Summary
Presenteras här är ett protokoll för att leverera oligonukleotider såsom små-störande RNA (siRNA), mikro-RNA härmar (miRs) eller anti-mikro-RNA (anti-miR) i mogna adipocyter att modulera protein och mikro-RNA uttryck.
Abstract
Förändring av adipocyte funktion bidrar till patogenesen vid metabola sjukdomar inklusive typ 2 diabetes och insulinresistens. Detta belyser behovet av att bättre förstå den molekylära mekanismen som är involverad i adipocyt dysfunktion för att utveckla nya terapier mot fetma-relaterade sjukdomar. Att modulera uttrycket av proteiner och mikro-RNAs i adipocyter är fortfarande mycket utmanande. Detta dokument beskriver ett protokoll för att skilja murin fibroblaster till mogna adipocyter och att modulera uttrycket av proteiner och mikro-RNAs i mogna adipocytes genom omvända transfection med hjälp av små-störande RNA (siRNA) och micro-RNA härma (miR härma) oligonucleotides. Detta omvända transfection protokoll innebär inkubation av transfection reagens och oligonucleotides att bilda ett komplex i cell kultur plattan till vilken mogna adipocytes läggs till. Adipocyterna får sedan sättas tillbaka till den vidhäftande plåtytan i närvaro av oligonukleotider/transfection reagenskomplex. Funktionella analyser såsom studie av insulinsignalering, glukosupptag, lipogenes och lipolys kan utföras på de transfekterade 3T3-L1 mogna adipocyterna för att studera effekten av protein- eller mikro-RNA-manipocytmanipulation på adipocytfunktionen.
Introduction
Fetma anses vara en viktig riskfaktor för många metabola sjukdomar, inklusive insulinresistens (IR), typ 2-diabetes (T2D) och hjärt-kärlsjukdomar1. Nuvarande terapier har misslyckats med att stoppa den ständigt ökande prevalensen av dessa sjukdomar, och förvaltningen av IR av överviktiga och diabetiker patienter är fortfarande en viktig klinisk fråga. Fettvävnad spelar en avgörande roll i kontrollen av energihomeostas, och dess patologiska expansion under fetma bidrar till utvecklingen av IR och T2D2,3. Detta belyser behovet av att bättre förstå den molekylära mekanismen som är involverad i adipocyt dysfunktion för att utveckla nya terapier mot fetma-relaterade sjukdomar. Många forskningsstudier har undersökt rollen av proteinkodande RNAs i adipocyte fysiologi och deras samband med fetma.
På senare tid har upptäckten av icke-kodande RNAs (ncRNAs), särskilt mikro-RNAs (miR), förfalskat nya begrepp relaterade till mekanismen för reglering av genuttrycksprogram. Studier har visat att ncRNAs är viktiga tillsynsmyndigheter för adipocyte funktion, och att deras dysregulation spelar en viktig roll i metabola sjukdomar4. Således är manipulering av proteiner och ncRNAs i adipocyter avgörande för att dechiffrera sina roller i adipocyte funktion och deras inverkan på patologier såsom T2D. Att manipulera uttrycket av proteiner och ncRNAs in vivo såväl som i primära adipocyter är dock fortfarande mycket utmanande, vilket gynnar användningen av in vitro-adipocytmodeller.
Murin 3T3-L1 fibroblaster skiljer lätt till mogna, funktionella och insulin-lyhörda adipocyter, som är en väl karakteriserad cellinje som används för att studera adipocyt funktion (t.ex. insulin signalering, glukosupptag, lipolys och adipokines utsöndring)5,6,7,8,9,10. Dessa egenskaper gör 3T3-L1 adipocyter till en attraktiv modell för att modulera uttrycket av proteinkodning och nc-RNAs för att dechiffrera sin roll i adipocyte funktion och deras potentiella roll i fetma-relaterade sjukdomar. Tyvärr, medan 3T3-L1 fibroblaster är lätta att transfektiera med kommersiellt tillgängliga reagenser, är differentierade 3T3-L1-adipocyter en av de svåraste cellinjerna att transfektiera. Det är därför många studier manipulera gen uttryck i 3T3-L1 celler har fokuserat på adipocyte differentiering snarare än på adipocyte funktion.
Under lång tid var den enda effektiva tekniken för att transfekterade adipocyter elektroporation5, vilket är tråkigt, dyrt och kan orsaka cellskador. Detta dokument rapporterar en omvänd transfection teknik med hjälp av en gemensam transfection reagens, som minskar praktisk tid för transfection, har ingen effekt på cellens livskraft, och är mycket billigare än elektroporation. Detta protokoll är perfekt lämpat för transfection av siRNA och andra oligonucleotides såsom mikro-RNA härmar (miR härmar) och anti-miRs. Principen för omvända transfection protokollet är att inkubera transfection reagenset och oligonucleotides att bilda ett komplex i cell kultur plattan och sedan så mogna adipocyter i brunnarna. Därefter återansluter adipocyterna till den vidhäftande plåtytan i närvaro av oligonukleotider/ transfection reagenskomplex. Denna enkla, effektiva och billiga metodik möjliggör studier av rollen av proteinkodande RNAs och miRs i adipocyte funktion och deras potentiella roll i fetma-relaterade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Använd sterila tekniker för att utföra alla steg i protokollet i en laminär flödescellkulturhuv. Se Tabell över material för information om alla reagenser och utrustning.
1. Differentiering av murin 3T3-L1 fibroblaster till adipocyter
- Odla 3T3-L1 fibroblaster i 100 mm rätter i kulturmedium-DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% nyfött kalvserum och 1% penicillin och streptomycin (Figur 1A). Placera disken i en inkubator för vävnadskultur (7% CO2 och 37 °C).
- Två dagar efter sammanflödet, ändra odlingsmediet, ersätta med DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% fetala kalv serum (FCS) och 1% penicillin och streptomycin kompletteras med 0,25 mM 3-Isobutyl-1-metylxantin (IBMX), 0,25 μM dexametason, 5 μg/mL insulin och 10 μM rosiglitazon.
OBS: Det tar 5 dagar att nå confluency när cellerna sås vid 300 000 celler per 100 mm skål. - Två dagar senare, ersätt odlingsmediet med DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% FCS och 1% penicillin och streptomycin kompletterat med 5 μg/mL insulin och 10 μM rosiglitazon och inkubera i 2 dagar. Mata sedan cellerna varannan dag med DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% FCS och 1% penicillin och streptomycin (Figur 1B).
- Transfekt 3T3-L1 adipocyter 7-8 dagar efter början av differentiering protokollet.
OBS: Det är viktigt att nå en hög differentieringsnivå (>80%) före transfekten för att undvika spridningen av de återstående fibroblasterna efter transfektionen, vilket skulle leda till en blandad population av celler som kan fördomsfulla resultaten.
2. Beredning av förbelagda plattor
- Dagen före eller några timmar före transfektionen bereder du en lösning av kollagen typ I vid 100 μg/ml i 30% etanol från en stamlösning vid 1 mg/ml. Tillsätt 250 μL kollagen per brunn på en 12-brunnsplatta och 125 μL per brunn på en 24-brunnsplatta och sprid lösningen över brunnens yta.
- Lämna plattan utan lock under kulspluvan tills kollagenet torkar. Tvätta två gånger med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS).
OBS: Förbelagda plattor finns att köpa.
3. Beredning av transfectionblandningen
OBS: Den slutliga koncentrationen av siRNA är mellan 1 och 100 nM (1 till 100 pmol siRNA per brunn på en 12-brunnsplatta). Den slutliga koncentrationen av miR-härmningen är 10 nM (10 pmol/brunn). Bestäm den bästa koncentrationen av varje siRNA, miR-härma eller annan oligonukleotid innan experimentet påbörjas för att undvika effekter utanför målet. Utför transfection experiment i tre exemplar för att underlätta statistisk analys av resultaten. Förbered alla reagenser som är överflödiga för att ta hänsyn till normal förlust under pipetting.
- Blanda genom pipetting (volym/volym) siRNA (eller andra oligonukleotider) med förbättrat minimalt essentiellt medium (tabell 1). Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt transfection reagenset och det förbättrade minimala essentiella mediet till siRNA och pipet att blanda (tabell 1). Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur (fortsätt under denna tid till avsnitt 4). Tillsätt transfectionblandningen till varje brunn på den kollagenbelagda plattan.
4. Förberedelse av 3T3-L1-adipocyterna
- Tvätta cellerna i 100 mm Petri-skålen två gånger med D-PBS. Tillsätt 5x trypsin till cellerna (1 ml per 100 mm skål), se till att täcka hela ytan med trypsin. Vänta i 30 s och ta försiktigt bort trypsin.
- Inkubera Petriskålen i 5-10 min vid 37 °C i inkubatorn. Tryck på 100 mm skålen för att lossa cellerna.
- Tillsätt 10 ml DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% FCS och 1% penicillin och streptomycin för att neutralisera trypsin. Rör försiktigt mediet upp och ner för att lossa cellerna och homogenisera cellupphängningen.
- Räkna cellerna med hjälp av en Malassez-räknekammare eller en automatiserad cellräknare och justera cellernas koncentration till 6,25 x 105 celler/ml medium. Frö 800 μL av cellfjädringen/brunnen på en 12-brunnsplatta (5 x 105 celler) eller 400 μl av cellfjädringen/brunnen på en 24-brunnsplatta (2,5 x 105 celler) som innehåller transfectionblandningen.
OBS: En 100 mm Petri-skål med adipocyter gör det möjligt att förbereda en 12-brunnsplatta eller en 24-brunnsplatta. En 100 mm skål innehåller vanligtvis 6-7 x 106 adipocyter, vilket motsvarar 5 x 105 adipocyter per brunn på en 12-brunnsplatta. - Inkubera plattorna i en cellkulturinkubator (7% CO2 och 37 °C) och stör inte cellerna i 24 timmar. Nästa dag, byt försiktigt ut supernatanten mot färsk DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% FCS och 1% penicillin och streptomycin.
OBS: Det är också möjligt att så cellerna i kollagenförbelagda 48- och 96-brunnsplattor men vidta fler försiktighetsåtgärder när du byter ut mediet för att undvika avlossning av adipocyterna.
5. Funktionell analys av transfekterade 3T3-L1-adipocyter
- Studiemål knockdown 24-48 h och 48-96 h efter siRNA eller miR efterlikna leverans för mRNA respektive protein.
- Utför funktionella analyser av transfekterade adipocyter för att studera insulinsignalering, glukosupptag, adipokinsekretion, lipolys och lipogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av förfarandet för omvänd transfektion som beskrivs här för att modulera uttrycket av proteiner eller mikro-RNAs i 3T3-L1 adipocyter, har adipocyterna visat sig bevara sin morfologi efter transfekten (Figur 1B, C). 2 dagar efter transfection, adipocytes var väl spridd och fäst vid plattan och presenteras multilocular lipid droppar som är ett kännetecken för mogna 3T3-L1 adipocyter. Lipidhalten var inte annorlunda mellan de transfekterade och icke-transfecterade adipocyterna(figur 1D,E). Dessutom har mRNA-uttrycket av differentieringsmarkörer såsom peroxisomproliferatoraktiverad receptorgamma 2 (Pparγ2), adiponectin (Adipoq),glukostransportör 4 eller solute bärarfamilj 2 medlem 4 (Slc2a4), insulinreceptor substrat 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) var oförändrad i transfekterade celler jämfört med den i icke-transfecterade adipocyter(figur 1F). Detta omvända transfection-protokoll är effektivt eftersom >70% av adipocyterna transfekterades (Figur 1G,H).
Perilipin-1 är ett adipocytspecifikt protein som är känt för att främja lipiddropparbildning och hämma lipolys. Här transfecterades 3T3-L1 adipocyter med förvrängd siRNA (si-SCR) eller siRNA mot Plin1 (si-PLIN1). Tre dagar efter transfection med si-PLIN1, mRNA nivån av Plin1 hade minskat med 70%(figur 2A)och proteinnivån med 63% (Figur 2B, C). PLIN1 uttryck analyserades också av fluorescensmikroskopi 4 dagar efter transfection och konstaterades ha minskat med 92% jämfört med dess uttryck i kontroll adipocytes (Figur 2D-F), vilket visar effekten av både transfection protokollet och si-PLIN1.
Detta protokoll användes också för att utföra omvänd transfection av adipocyter med micro-RNA härma (miR härmar) oligonucleotides att uppreglera uttrycket av miR-34a (Figur 3A). Överuttryck av miR-34a ledde till minskningen av VAMP2 proteinuttryck med 50% (Figur 3B, C), ett bekräftat mål på miR-34a11,12. Slutligen visar denna studie att omvänd transfection av 3T3-L1 adipocyter bevarar deras funktion och lyhördhet för insulin stimulering. Nedslag av Plin1 i adipocyter 3T3-L1 ledde faktiskt till en ökning av basal lipolys (figur 4A). Dessutom ledde överuttryck av miR-34a i 3T3-L1-adipocyter till hämning av insulininducerad proteinkinas B fosforylering(figur 4B,C)och glukosupptag (figur 4D).
Figur 1: Differentiering av 3T3-L1 fibroblaster till mogna adipocyter. (A) 3T3-L1 fibroblaster såddes med en densitet av 3 x 105 celler per 100 mm skål. Representativa 10x brightfield bild av 3T3-L1 fibroblaster 2 dagar senare. B) Två dagar efter confluency (dag 0), 3T3-L1 fibroblaster var differentierade i adipocytes med hjälp av en differentiering cocktail blandning i 4 dagar (fram till dag 4). Representativ 10x brightfield bild av 3T3-L1 fibroblaster differentierade i adipocyter (dag 7). Adipocyter med multilocular lipid droppar är lätt att urskilja. C)Adipocyterna 3T3-L1 transfekterades med si-SCR dag 7. Representativa 10x brightfield bilder av transfected 3T3-L1 adipocyter (dag 9). Morfologin hos de transfekterade adipocyterna är jämförbar med de icke-transfecterade adipocyterna, vilket innebär att transfektionsmetoden är mild och inte giftig för adipocyterna. Skalstänger: 50 μm. (D–E) Adipocyterna 3T3–L1 transfekterades med si-SCR dag 7 (övre paneler); icke-transfecterade adipocyter (nedre paneler). Två dagar senare inkuberades cellerna med olja röd O för att färga lipider. (D) Representativa bilder av de färgade cellerna i plattan och representativa 10x brightfield bilder visas. Skalstänger: 50 μm. (E) Oil Red O som införlivades i cellerna eluerades med 2-propanol och kvantifierades med hjälp av en spektrofotometer. Data uttrycks i godtyckliga enheter, med absorbansen av de icke-transfecterade cellerna normaliserade till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes av Studentens t-test. F)Adipocyterna 3T3-L1 transfekterades med si-SCR. Tre dagar efter transfection, cellerna skördades för att isolera totala RNA. Uttrycket av adipocyte differentiering markörer mättes av qRT-PCR och normaliserades med hjälp av 36B4 RNA nivåer. Data representerar mRNA-uttrycket i transfekterade celler i förhållande till det i icke-transfecterade celler (normaliserade till 1, representerade av den prickade linjen) och uttrycks som medelvärdet + SEM för tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes av Studentens t-test. (G–H) De 3T3-L1 adipocytesna var transfected med si-SCR eller fluorescerande färgämne (FAM)-märkt si-RNA och pläteras på coverlips. 3T3-L1 adipocytes analyserades 8 h senare av fluorescens mikroskopi. G)Representativ enplansbild av transfecterade 3T3-L1-celler visas. (H) Kvantifiering av de FAM-positiva cellerna i förhållande till det totala antalet celler. Data uttrycks i procent av celler som innehåller fluorescerande si-RNA. Statistisk analys utfördes med Mann-Whitney test, ****p < 0.0001. Förkortningar: si-SCR = förvrängd siRNA; SEM = standardfel av medelvärdet; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription av polymeraskedjereaktion. FAM = fluorescein amidit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; si-FAM = FAM-märkt si-RNA. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Proteinsilencing i 3T3-L1-adipocyter. 3T3-L1 adipocyter transfected med förvrängda si-RNA (si-SCR) eller si-RNA mot Plin1 (si-PLIN1). A)Tre dagar efter transfection mättes mRNA uttryck av Plin1 med qRT-PCR. MRNA uttryck normaliserades med hjälp av 36B4 RNA nivåer och uttryckt i godtyckliga enheter, med si-SCR-behandlade celler normaliserade till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för fyra oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med studentens t-test,**p < 0,01. (B–C) Tre dagar efter transfectionen utsattes protein lysates för västra blotting med antikroppar riktade mot PLIN1 och HSP90 (lastningskontroll). Representativa immunoblots visas. C)Mängden PLIN1 kvantifierades genom densitometriskanningsanalys och normaliserades med hjälp av mängden HSP90. Data uttrycks i godtyckliga enheter, med si-SCR-behandlade celler normaliserade till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för fyra oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med studentens t-test,*p < 0,05. - Jagär inte så bra på att säga dethär. 3T3-L1 adipocyter var transfected med si-SCR eller si-PLIN1 och pläteras på täcklips. Uttrycket av PLIN1 analyserades 96 h senare av fluorescensmikroskopi. D)Representativa enplansbilder av 3T3-L1-adipocyter färgade med anti-perilipinantikropp och en antikanin-Alexa647-konjugerad antikropp visas. Skalstänger = 10 μm. (E) Tredimensionell (3D) volymrendering av 3T3-L1-adipocyter segmenterade i 3D med kommersiell programvara. Skalstänger = 10 μm. (F) Kvantifiering av PLIN1-signalintensitet i förhållande till det totala antalet celler. Data uttrycks i godtyckliga enheter, med si-SCR-behandlade celler normaliserade till 100%. Statistisk analys utfördes med Mann-Whitney test, ****p < 0.0001. Förkortningar: si-SCR = förvrängd siRNA; si-PLIN1 = siRNA mot sockel1; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = värmechockprotein 90; SEM = standardfel av medelvärdet; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription av polymeraskedjereaktion. FAM = fluorescein amidit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; IB = immunoblotting. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: mikro-RNA-överuttryck i 3T3-L1-adipocyter. 3T3-L1 adipocyter transfected med kontroll micro-RNA härma (miR-kontroll) eller micro-RNA 34a härma (miR-34a). Tre dagar efter transfekten skördades cellerna för (A) RNA-extraktion eller (B) beredning av proteinlyater. (A) Uttrycket av miR-34a mättes med qRT-PCR. MiR uttryck normaliserades med U6 små RNA nivåer och uttryckt i godtyckliga enheter, med miR-kontroll-behandlade celler normaliserade till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med studentens t-test,*p < 0,05. B)Proteinlysater utsattes för västerländsk blotting med antikroppar riktade mot VAMP2 och TUBULIN (lastkontroll). Representativa immunoblots av tre oberoende experiment visas. C)Mängden VAMP2 kvantifierades genom densitometriskanningsanalys och normaliserades med hjälp av mängden TUBULIN. Data uttrycks i godtyckliga enheter, med miR-kontrollcellerna normaliserade till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes av Studentens t-test, *p < 0,05. Förkortningar: SEM = standardfel av medelvärdet; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription av polymeraskedjereaktion. VAMP2 = vesikel-associerade membran protein 2; IB = immunoblotting. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Effekter av protein- eller mikro-RNA-modulering i 3T3-L1-fettsympningsfunktionen. A)3T3-L1 adipocyter transfected med si-SCR eller si-PLIN1. Mediet ändrades 24 h efter transfection och samlades sedan 48 h senare för att mäta basal lipolys. Resultaten uttrycks som glycerol som frigörs i media (μg/mL) och som medelvärdet + SEM för fyra oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med hjälp av Studentens t-test,***p < 0,001. B)3T3-L1 adipocyter transfected med miR-kontroll eller miR-34a. Mediet ändrades 24 h efter transfection, och sedan, 48 h senare, medium ändrades till utarmningsmediet (DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 1% penicillin och streptomycin och 0,5% BSA) för 6 h. Sedan behandlades cellerna med 0,5 nM insulin i 5 min. Celler skördades för att förbereda proteinlyat för western blotting med antikroppar riktade mot fosfo-PKB och PKB (lastkontroll). Representativa immunoblots av tre oberoende experiment visas. C)Mängden fosfo-PKB kvantifierades genom densitometriskanningsanalys och normaliserades med hjälp av den totala mängden PKB. Data uttrycks i godtyckliga enheter, med miR-kontrollcellerna behandlade med insulin normaliserade till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med hjälp av tvåvägs ANOVA-testet, *p < 0,05 jämfört med miR-kontrollceller som behandlats med insulin. D)Adipocyter 3T3-L1 transfekterades med miR-kontroll eller miR-34a. Mediet ändrades 24 h efter transfection, och sedan, 48 h senare, medium ändrades till utarmningsmediet för 6 h. Sedan behandlades cellerna med 0,5 nM insulin i 20 min. Upptag av (2-3H)deoxyglucose mättes över 3 min. Data uttrycks i godtyckliga enheter, med basal glukos upptag i miR-kontroll-behandlade celler normaliseras till 1. Resultaten uttrycks som medelvärdet + SEM för tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med hjälp av tvåvägs ANOVA-testet, *p < 0,05 jämfört med miR-kontrollceller som behandlats med insulin. Förkortningar: si-SCR = förvrängd siRNA; si-PLIN1 = siRNA mot sockel1; SEM = standardfel av medelvärdet; PKB = proteinkinas B; p-PKB = fosfor-PKB; miR-CTL = miR-kontroll; DMEM = Dulbeccos modifierade Eagles medium; BSA = bovint serumalbumin; ANOVA = analys av varians; IB = immunoblotting. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Per brunn (12-brunnsplatta) | Per brunn (24-brunnsplatta) | |
| Oligonukletider | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Förbättrat minimalt väsentligt medium | 20 μL | 10 μL |
| Reagens för transfection | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Förbättrat minimalt väsentligt medium | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Total volym transfection mix | 200 μL | 100 μL |
Tabell 1: Transfection reagenser som krävs för 12-brunns- och 24-brunnsplattaformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för differentiering och transfection av mogna adipocyter. Denna omvända transfection metod är en enkel, ekonomisk och mycket effektiv metod för att transfect oligonucleotides såsom, men inte begränsat till, siRNAs, micro-RNA härmar och anti-mikro-RNAs till 3T3-L1 adipocyter, som är en av de svåraste cellinjerna att transfekt. Den här metoden har vissa begränsningar som måste beaktas. Detta protokoll är inte effektivt för transfection med plasmid DNA, vilket begränsar nyttan av denna teknik för att få-av-funktion studier. Även om murin cellinjer, inklusive 3T3-L1 cellinjen, har använts vanligtvis för att studera adipocyte funktion in vitro, mikro-RNA uttryck mönster och aktiviteter i murin vävnad skiljer sig ofta från de som observerats hos människor; Detta är också fallet med primära celler och cellinjer. Dessutom kräver det medium som används för differentiering av 3T3-L1 fibroblast i adipocyter en ofysiologisk hormoncocktail (insulin, dexametason, IBMX och rosiglitazon), och de differentierade cellerna är morfologiskt åtskilda från in vivo mogna adipocyter: de presenterar multilokulära lipiddroppar istället för en unilocular lipid droppe. Detta kan förklara vissa skillnader i genuttryck och cellulära svar mellan in vitro- och in vivo-studier.
En fördel med att använda detta omvända transfection protokoll jämfört med elektroporation är att denna metod är billigare. Reagenserna är faktiskt billigare, och den höga effektiviteten hos omvänd transfection minskar mängden oligonukleotider som behövs, och det finns inget behov av dyr utrustning som en elektroporator. Dessutom är det fördelaktigt att använda en lägre koncentration av siRNA eftersom det undviker off-target effekter. Dessutom är denna omvända transfektion en enkel, snabb, mild och enkel metod för transfektion som kräver färre celler och kommer att säkerställa utmärkt cell livskraft och mer robusta data jämfört med elektroporation. Även om förfarandet ovan har optimerats för differentiering och omvänd transfection av mus 3T3-L1 celler, kan mänskliga preadipocyter också differentieras till adipocyter5 och lätt utsättas för omvända transfection med hjälp av detta protokoll. Denna rapport visar att adipocyter förblir livskraftiga, friska och lyhörda för insulin efter omvända transfection med hjälp av en ny generation av en icke-liposomal katjonisk amfifila transfection reagens. Omvänd-transfection kunde också utföras med andra populära transfection reagenser. Mängden oligonukleotider och transfection reagens skulle dock behöva optimeras för att säkerställa god modulering av uttryck och inga negativa effekter på cellens livskraft.
Detta protokoll underlättar studien av proteinernas och mikro-RNAs roll i adipocytfunktionen, men det kan också användas för att modulera andra icke-kodande RNAs såsom lnc-RNAs, Y-RNAs eller eRNAs. Det finns kritiska steg i protokollet som kan påverka förfarandets effektivitet. Differentiering av 3T3-L1 fibroblaster till adipocyter bör övervakas noggrant. Det är viktigt att nå en hög differentieringsnivå för att undvika spridning av återstående fibroblaster efter transfektionen, vilket skulle fördomsfulla resultaten av experimentet. En annan viktig punkt är att utföra transfektionen på nyligen differentierade mogna adipocyter; den bästa tidpunkten är 7-8 dagar efter början av differentieringsprotokollet, vilket motsvarar 3-4 dagar efter att differentieringscocktailen avlägsnas. Detta kommer att säkerställa robust transfection effektivitet och gynna god återanställning av adipocytes till plattan. Slutligen bör behandlingen av adipocyter med trypsin övervakas noggrant för att säkerställa avlossning av adipocyterna utan att skada cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av INSERM, Université Côte d'Azur och Franska nationella forskningsbyrån (ANR) genom programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) och Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. stöds av bidrag från Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) och Fondation Benjamin-Delessert. J.G. stöds av ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. stöds av ANR-bidraget ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 och ett bidrag från Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi tackar också Imaging Core Facility of C3M som finansieras av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes och Région PACA, som också stöds av GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
