’INSERM, l’Université Côte d’Azur et l’Agence nationale de la recherche (ANR) Français à travers les programmes Investissements pour le futur Laboratoire d’Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) et Initiative d’Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. est soutenu par des subventions de la Société Francophone du Diabète (SFD), de l’Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), de l’Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) et de la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. est pris en charge par ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. est soutenu par la bourse ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 et une subvention de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Nous remercions également le Centre Central d’Imagerie du C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, qui est également soutenu par la Plateforme de Microscopie et d’Imagerie GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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