Summary
يقدم هنا بروتوكول لتسليم أوليغونوكليوتيدات مثل الحمض النووي الريبي (siRNA) صغير التدخل ، أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (miRs) ، أو الحمض النووي الريبي المضاد للميكروبات (anti-miR) في الخلايا الدهنية الناضجة لتعديل البروتين والتعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق.
Abstract
تغيير وظيفة adipocyte يساهم في الإمراض من أمراض التمثيل الغذائي بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 ومقاومة الأنسولين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. تعديل التعبير عن البروتينات والرنانات الدقيقة في الخلايا الدهنية لا يزال تحديا كبيرا. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الليفية المورينية إلى خلايا شحمية ناضجة وتعديل التعبير عن البروتينات والحمى الريبية الدقيقة في الخلايا الدهنية الناضجة من خلال العدوى العكسية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير التدخل (siRNA) وتقليد الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد miR) أوليغونوكليوتيدات. يتضمن بروتوكول العدوى العكسي هذا احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مركب في لوحة زراعة الخلية التي تضاف إليها الخلايا الدهنية الناضجة. ثم يسمح للخلايا الشحمية بإعادة ربطها بسطح اللوحة الملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات /ترانسفيكتيون. يمكن إجراء التحليلات الوظيفية مثل دراسة إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، تكوين الدهون ، وانحلال الدهون على الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1 المتحولة لدراسة تأثير التلاعب بالبروتين أو الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة الخلايا الدهنية.
Introduction
تعتبر السمنة عامل خطر رئيسي للعديد من أمراض التمثيل الغذائي، بما في ذلك مقاومة الأنسولين (IR)، داء السكري من النوع 2 (T2D)، وأمراض القلب والأوعية الدموية1. وقد فشلت العلاجات الحالية في وقف الانتشار المتزايد باستمرار لهذه الأمراض ، وإدارة الأشعة تحت الحمراء لمرضى السمنة والسكري لا تزال قضية سريرية هامة. الأنسجة الدهنية تلعب دورا حاسما في السيطرة على التوازن الطاقة، وتوسعها المرضي خلال السمنة يساهم في تطوير الأشعة تحت الحمراء و T2D2،3. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. وقد بحثت العديد من الدراسات البحثية دور الحمض النووي الريبي ترميز البروتين في فسيولوجيا الخلايا الدهنية وارتباطها مع السمنة.
وفي الآونة الأخيرة، أدى اكتشاف الرناس غير الترميزي، ولا سيما الرنانات الصغرى، إلى صياغة مفاهيم جديدة تتعلق بآلية تنظيم برامج التعبير الجيني. وقد أظهرت الدراسات أن ncRNAs هي المنظمين المهمين لوظيفة adipocyte، وأن dysregulation بهم يلعب دورا هاما في أمراض التمثيل الغذائي4. وبالتالي ، فإن التلاعب بالبروتينات وnCRAS في الخلايا الدهنية أمر بالغ الأهمية لفك أدوارها في وظيفة الخلايا الدهنية وتأثيرها على الأمراض مثل T2D. ومع ذلك ، فإن التلاعب في التعبير عن البروتينات وnCRAS في الجسم الحي وكذلك في الخلايا الدهنية الأولية لا يزال صعبا للغاية ، ويفضل استخدام نماذج الخلايا الدهنية في المختبر.
مورين 3T3-L1 الخلايا الليفية تفرق بسهولة إلى الخلايا الدهنية ناضجة، وظيفية، واستجابة للأنسولين، والتي هي خط الخلية ذات الخصائص الجيدة المستخدمة لدراسة وظيفة adipocyte (على سبيل المثال، إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، انحلال الدهون وإفراز الدهون)5،6،7،8،9،10. هذه الخصائص تجعل 3T3-L1 adipocytes نموذجا جذابا لتعديل التعبير عن البروتين الترميز وNNC-RNAs لفك دورها في وظيفة الدهون ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة. لسوء الحظ ، في حين أن الخلايا الليفية 3T3-L1 سهلة التحميب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، فإن الخلايا الدهنية 3T3-L1 المتمايزة هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا هو السبب في أن العديد من الدراسات التي تتلاعب بالتعبير الجيني في خلايا 3T3-L1 ركزت على تمايز الخلايا الدهنية بدلا من التركيز على وظيفة الخلايا الدهنية.
لفترة طويلة ، كانت التقنية الفعالة الوحيدة لخلايا الدهون المتحولة هي الكهربورات5، وهي مملة ومكلفة ويمكن أن تسبب تلفا في الخلايا. تشير هذه الورقة إلى تقنية عكس العدوى باستخدام كاشف العدوى الشائع ، مما يقلل من الوقت العملي للإصابة ، وليس له أي تأثير على صلاحية الخلية ، وهو أقل تكلفة بكثير من الإلكتربو. هذا البروتوكول مناسب تماما لإصابة سيرنا وغيرها من أوليغونوكليوتيدات مثل محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد مير) ومكافحة مير. مبدأ بروتوكول عكس العدوى هو احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مجمع في لوحة ثقافة الخلية ومن ثم زرع الخلايا الدهنية الناضجة في الآبار. ثم، إعادة ربط الخلايا الشحمية إلى سطح لوحة ملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات / العدوى. تسمح هذه المنهجية البسيطة والفعالة وغير المكلفة بدراسة دور الحمض النووي الريبي وترميز البروتين وmiRs في وظيفة الخلايا الدهنية ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: استخدام تقنيات عقيمة لتنفيذ كافة الخطوات من البروتوكول في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلايا تدفق صفح. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف والمعدات.
1. التمايز من الخلايا الليفية مورين 3T3-L1 في الخلايا الدهنية
- تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أطباق 100 ملم في الثقافة متوسطة-DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ مصل العجل حديثي الولادة، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1A). ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة (7٪ CO2 و 37 درجة مئوية).
- بعد يومين من التقاء، تغيير المتوسطة الثقافة، والاستعاضة عن DMEM دون بيروفات، 25 مليون جلوكوز، 10٪ مصل عجل جنيني (FCS)، و1٪ بنسلين وستريبتومايسين مع تكملة 0.25 م 3-إيزابيل-1-ميثيل إكسانثين (IBMX)، 0.25 ميكرومتر ديكساميثازون، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، و10 ميكرومتر روزيجليتازون.
ملاحظة: يستغرق 5 أيام للوصول إلى التقاء عندما يتم بذر الخلايا في 300،000 خلية لكل طبق 100 ملم. - بعد يومين، استبدل الوسط الثقافي ب DMEM بدون بيروفاتي، 25 مليون جلوكوز، 10٪ FCS، و1٪ البنسلين والستريبتوميسين المكمل ب 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين و10 ميكرومتر روزيجليتازون واحتضان لمدة يومين. ثم، تغذية الخلايا كل يومين مع DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ FCS، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1B).
- ترانسفيكت الخلايا الدهنية 3T3-L1 7-8 أيام بعد بداية بروتوكول التمايز.
ملاحظة: من المهم الوصول إلى مستوى عال من التمايز (>80٪) قبل العدوى لتجنب انتشار الخلايا الليفية المتبقية بعد العدوى، مما يؤدي إلى مجموعة مختلطة من الخلايا التي قد تحيز النتائج.
2. إعداد لوحات precoated
- في اليوم السابق أو قبل ساعات قليلة من العدوى، قم بإعداد محلول من نوع الكولاجين الأول عند 100 ميكروغرام/مل في الإيثانول بنسبة 30٪ من محلول المخزون عند 1 ملغم/مل. أضف 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من طبق من 12 بئرا و125 ميكرولتر لكل بئر من طبق من 24 بئرا ، ونشر المحلول على سطح البئر.
- اترك الطبق بدون الغطاء تحت غطاء الثقافة حتى يجف الكولاجين. اغسل مرتين مع المالحة المخزنة بالفوسفات في دولبيكو (D-PBS).
ملاحظة: تتوفر لوحات مسبقة المعطف للشراء.
3. إعداد مزيج العدوى
ملاحظة: التركيز النهائي للsiRNA بين 1 و 100 nM (1 إلى 100 pmol من siRNA لكل بئر من لوحة 12 جيدا). التركيز النهائي لتقليد مير هو 10 nM (10 pmol / جيدا). تحديد أفضل تركيز لكل سيرنا، تقليد مير، أو oligonucleotide أخرى قبل بدء التجربة لتجنب الآثار خارج الهدف. إجراء تجارب العدوى في ثلاثة نسخ لتسهيل التحليل الإحصائي للنتائج. إعداد جميع الكواشف الزائدة لحساب الخسارة العادية أثناء الأنابيب.
- مزيج عن طريق pipetting (حجم / حجم) سيرنا (أو oligonucleotides أخرى) مع تحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية(الجدول 1). حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة كاشف transfection وتحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية إلى siRNA، وماصة لخلط (الجدول 1). حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (خلال هذا الوقت، انتقل إلى القسم 4). أضف مزيج العدوى إلى كل بئر من الطبق المغلف بالكولاجين.
4. إعداد الخلايا الشحمية 3T3-L1
- غسل الخلايا في طبق بيتري 100 ملم مرتين مع D-PBS. إضافة 5x تريبسين إلى الخلايا (1 مل لكل طبق 100 ملم)، مع التأكد من تغطية كل من السطح مع تريبسين. انتظر لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية التريبسين.
- احتضان طبق بيتري لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. اضغط على طبق 100 مم لفصل الخلايا.
- إضافة 10 مل من DMEM دون بيروفاتي, 25 mM الجلوكوز, 10٪ FCS, و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين لتحييد تريبسين. pipet بعناية المتوسط صعودا وهبوطا لفصل الخلايا وتجانس تعليق الخلية.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد Malassez أو عداد الخلية الآلي، وضبط تركيز الخلايا إلى 6.25 × 105 خلايا / مل من المتوسطة. البذور 800 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر من لوحة 12 جيدا (5 × 105 خلايا) أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر من لوحة 24 جيدا (2.5 × 105 خلايا) التي تحتوي على مزيج العدوى.
ملاحظة: طبق بيتري واحد 100 ملم من الخلايا الدهنية سيسمح بإعداد لوحة واحدة من 12 بئرا أو لوحة واحدة من 24 بئرا. طبق 100 ملم يحتوي عادة على 6-7 × 106 adipocytes، والتي تتوافق مع 5 × 105 الخلايا الدهنية لكل بئر من لوحة 12 جيدا. - احتضان لوحات في حاضنة ثقافة الخلية (7٪ CO2 و 37 درجة مئوية)، وعدم إزعاج الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدال بعناية supernatant مع DMEM الطازجة دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ FCS، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين.
ملاحظة: من الممكن أيضا زرع الخلايا في لوحات 48-و96-well المطلية بالكولاجين ولكن اتخاذ المزيد من الاحتياطات عند استبدال الوسائط لتجنب انفصال الخلايا الدهنية.
5. التحليل الوظيفي للخلايا الشحمية 3T3-L1 المصابة
- دراسة الهدف ضربة قاضية 24-48 ساعة و 48-96 ساعة بعد siRNA أو مير تقليد التسليم لرنا والبروتين، على التوالي.
- إجراء تحليلات وظيفية من الخلايا الدهنية المصابة لدراسة إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، إفراز أديبوكيني، انحلال الدهون، وتولد الدهون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام إجراء عكس transfection وصفها هنا لتعديل التعبير عن البروتينات أو الحمض النووي الريبي الدقيق في 3T3-L1 adipocytes، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بهم بعد العدوى(الشكل 1B،C). في الواقع ، بعد يومين من العدوى ، كانت الخلايا الدهنية منتشرة بشكل جيد ومرفقة بالطبق وقدمت قطرات دهون متعددة الخلايا التي هي سمة من سمات الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1. لم يكن محتوى الدهون مختلفا بين الخلايا الشحمية المتحولة وغير المصابة(الشكل 1D، E). وعلاوة على ذلك، التعبير مرنا علامات التمايز مثل peroxisome التكاثر تنشيط مستقبلات غاما 2 (Pparγ2)، adiponectin (أديبوك)،نقل الجلوكوز 4 أو solute الناقل الأسرة 2 عضو 4 (Slc2a4), الانسولين مستقبلات الركيزة 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) لم يتغير في الخلايا المتحولة مقارنة مع تلك الموجودة في الخلايا الدهنية غير المصابة (الشكل 1F). هذا البروتوكول عكس العدوى فعالة كما >70٪ من الخلايا الدهنية كانت مصابة(الشكل 1G،H).
بيريليبين-1 هو بروتين خاص بالخلايا الدهنية معروف بالترويج لتشكيل قطرات الدهون ويمنع انحلال الدهون. هنا، تم تحويل 3T3-L1 adipocytes مع siRNA مشوشة (si-SCR) أو سيرنا ضد Plin1 (si-PLIN1). بعد ثلاثة أيام من العدوى مع si-PLIN1، انخفض مستوى مرنا Plin1 بنسبة 70٪(الشكل 2A)ومستوى البروتين بنسبة 63٪(الشكل 2B، C). كما تم تحليل التعبير PLIN1 بواسطة المجهر الفلوري بعد 4 أيام من العدوى وتبين أنه قد انخفض بنسبة 92٪ مقارنة بتعبيره في الخلايا الدهنية التحكم(الشكل 2D-F)،مما يدل على فعالية كل من بروتوكول العدوى و si-PLIN1.
كما استخدم هذا البروتوكول لأداء عكس العدوى من الخلايا الدهنية مع محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد مير) أوليغونوكليوتيدات ل upregulate التعبير عن مير-34a (الشكل 3A). أدى التعبير المفرط عن مير-34أ إلى انخفاض في التعبير البروتيني VAMP2 بنسبة 50٪ (الشكل 3B، C)، وهو هدف مؤكد من miR-34a11،12. وأخيرا، تظهر هذه الدراسة أن عكس العدوى من الخلايا الدهنية 3T3-L1 يحافظ على وظيفتها والاستجابة لتحفيز الأنسولين. في الواقع ، أدى ضربة قاضية من Plin1 في 3T3-L1 adipocytes إلى زيادة في انحلال الدهون القاعدية(الشكل 4A). وعلاوة على ذلك، أدى فرط التعبير عن مير-34a في 3T3-L1 adipocytes إلى تثبيط البروتين الناجم عن الأنسولين كيناز B الفوسفور (الشكل 4B،C) وامتصاص الجلوكوز (الشكل 4D).
الشكل 1: تمايز الخلايا الليفية 3T3-L1 إلى خلايا شحمية ناضجة. (أ)تم بذر الخلايا الليفية 3T3-L1 بكثافة 3 × 105 خلايا لكل طبق 100 مم. ممثل 10x صورة برايتفيلد من الخلايا الليفية 3T3-L1 2 أيام في وقت لاحق. (ب)بعد يومين من التقاء (اليوم 0)، تم تمييز الخلايا الليفية 3T3-L1 إلى خلايا شحمية باستخدام مزيج كوكتيل التمايز لمدة 4 أيام (حتى اليوم 4). صورة تمثيلية 10x brightfield من الخلايا الليفية 3T3-L1 المتمايزة إلى خلايا شحمية (اليوم 7). الخلايا الدهنية مع قطرات الدهون متعددة الخلايا يمكن تمييزها بسهولة. (ج)تم تحويل الخلايا الدهنية 3T3-L1 مع si-SCR في اليوم 7. ممثل 10x صور برايتفيلد من الخلايا الدهنية 3T3-L1 المصابة (اليوم 9). مورفولوجيا الخلايا الشحمية المصابة هي مماثلة لتلك التي من الخلايا الشحمية غير المصابة، مما يعني أن طريقة العدوى هو لطيف وليس سامة للخلايا الشحمية. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر (D-E) تم تحويل الخلايا الشحمية 3T3-L1 مع si-SCR في اليوم 7 (الألواح العلوية)؛ الخلايا الشحمية غير المصابة (الألواح السفلية). بعد يومين، تم احتضان الخلايا مع النفط الأحمر O لبقع الدهون. (د)يتم عرض الصور التمثيلية للخلايا الملطخة في لوحة وممثل 10x صور brightfield. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر (E) تم إلتواء الزيت الأحمر O المدمج في الخلايا ب 2-propanol وتم قياسه كميا باستخدام مطياف. يتم التعبير عن البيانات في وحدات عشوائية ، مع تطبيع امتصاص الخلايا غير المصابة إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي من قبل الطالب ر-اختبار. (F)تم تحويل الخلايا الدهنية 3T3-L1 مع si-SCR. بعد ثلاثة أيام من العدوى، تم حصاد الخلايا لعزل الحمض النووي الريبي الكلي. تم قياس التعبير عن علامات التمايز adipocyte بواسطة qRT-PCR وتطبيع باستخدام مستويات الحمض النووي الريبي 36B4. تمثل البيانات تعبير مرنا في الخلايا المتحولة نسبة إلى تلك الموجودة في الخلايا غير المصابة (تطبيع إلى 1، ممثلة بالخط المنقط) ويتم التعبير عنها على أنها متوسط + SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي من قبل الطالب ر-اختبار. (G-H) تم تحويل الخلايا الدهنية 3T3-L1 مع si-SCR أو صبغة الفلورسنت (FAM) المسمى si-RNA ومطلي على الأغطية. 3T3-L1 adipocytes تم تحليلها 8 ح في وقت لاحق عن طريق المجهر الفلوري. (G)صورة تمثيلية أحادية المستوى لخلايا 3T3-L1 المصابة. (H)تحديد كمية الخلايا الإيجابية FAM بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الخلايا التي تحتوي على الفلورسنت si-RNA. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار مان ويتني ، ****ص < 0.0001. المختصرات: si-SCR = سيرنا مشوشة. SEM = خطأ قياسي في المتوسط؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخ العكسي الكمي؛ FAM = الفلورسين أميدايت; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; si-FAM = FAM المسمى si-RNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إسكات البروتين في الخلايا الدهنية 3T3-L1. 3T3-L1 adipocytes تم تحويلها مع تدافعت سي الجيش الملكي النيبالي (si-SCR) أو سي الجيش الملكي النيبالي ضد Plin1 (si-PLIN1). (أ)بعد ثلاثة أيام من العدوى، تم قياس التعبير عن مرنا Plin1 بواسطة qRT-PCR. تم تطبيع التعبير مرنا باستخدام مستويات الحمض النووي الريبي 36B4 وأعرب في وحدات التعسفي، مع الخلايا si-SCR المعالجة تطبيع إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لأربع تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب راختبار ، **ع < 0.01. (B-C) بعد ثلاثة أيام من العدوى، تعرضت lysates البروتين إلى النشاف الغربي مع الأجسام المضادة الموجهة ضد PLIN1 و HSP90 (التحكم في التحميل). تظهر البطانات المناعية التمثيلية. (ج)تم قياس كمية PLIN1 كميا من خلال تحليل المسح الضوئي لقياس الكثافة وتطبيعها باستخدام كمية HSP90. يتم التعبير عن البيانات في وحدات تعسفية ، مع تطبيع الخلايا المعالجة si-SCR إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لأربع تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب راختبار ، *ع < 0.05. (D-F) تم تحويل الخلايا الدهنية 3T3-L1 مع si-SCR أو si-PLIN1 ومطلية على الأغطية. تم تحليل التعبير عن PLIN1 96 ساعة في وقت لاحق عن طريق المجهر الفلوري. (د)تظهر صور تمثيلية من طائرة واحدة من 3T3-L1 adipocytes ملطخة بأجسام مضادة للبيريليبين وأجسام مضادة للأرانب-Alexa647-المقترنة. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (E) ثلاثي الأبعاد (3D) تقديم حجم 3T3-L1 adipocytes مجزأة في 3D باستخدام البرمجيات التجارية. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (F) قياس كمية كثافة إشارة PLIN1 بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا. يتم التعبير عن البيانات في وحدات تعسفية ، مع تطبيع الخلايا المعالجة si-SCR إلى 100٪. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار مان ويتني ، ****ص < 0.0001. المختصرات: si-SCR = سيرنا مشوشة. si-PLIN1 = سيرنا ضد Plin1; Plin1 = بيريليبين-1; HSP90 = بروتين الصدمة الحرارية 90؛ SEM = خطأ قياسي في المتوسط؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخ العكسي الكمي؛ FAM = الفلورسين أميدايت; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; IB = الانتفاخ المناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: فرط التعبير الحمض النووي الريبي الدقيق في الخلايا الدهنية 3T3-L1. تم تحويل الخلايا الدهنية 3T3-L1 مع محاكاة التحكم في الحمض النووي الريبي الدقيق (miR-control) أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق 34a (miR-34a). بعد ثلاثة أيام من العدوى، تم حصاد الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي(A)أو(B)إعداد lysates البروتين. (أ)تم قياس التعبير عن مير-34a بواسطة qRT-PCR. تم تطبيع التعبير مير باستخدام مستويات الجيش الملكي النيبالي U6 الصغيرة وأعرب في وحدات التعسفي، مع الخلايا المعالجة بالسيطرة على مير تطبيع إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب راختبار ، *ع < 0.05. (ب)تعرضت lysates البروتين إلى النشاف الغربية مع الأجسام المضادة الموجهة ضد VAMP2 و TUBULIN (تحميل التحكم). تظهر البطانات المناعية التمثيلية لثلاث تجارب مستقلة. (ج)تم قياس كمية VAMP2 من خلال تحليل المسح الضوئي لقياس الكثافة وتطبيعها باستخدام كمية TUBULIN. يتم التعبير عن البيانات في وحدات عشوائية، مع تطبيع خلايا التحكم في miR إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي من قبل الطالب تياختبار، *ص < 0.05. الاختصارات: SEM = خطأ قياسي في الوسط؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخ العكسي الكمي؛ VAMP2 = بروتين الغشاء المرتبط بال الحويكل 2؛ IB = الانتفاخ المناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: آثار البروتين أو تعديل الحمض النووي الريبي الدقيق في وظيفة 3T3-L1 adipocyte. (أ)تم تحويل الخلايا الدهنية 3T3-L1 مع si-SCR أو si-PLIN1. تم تغيير المتوسطة 24 ساعة بعد العدوى ثم جمعت 48 ساعة في وقت لاحق لقياس انحلال الدهون القاعدية. يتم التعبير عن النتائج كما الجلسرين صدر في وسائل الإعلام (μg/mL), وكما يعني + SEM من أربع تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب راختبار ، ***ع < 0.001. (ب) 3T3-L1 adipocytes تم تحويلها مع miR-التحكم أو مير-34a. تم تغيير المتوسطة 24 ساعة بعد العدوى، وبعد ذلك، 48 ساعة في وقت لاحق، تم تغيير المتوسطة إلى وسيلة الاستنفاد (DMEM دون بيروفاتي، 25 مليون الجلوكوز، 1٪ البنسلين والستريبتوميسين، و 0.5٪ BSA) لمدة 6 ساعات. ثم عولجت الخلايا بالإنسولين 0.5 nM لمدة 5 دقائق. تم حصاد الخلايا لإعداد lysates البروتين للنشاف الغربية مع الأجسام المضادة الموجهة ضد فوسفو-PKB وPKB (التحكم في التحميل). تظهر البطانات المناعية التمثيلية لثلاث تجارب مستقلة. (ج)تم قياس كمية الفوسفو-PKB كميا من خلال تحليل المسح الضوئي لقياس الكثافة وتم تطبيعها باستخدام الكمية الإجمالية ل PKB. يتم التعبير عن البيانات في وحدات تعسفية ، مع تطبيع خلايا التحكم في miR المعالجة بالإنسولين إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه ، *p < 0.05 مقارنة بخلايا التحكم في miR المعالجة بالإنسولين. (D) 3T3-L1 adipocytes تم تحويلها مع miR-التحكم أو مير-34a. تم تغيير الوسائط 24 ساعة بعد transfection، وبعد ذلك، 48 ساعة في وقت لاحق، تم تغيير المتوسطة إلى وسيلة استنفاد لمدة 6 ساعة. ثم عولجت الخلايا بالإنسولين 0.5 مليون طن لمدة 20 دقيقة. تم قياس امتصاص (2-3H) deoxyglucose أكثر من 3 دقائق. يتم التعبير عن البيانات في وحدات تعسفية ، مع امتصاص الجلوكوز القاعدي في الخلايا المعالجة بالتحكم في المير تطبيع إلى 1. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط + SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه ، *p < 0.05 مقارنة بخلايا التحكم في miR المعالجة بالإنسولين. المختصرات: si-SCR = سيرنا مشوشة. si-PLIN1 = سيرنا ضد Plin1; SEM = خطأ قياسي في المتوسط؛ PKB = بروتين كيناز B; p-PKB = الفوسفور-PKB; مير-CTL = مير التحكم; DMEM = دولبيكو تعديل النسر المتوسطة؛ BSA = ألبوم مصل البقر; ANOVA = تحليل التباين؛ IB = الانتفاخ المناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| لكل بئر (12 لوحة جيدا) | لكل بئر (24 لوحة جيدا) | |
| أوليغونوكليتيدس | 20 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
| (si-RNA، مير...) | ||
| تحسين الحد الأدنى من المتوسط الأساسي | 20 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
| كاشف العدوى | 5.6 ميكرولتر | 2.8 ميكرولتر |
| تحسين الحد الأدنى من المتوسط الأساسي | 154.4 ميكرولتر | 77.2 ميكرولتر |
| إجمالي حجم مزيج العدوى | 200 ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
الجدول 1: الكواشف العابرة للإصابة المطلوبة لأشكال 12 بئرا و24 بئرا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتمايز وإعادة العدوى بالخلايا الدهنية الناضجة. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لمضادات الميكروبات مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، siRNAs ، محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق ، ومضادات الحمض النووي الريبي الدقيق إلى خلايا 3T3-L1 ، والتي هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا الأسلوب لديه بعض القيود التي تحتاج إلى النظر فيها. هذا البروتوكول غير فعال لالعاب مع الحمض النووي البلازميد، مما يحد من فائدة هذه التقنية للحصول على وظائف الدراسات. على الرغم من أن خطوط خلايا مورين، بما في ذلك خط الخلية 3T3-L1، قد استخدمت عادة لدراسة وظيفة الخلايا الشحمية في المختبر، فإن أنماط التعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق والأنشطة في أنسجة مورين غالبا ما تكون مختلفة عن تلك التي لوحظت في البشر. وهذا هو الحال أيضا مع الخلايا الأساسية وخطوط الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإن الوسيلة المستخدمة لتمايز 3T3-L1 في الخلايا الليفية تتطلب كوكتيل هرمون غيرفيزيولوجي (الأنسولين، ديكساميثازون، IBMX، وrosiglitazone)، والخلايا المتمايزة متميزة شكليا عن الخلايا الدهنية الناضجة في الجسم الحي: أنها تقدم قطرات الدهون متعددة الخلايا بدلا من قطرات الدهون أحادية اللون. وهذا يمكن أن يفسر بعض الاختلافات في التعبير الجيني والاستجابات الخلوية بين في المختبر وفي الدراسات الحية.
إحدى فوائد استخدام بروتوكول العدوى العكسي هذا مقارنة بالكهرومporation هي أن هذه الطريقة أرخص. والواقع أن الكواشف أقل تكلفة، والكفاءة العالية للإصابة العكسية تقلل من كميات أوليغونوكليوتيدات اللازمة، ولا توجد حاجة إلى معدات باهظة الثمن مثل المهاد الكهربائي. وعلاوة على ذلك، استخدام تركيز أقل من سيرنا مفيد لأنه يتجنب الآثار خارج الهدف. وعلاوة على ذلك، فإن هذا التحول العكسي هو طريقة سهلة وسريعة ولطيفة ومباشرة للإصابة التي تتطلب خلايا أقل وستضمن بقاء الخلايا الممتازة وبيانات أكثر قوة مقارنة بالكهرومporation. على الرغم من أن الإجراء المفصل أعلاه قد تم تحسينه للتمايز وعكس العدوى لخلايا الماوس 3T3-L1 ، يمكن أيضا تمييز الخلايا التمهيدية البشرية إلى خلايا دهون5 وإخضاعها بسهولة للإصابة العكسية باستخدام هذا البروتوكول. يظهر هذا التقرير أن الخلايا الدهنية لا تزال قابلة للحياة وصحية ومستجيبة للأنسولين بعد العدوى العكسية باستخدام جيل جديد من كاشف العدوى البرمائية غير الدهنية. ويمكن أيضا إجراء عكس العدوى باستخدام الكواشف الأخرى عبر العدوى الشعبية. ومع ذلك، فإن كميات أوليغونوكليوتيدات وكواشف العدوى العابرة تحتاج إلى تحسين لضمان التشكيل الجيد للتعبير وعدم وجود آثار سلبية على صلاحية الخلية.
يسهل هذا البروتوكول دراسة دور البروتينات والحمر النووي الريبي الدقيق في وظيفة الخلايا الدهنية، ولكن يمكن استخدامه أيضا لتعديل الحمض النووي الريبي غير الترميزي الآخر مثل lnc-RNAs أو Y-RNAs أو eRNAs. هناك خطوات حاسمة في البروتوكول يمكن أن تؤثر على كفاءة الإجراء. وينبغي رصد التمايز بين الخلايا الليفية 3T3-L1 في الخلايا الدهنية بعناية. من المهم الوصول إلى مستوى عال من التمايز لتجنب انتشار الخلايا الليفية المتبقية بعد العدوى ، مما قد يؤدي إلى تحيز نتائج التجربة. نقطة أخرى مهمة هي إجراء العدوى على الخلايا الدهنية الناضجة المتمايزة حديثا؛ أفضل توقيت هو 7-8 أيام بعد بداية بروتوكول التمايز، والذي يتوافق مع 3-4 أيام بعد إزالة كوكتيل التمايز. وهذا سيضمن فعالية قوية transfection ويفضل إعادة ربط جيدة من الخلايا الشحمية إلى لوحة. وأخيرا ، يجب مراقبة علاج الخلايا الدهنية مع التريبسين بعناية لضمان انفصال الخلايا الدهنية دون الإضرار بالخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل كل من معهد البحوث الدولية، وجامعة كوت دازور، والوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث من خلال برنامج الاستثمارات من أجل مختبر التميز المستقبلي (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ومبادرة التميز (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). 10- وتحظى الجمعية العامة بدعم المنح المقدمة من جمعية الفرانكوفونية للديابييه، وجمعية فرانسيز دي إيتو دي ريشرش سور لوبيستيه، ومعهد التكنولوجيات المتعددة الكائنات من أجل سانتي، ومؤسسة بنجامين - ديهرت. J.G. معتمد من قبل ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. مدعوم بمنحة ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ومنحة من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي C3M الممول من مجلس إدارة ألب ماريتيم وريجيون باكا، والذي يدعمه أيضا منصة التصوير المجهري والتصوير GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
