Summary
Præsenteret her er en protokol til at levere oligonukleotider såsom små-interfererende RNA (siRNA), mikro-RNA efterligner (miRs), eller anti-mikro-RNA (anti-miR) i modne adipocytter til at modulere protein og mikro-RNA udtryk.
Abstract
Ændring af adipocytfunktion bidrager til patogenesen af metaboliske sygdomme, herunder type 2-diabetes og insulinresistens. Dette understreger behovet for bedre at forstå den molekylære mekanisme, der er involveret i adipocyt dysfunktion til at udvikle nye behandlinger mod fedme-relaterede sygdomme. Det er fortsat meget udfordrende at modulere ekspressionen af proteiner og mikro-RNA'er i adipocytter. Dette papir beskriver en protokol til at differentiere murin fibroblaster i modne adipocytter og til at modulere udtrykket af proteiner og mikro-RNA efterligne (miR efterligne) oligonukleotider. Denne omvendte transfection protokol indebærer inkubation af transfection reagens og oligonukleotider til at danne et kompleks i cellen kultur plade, som de modne adipocytter tilsættes. Adipocytterne får derefter lov til at fastgøres til den klæbende pladeoverflade i nærværelse af oligonucleotider /transfection reagenskomplekset. Funktionelle analyser såsom studiet af insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipogenese og lipolyse kan udføres på de transfected 3T3-L1 modne adipocytter for at studere virkningen af protein- eller mikro-RNA-manipulation på adipocytfunktionen.
Introduction
Fedme betragtes som en stor risikofaktor for mange metaboliske sygdomme, herunder insulinresistens (IR), Type 2 Diabetes (T2D) og hjerte-kar-sygdomme1. Nuværende behandlinger har undladt at stoppe den konstant stigende forekomst af disse sygdomme, og håndteringen af IR af overvægtige og diabetiske patienter er fortsat et vigtigt klinisk problem. Fedtvæv spiller en afgørende rolle i kontrollen af energi homøostase, og dens patologiske ekspansion under fedme bidrager til udviklingen af IR og T2D2,3. Dette understreger behovet for bedre at forstå den molekylære mekanisme, der er involveret i adipocyt dysfunktion til at udvikle nye behandlinger mod fedme-relaterede sygdomme. Mange forskningsundersøgelser har undersøgt den rolle, protein-kodning RNA'er i adipocyt fysiologi og deres tilknytning til fedme.
For nylig har opdagelsen af ikke-kodende RNA'er (ncRNAs), især mikro-RNA'er (miR'er), smedet nye begreber relateret til mekanismen for regulering af genekspressionsprogrammer. Undersøgelser har vist, at nc RNA'er er vigtige regulatorer af adipocyt funktion, og at deres dysregulering spiller en vigtig rolle i metaboliske sygdomme4. Således manipulation af proteiner og ncRNAs i adipocytter er afgørende for at dechifrere deres roller i adipocyt funktion og deres indvirkning på patologier såsom T2D. Men, manipulere udtrykket af proteiner og ncRNAs in vivo samt i primære adipocytter er fortsat meget udfordrende, favorisere brugen af in vitro adipocyt modeller.
Murine 3T3-L1 fibroblaster skelner let til modne, funktionelle og insulin-responsive adipocytter, som er en velkarakteriseret cellelinje, der bruges til at studere adipocytfunktion (f.eks. insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipolyse og adipokiner sekretion)5,6,7,8,9,10. Disse egenskaber gør 3T3-L1 adipocytter til en attraktiv model til at modulere ekspressionen af proteinkodning og nc-RNA'er for at dechifrere deres rolle i adipocytfunktion og deres potentielle rolle i fedmerelaterede sygdomme. Desværre, mens 3T3-L1 fibroblaster er nemme at transfect ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser, differentierede 3T3-L1 adipocytter er en af de sværeste cellelinjer at transfekte. Dette er grunden til talrige undersøgelser manipulere genekspression i 3T3-L1 celler har fokuseret på adipocyt differentiering snarere end på adipocyt funktion.
I lang tid var den eneste effektive teknik til at transfect adipocytter elektroporation5, hvilket er kedeligt, dyrt og kan forårsage celleskader. Dette papir rapporterer en omvendt transfection teknik ved hjælp af en fælles transfection reagens, som reducerer hands-on tid til transfection, har ingen effekt på celle levedygtighed, og er langt billigere end elektroporation. Denne protokol er perfekt egnet til transfektion af siRNA og andre oligonukleotider såsom mikro-RNA efterligner (miR efterligner) og anti-miRs. Princippet i reverse-transfection protokollen er at inkubere transfection reagens og oligonuleotider til at danne et kompleks i cellen kultur plade og derefter så de modne adipocytter i brønde. Derefter fastgøres adipocytterne til den klæbende pladeoverflade i nærværelse af oligonucleotider / transfection reagenskompleks. Denne enkle, effektive og billige metode gør det muligt at studere den rolle, som proteinkodnings-RNA'er og miR'er spiller i adipocytfunktionen og deres potentielle rolle i fedmerelaterede sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Brug sterile teknikker til at udføre alle protokollens trin i en laminar flowcellekulturhætte. Se Materialetabel for at få flere oplysninger om alle reagenser og udstyr.
1. Differentiering af murin 3T3-L1 fibroblaster i adipocytter
- Dyrk 3T3-L1 fibroblaster i 100 mm retter i kulturmedium-DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% nyfødte kalveserum og 1% penicillin og streptomycin (Figur 1A). Læg opvasken i en vævskulturinkubator (7 % CO2 og 37 °C).
- To dage efter sammenløbet ændres kulturmediet og erstattes med DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% føtal kalveserum (FCS) og 1% penicillin og streptomycin suppleret med 0,25 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0,25 μM dexamethason, 5 μg/mL insulin og 10 μM rosiglitazone.
BEMÆRK: Det tager 5 dage at nå sammenløb, når cellerne er seedet ved 300.000 celler pr. 100 mm skål. - To dage senere erstattes kulturmediet med DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin suppleret med 5 μg/mL insulin og 10 μM rosiglitazone og inkuberes i 2 dage. Derefter fodres cellerne hver anden dag med DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin (Figur 1B).
- Transfect 3T3-L1 adipocytes 7-8 dage efter begyndelsen af differentieringsprotokollen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at nå et højt differentieringsniveau (>80%) før transfection for at undgå spredning af de resterende fibroblaster efter transfection, hvilket ville føre til en blandet population af celler, der kan skævvride resultaterne.
2. Tilberedning af formalede plader
- Dagen før eller et par timer før transfektionen fremstilles en opløsning af kollagentype I ved 100 μg/mL i 30% ethanol fra en lageropløsning ved 1 mg/mL. Tilsæt 250 μL kollagen pr. brønd af en 12-brønds plade og 125 μL pr. brønd af en 24-brønds plade, og spred opløsningen over brøndens overflade.
- Lad pladen stå uden låget under kulturhætten, indtil kollagen tørrer. Vask to gange med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS).
BEMÆRK: Forudbehandlede plader kan købes.
3. Forberedelse af transfection mix
BEMÆRK: Den endelige koncentration af siRNA er mellem 1 og 100 nM (1 til 100 pmol siRNA pr. brønd af en 12-brønds plade). Den endelige koncentration af miR-miR-mi er 10 nM (10 pmol/brønd). Bestem den bedste koncentration af hver siRNA, miR-miR-mir eller anden oligonukleotid, før eksperimentet startes, for at undgå virkninger uden for målet. Udfør transfection eksperimenter i tredotel for at lette statistisk analyse af resultaterne. Forbered alle reagenser i overskud for at tage højde for normalt tab under pipettering.
- Bland ved pipettering (volumen/volumen) siRNA (eller andre oligonukleotider) med forbedret Minimal Essential Medium (tabel 1). Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt transfection reagens og den forbedrede Minimal Essential Medium til siRNA, og pipet at blande (Tabel 1). Inkuber i 20 min ved stuetemperatur (i løbet af denne tid skal du gå videre til afsnit 4). Tilsæt transfection mix til hver brønd af kollagen-belagt plade.
4. Forberedelse af 3T3-L1 adipocytterne
- Vask cellerne i 100 mm Petriskål to gange med D-PBS. Tilsæt 5x trypsin til cellerne (1 mL pr. 100 mm skål), og sørg for at dække hele overfladen med trypsinen. Vent i 30 s og fjern forsigtigt trypsinen.
- Petriskålen inkuberes i 5-10 min ved 37 °C i inkubatoren. Tryk på 100 mm skålen for at løsne cellerne.
- Tilsæt 10 ml DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin for at neutralisere trypsinen. Rør forsigtigt mediet op og ned for at løsne cellerne og homogenisere celleaffjedringen.
- Tæl cellerne ved hjælp af et Malassez tællekammer eller en automatiseret celletæller, og juster koncentrationen af cellerne til 6,25 x 105 celler/mL medium. Frø 800 μL af celleaffjedringen/brønden af en 12-brønds plade (5 x 105 celler) eller 400 μl af celleaffjedringen/brønden af en 24-brønds plade (2,5 x 105 celler), der indeholder transfectionblandingen.
BEMÆRK: En 100 mm Petriskål af adipocytter vil gøre det muligt at forberede en 12-brønds plade eller en 24-brønds plade. En 100 mm skål indeholder normalt 6-7 x 106 adipocytter, hvilket svarer til 5 x 105 adipocytter pr. brønd af en 12-brønds plade. - Pladerne inkuberes i en cellekulturinkubator (7 % CO2 og 37 °C) og forstyrrer ikke cellerne i 24 timer. På den næste dag skal supernatanten forsigtigt udskiftes med frisk DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% FCS og 1% penicillin og streptomycin.
BEMÆRK: Det er også muligt at så cellerne i kollagen-precoated 48- og 96-brønd plader, men tage flere forholdsregler, når du udskifter medierne for at undgå løsrivelse af adipocytterne.
5. Funktionel analyse af transfected 3T3-L1 adipocytter
- Undersøgelse mål knockdown 24-48 h og 48-96 h efter siRNA eller miR efterligne levering for mRNA og protein, henholdsvis.
- Udfør funktionelle analyser af transfected adipocytter for at studere insulinsignalering, glukoseoptagelse, adipokinsekretion, lipolyse og lipogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure for omvendt transfektion, der er beskrevet her for at modulere ekspressionen af proteiner eller mikro-RNA'er i 3T3-L1 adipocytter, har adipocytterne vist sig at bevare deres morfologi efter transfection (Figur 1B, C). Faktisk var adipocytterne 2 dage efter transfectionen godt spredt og fastgjort til pladen og præsenterede flerlokulære lipiddråber, der er karakteristiske for modne 3T3-L1 adipocytter. Lipidindholdet var ikke forskelligt mellem de transfected og ikke-transfected adipocytter (Figur 1D, E). Desuden var mRNA-ekspressionen af differentieringsmarkører som peroxisome proliferatoraktiveret receptor gamma 2 (Pparγ2), adiponectin (Adipoq), glukosetransporter 4 eller opløst bærerfamilie 2 medlem 4 (Slc2a4), insulinsubceptor 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) uændret i transfected celler sammenlignet med det i ikke-transfected adipocytter (Figur 1F). Denne protokol til omvendt transinfektion er effektiv, da >70 % af adipocytterne blev overført (figur 1G, H).
Perilipin-1 er et adipocyt-specifikt protein kendt for at fremme lipiddråbedannelse og hæmme lipolyse. Her blev 3T3-L1 adipocytter transfected med forvrænget siRNA (si-SCR) eller siRNA mod Plin1 (si-PLIN1). Tre dage efter transfektionen med si-PLIN1 var mRNA-niveauet for Plin1 faldet med 70 % (figur 2A) og proteinniveauet med 63 % (figur 2B, C). PLIN1-ekspressionen blev også analyseret ved fluorescensmikroskopi 4 dage efter transfektionen og viste sig at være faldet med 92% i forhold til dets udtryk i kontrolapokacytter (figur 2D-F), hvilket viste effekten af både transfectionprotokollen og si-PLIN1.
Denne protokol blev også brugt til at udføre omvendt transfekt af adipocytter med mikro-RNA efterligne (miR efterligner) oligonucleotider til upregulate udtrykket miR-34a (Figur 3A). Overekspressionen af miR-34a førte til et fald i VAMP2-proteinudtrykket med 50 % (figur 3B, C), et bekræftet mål på miR-34a11,12. Endelig viser denne undersøgelse, at omvendt transfektion af 3T3-L1 adipocytter bevarer deres funktion og reaktionsevne over for insulinstimulering. Faktisk knockdown af Plin1 i 3T3-L1 adipocytter førte til en stigning i basal lipolyse (Figur 4A). Desuden førte overekspressionen af miR-34a hos 3T3-L1 adipocytter til hæmning af insulininduceret proteinkinase B fosforylering (figur 4B, C) og glukoseoptagelse ( figur4D).
Figur 1: Differentiering af 3T3-L1 fibroblaster i modne adipocytter. (A) 3T3-L1 fibroblaster blev seedet ved en massefylde på 3 x 105 celler pr. 100 mm skål. Repræsentant 10x brightfield billede af 3T3-L1 fibroblaster 2 dage senere. (B) To dage efter sammenløb (dag 0) blev 3T3-L1 fibroblaster differentieret til adipocytter ved hjælp af en differentiering cocktail mix i 4 dage (indtil dag 4). Repræsentant 10x brightfield billede af 3T3-L1 fibroblaster differentieret i adipocytter (dag 7). Adipocytter med multilokulære lipiddråber er let synlige. (C) 3T3-L1-adipocytterne blev overført med si-SCR på dag 7. Repræsentative 10x lysefelt billeder af transfected 3T3-L1 adipocytter (dag 9). De transfected adipocytters morfologi kan sammenlignes med de ikke-transfected adipocytters, hvilket indebærer, at transfectionmetoden er skånsom og ikke giftig for adipocytterne. Skalastænger: 50 μm. (D-E) 3T3-L1 adipocytterne blev transfected med si-SCR på dag 7 (øverste paneler); ikke-transfected adipocytter (lavere paneler). To dage senere blev cellerne inkuberet med Olierød O for at plette lipider. (D) Der vises repræsentative billeder af de farvede celler i pladen og repræsentative 10x lyse markbilleder. Skalastænger: 50 μm. (E) Den olierøde O, der blev indarbejdet i cellerne, blev eluteret med 2-propanol og kvantificeret ved hjælp af et spektrofotometer. Data udtrykkes i vilkårlige enheder, med absorbansen af de ikke-transfected celler normaliseret til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført af Student's t-test. (F) 3T3-L1-adipocytterne blev overført med si-SCR. Tre dage efter transfektionen blev cellerne høstet for at isolere det samlede RNA. Udtrykket af adipocyt differentiering markører blev målt ved qRT-PCR og normaliseret ved hjælp af 36B4 RNA niveauer. Dataene repræsenterer mRNA-udtrykket i transfected celler i forhold til det i ikke-transfected celler (normaliseret til 1, repræsenteret ved den stiplede linje) og udtrykkes som middelværdi + SEM af tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført af Student's t-test. (G-H) 3T3-L1-adipocytterne blev transfected med si-SCR eller fluorescerende farvestof (FAM)-mærket si-RNA og forgyldt på coverslips. 3T3-L1 adipocytter blev analyseret 8 timer senere ved fluorescensmikroskopi. (G) Der vises et repræsentativt enkeltplanbillede af transfected 3T3-L1-celler. (H) Kvantificering af de FAM-positive celler i forhold til det samlede antal celler. Data udtrykkes som procentdel af celler, der indeholder fluorescerende si-RNA. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Mann-Whitney test, ****p < 0,0001. Forkortelser: si-SCR = krypteret siRNA; SEM = standardfejl i middelværdien; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion; FAM = fluorescein amidit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; si-FAM = FAM-mærket si-RNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Proteindæmpning hos 3T3-L1 adipocytter. 3T3-L1 adipocytter blev transfected med krypteret si-RNA (si-SCR) eller si-RNA mod Plin1 (si-PLIN1). (A) Tre dage efter transfektionen blev mRNA-udtrykket af Plin1 målt ved qRT-PCR. mRNA-udtrykket blev normaliseret ved hjælp af 36B4 RNA-niveauer og udtrykt i vilkårlige enheder, med de si-SCR-behandlede celler normaliseret til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af fire uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Student's t-test,**p < 0,01. (B-C) Tre dage efter transfektionen blev proteinlyater udsat for vestlig blotting med antistoffer rettet mod PLIN1 og HSP90 (lastekontrol). Repræsentative immunoblots er vist. (C) Mængden af PLIN1 blev kvantificeret ved densitometri scanning analyse og normaliseret ved hjælp af mængden af HSP90. Data udtrykkes i vilkårlige enheder, hvor de si-SCR-behandlede celler normaliseres til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af fire uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Student's t-test, *p < 0,05. (D-F) 3T3-L1 adipocytterne blev transfected med si-SCR eller si-PLIN1 og forgyldt på coverslips. Udtrykket af PLIN1 blev analyseret 96 timer senere ved fluorescensmikroskopi. (D) Der vises repræsentative enkeltplansbilleder af 3T3-L1-adipocytter, der er plettet med anti-perilipin antistof, og et anti-kanin-Alexa647-konjugeret antistof. Skalalinjer = 10 μm. (E) Tredimensionel (3D) volumengengivelse af 3T3-L1 adipocytter segmenteret i 3D ved hjælp af kommerciel software. Skalastænger = 10 μm. (F) Kvantificeringen af PLIN1 signalintensitet i forhold til det samlede antal celler. Data udtrykkes i vilkårlige enheder, hvor de si-SCR-behandlede celler normaliseres til 100%. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Mann-Whitney test, ****p < 0,0001. Forkortelser: si-SCR = krypteret siRNA; si-PLIN1 = siRNA mod Plin1; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = varmechokprotein 90; SEM = standardfejl i middelværdien; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion; FAM = fluorescein amidit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; IB = immunblæseri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mikro-RNA overekspression i 3T3-L1 adipocytter. 3T3-L1 adipocytter blev transfected med kontrol mikro-RNA efterligne (miR-control) eller mikro-RNA 34a efterligne (miR-34a). Tre dage efter transfektionen blev cellerne høstet til (A) RNA-ekstraktion eller (B) fremstilling af proteinlyater. (A) Udtrykket miR-34a blev målt ved qRT-PCR. MiR-udtrykket blev normaliseret ved hjælp af U6 små RNA-niveauer og udtrykt i vilkårlige enheder, med de miR-kontrolbehandlede celler normaliseret til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Student's t-test, *p < 0,05. (B) Proteinlyater blev udsat for vestlig blotting med antistoffer rettet mod VAMP2 og TUBULIN (lastningskontrol). Repræsentative immunoblots af tre uafhængige eksperimenter er vist. (C) Mængden af VAMP2 blev kvantificeret ved densitometriscanning og normaliseret ved hjælp af mængden af TUBULIN. Data udtrykkes i vilkårlige enheder, hvor miR-kontrolcellerne normaliseres til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført af Student's t-test, *p < 0,05. Forkortelser: SEM = standardfejl i middelværdien; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion; VAMP2 = vesikel-associeret membranprotein 2; IB = immunblæseri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Virkninger af protein- eller mikro-RNA-graduering i 3T3-L1-adipocytfunktionen. (A) 3T3-L1 adipocytter blev transfected med si-SCR eller si-PLIN1. Mediet blev ændret 24 timer efter transfection og derefter indsamlet 48 timer senere for at måle basal lipolyse. Resultaterne udtrykkes som glycerol udgivet i medierne (μg/mL), og som middel + SEM af fire uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Student's t-test, ***p < 0,001. (B) 3T3-L1 adipocytter blev overført med miR-kontrol eller miR-34a. Mediet blev ændret 24 timer efter transfection, og derefter, 48 timer senere, blev mediet ændret til udtømningsmediet (DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 1% penicillin og streptomycin og 0,5% BSA) i 6 timer. Derefter blev cellerne behandlet med 0,5 nM insulin i 5 min. Celler blev høstet for at forberede protein lysater til vestlig blotting med antistoffer rettet mod fosfo-PKB og PKB (loading control). Repræsentative immunoblots af tre uafhængige eksperimenter er vist. (C) Mængden af fosfo-PKB blev kvantificeret ved densitometri scanning analyse og normaliseret ved hjælp af den samlede mængde PKB. Data udtrykkes i vilkårlige enheder, hvor miR-kontrolcellerne behandles med insulin normaliseret til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af tovejs ANOVA-testen, *p < 0,05 sammenlignet med miR-kontrolceller behandlet med insulin. (D) 3T3-L1 adipocytter blev transfected med miR-kontrol eller miR-34a. Medierne blev ændret 24 timer efter transfection, og derefter, 48 timer senere, blev mediet ændret til udtømning medium for 6 timer. Derefter blev cellerne behandlet med 0,5 nM insulin i 20 min. Optagelse af (2-3H)deoxyglucose blev målt over 3 min. Data udtrykkes i vilkårlige enheder, hvor basal glukoseoptagelsen i miR-kontrolbehandlede celler normaliseres til 1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi + SEM af tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af tovejs ANOVA-testen, *p < 0,05 sammenlignet med miR-kontrolceller behandlet med insulin. Forkortelser: si-SCR = krypteret siRNA; si-PLIN1 = siRNA mod Plin1; SEM = standardfejl i middelværdien; PKB = protein kinase B; p-PKB = fosfor-PKB; miR-CTL = miR-control; DMEM = Dulbeccos modificerede Eagles medium; BSA = albumin til kvægserum; ANOVA = analyse af varians; IB = immunblæseri. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Per brønd (12-brønd plade) | Per brønd (24-brønd plade) | |
| Oligonucletider | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Forbedret minimal vigtigt medium | 20 μL | 10 μL |
| Transfection reagens | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Forbedret minimal vigtigt medium | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Samlet volumen af transfection mix | 200 μL | 100 μL |
Tabel 1: Transfection reagenser kræves til 12-brønd og 24-brønd pladeformater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir præsenterer en detaljeret protokol for differentiering og transfection af modne adipocytter. Denne omvendte transfektionsmetode er en enkel, økonomisk og meget effektiv metode til at transfectoligonucleotider som, men ikke begrænset til, siRNAs, mikro-RNA efterligner og anti-mikro-RNA'er i 3T3-L1 adipocytter, som er en af de sværeste cellelinjer at transfect. Denne metode har nogle begrænsninger, der skal overvejes. Denne protokol er ikke effektiv til transfektion med plasmid DNA, hvilket begrænser nytten af denne teknik til gain-of-function undersøgelser. Selv om murincellelinjer, herunder 3T3-L1-cellelinjen, typisk er blevet brugt til at studere adipocytfunktion in vitro, er mikro-RNA-udtryksmønstre og aktiviteter i murinvæv ofte forskellige fra dem, der observeres hos mennesker; Dette er også tilfældet med primære celler og cellelinjer. Desuden kræver det medium, der anvendes til differentiering af 3T3-L1 fibroblast i adipocytter, en ufysiologisk hormoncocktail (insulin, dexamethason, IBMX og rosiglitazone), og de differentierede celler er morfologisk forskellige fra in vivo modne adipocytter: de præsenterer multilokulære lipiddråber i stedet for en unilokulær lipiddråbe. Dette kan forklare nogle forskelle i genekspression og cellulære reaktioner mellem in vitro- og in vivo-undersøgelser.
En fordel ved at bruge denne omvendte transfection protokol i forhold til elektroporation er, at denne metode er billigere. Faktisk er reagenserne billigere, og den høje effektivitet af den omvendte transfection reducerer de nødvendige mængder oligonuleotider, og der er ikke behov for dyrt udstyr som en elektroporator. Desuden, ved hjælp af en lavere koncentration af siRNA er gavnligt, da det undgår off-target effekter. Desuden er denne omvendte transfektion en nem, hurtig, blid og ligetil transfektionsmetode, der kræver færre celler og vil sikre fremragende celle levedygtighed og mere robuste data sammenlignet med elektroporation. Selv om ovennævnte procedure er blevet optimeret til differentiering og omvendt transfektion af mus 3T3-L1-celler, kan menneskelige præadipocytter også differentieres til adipocytter5 og let udsættes for omvendt transfektion ved hjælp af denne protokol. Denne rapport viser, at adipocytter forbliver levedygtige, sunde og lydhøre over for insulin efter omvendt transfection ved hjælp af en ny generation af en ikke-fedtopol kationisk amfiphile transfection reagens. Den omvendte transfection kunne også udføres ved hjælp af andre populære transfection reagenser. Mængden af oligonukleotider og transfectionreagens skal dog optimeres for at sikre en god graduering af udtryk og ingen negative virkninger på celleleveligheden.
Denne protokol letter studiet af proteiners og mikro-RNA'ers rolle i adipocytfunktionen, men den kan også bruges til at modulere andre ikke-kodende RNA'er såsom lnc-RNA'er, Y-RNA'er eller eRNAs. Der er kritiske trin i protokollen, der kan påvirke procedurens effektivitet. Differentieringen af 3T3-L1 fibroblaster i adipocytter bør overvåges nøje. Det er vigtigt at nå et højt niveau af differentiering for at undgå spredning af resterende fibroblaster efter transfection, hvilket ville skævvride resultaterne af eksperimentet. Et andet vigtigt punkt er at udføre transfection på nyligt differentierede modne adipocytter; den bedste timing er 7-8 dage efter begyndelsen af differentieringsprotokollen, hvilket svarer til 3-4 dage efter fjernelse af differentieringscocktailen. Dette vil sikre robust transfection effekt og favorisere god reattachment af adipocytter til pladen. Endelig bør behandlingen af adipocytter med trypsin overvåges nøje for at sikre løsrivelse af adipocytterne uden at beskadige cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af INSERM, Université Côte d'Azur og det franske nationale forskningsagentur (ANR) gennem programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) og Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. støttes af tilskud fra Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) og Fondation Benjamin-Delessert. J.G. understøttes af ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. støttes af ANR-tilskud ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 og et tilskud fra Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansieret af Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, som også støttes af GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
