Summary
这里介绍的是一个协议，将小干扰RNA（siRNA）、微RNA模拟（miR）或抗微RNA（抗miR）等寡核苷酸输送到成熟的脂肪细胞中，以调节蛋白质和微RNA表达。
Abstract
脂肪细胞功能的改变有助于代谢疾病的发病机制，包括2型糖尿病和胰岛素抵抗。这突出表明需要更好地了解脂肪细胞功能障碍所涉及的分子机制，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。调节脂肪细胞 中 蛋白质和微RNA的表达仍然极具挑战性。本文描述了一种将肉质成成熟脂肪细胞的方案，并利用小干扰RNA（siRNA）和微型RNA模拟（miR模仿）寡核苷酸，通过反向转化调节成熟脂肪细胞中蛋白质和微RNA的表达。此反向转化协议涉及转染试剂和寡核苷酸的孵化，以形成细胞培养板中的复合物，并添加成熟腺细胞。然后，在存在寡核苷酸/转染试剂复合物的情况下，允许脂肪细胞重新连接到粘附板表面。可对转染的3T3-L1成熟脂肪细胞进行胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂生成和脂质分析等功能分析，以研究蛋白质或微RNA操作对脂肪细胞功能的影响。
Introduction
肥胖被认为是许多代谢性疾病的主要危险因素，包括胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2D）和心血管疾病1。目前的治疗方法未能阻止这些疾病的发病率持续上升，肥胖和糖尿病患者的IR管理仍然是一个重要的临床问题。脂肪组织在控制能量平衡方面起着至关重要的作用，其在肥胖期间的病理扩张有助于红外和T2D2、3的发展。这突出表明需要更好地了解脂肪细胞功能障碍所涉及的分子机制，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。许多研究已经调查了蛋白质编码RNA在脂肪细胞生理学中的作用及其与肥胖的关系。
最近，非编码RNA（ncRNA）的发现，特别是微RNA（miRs），已经锻造了与基因表达程序调控机制相关的新概念。研究表明，ncRNA是脂肪细胞功能的重要调节器，其调节不良在代谢疾病中起着重要作用。因此，蛋白和ncRNA在脂肪细胞中的操纵对于破译它们在脂肪细胞功能中的作用及其对T2D等病理学的影响至关重要。然而，操纵蛋白质和ncRNA在体内和原发性脂肪细胞中的表达仍然极具挑战性，有利于使用体外脂肪细胞模型。
Murine 3T3-L1 成纤维细胞很容易分化成成熟、功能和胰岛素响应的脂肪细胞，这是用于研究脂肪细胞功能（如胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂解和脂肪素分泌）5、6、7、8、9、10的具有良好特征的细胞系。这些特性使3T3-L1脂肪细胞成为调节蛋白质编码和nc-RNA表达的有吸引力的模型，以破译它们在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。不幸的是，虽然3T3-L1成纤维细胞很容易使用商用试剂进行转染，但差异化的3T3-L1脂肪细胞是最难转染的细胞系之一。这就是为什么许多操纵3T3-L1细胞基因表达的研究都集中在脂肪细胞分化上，而不是脂肪细胞功能上。
长期以来，唯一有效的转染脂肪细胞的技术是电聚变5，这是乏味的，昂贵的，并可能导致细胞损伤。本文使用一种常见的转染试剂报告了反向转染技术，它减少了实际转染时间，对细胞生存能力没有影响，而且比电透电便宜得多。此协议非常适合硅酸和其他寡核苷酸（如微RNA模拟（miR模仿）和反微核素的转化。反向转化协议的原则是孵化转染试剂和寡核苷酸，在细胞培养板中形成复合物，然后将成熟的脂肪细胞播种到井中。然后，在寡核苷酸/转染试剂复合物的存在下，脂肪细胞重新连接到粘附板表面。这种简单、高效和廉价的方法允许研究蛋白质编码RNA和miR在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：使用无菌技术在层压流动细胞培养罩中执行协议的所有步骤。有关所有试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 将穆林 3T3-L1 成纤维细胞分化为脂肪细胞
- 在培养中DMEM的100毫米菜肴中种植3T3-L1成纤维细胞，不含丙酸酯、25mM葡萄糖、10%新生儿小腿血清和1%青霉素和链霉素（图1A）。将盘子放在组织培养孵化器（7% CO2 和 37 °C）。
- 汇合两天后，改变培养基，代之以不含环状、25mM葡萄糖的DMEM， 10% 胎儿小腿血清 （FCS）， 和 1% 青霉素和链霉素补充 0.25 m 3 - 异丁基- 1 - 甲基三甲基苯丙胺 （IBMX）， 0.25 μM 德克萨梅松， 5 μg/mL 胰岛素， 和 10 μM 松糖酮.
注：当细胞以每100毫米盘300，000个细胞播种时，需要5天时间才能达到汇流。 - 两天后，用不含皮鲁瓦酸、25 mM 葡萄糖、10% FCS 和 1% 青霉素和链霉素的 DMEM 代替培养基，辅以 5 μg/mL 胰岛素和 10 μM 玫瑰糖酮，孵育 2 天。然后，每2天用DMEM喂养细胞，不含皮鲁瓦酸、25mM葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素（图1B）。
- 在差异化协议开始后 7-8 天转染 3T3-L1 脂肪细胞。
注：在转染前达到高水平的分化（>80%）很重要，以避免转染后剩余成纤维细胞的增殖，这将导致细胞群的混合，从而可能偏向结果。
2. 预涂板的制备
- 在转染前一天或转染前几个小时，从 1 毫克/mL 的库存溶液中，以 100 μg/mL 的 30% 乙醇准备胶原蛋白 I 型溶液。每井加入 250 μL 胶原蛋白，每井加入 120 μL 的 24 井板，并将溶液铺在井面上。
- 将盘子放在培养罩下没有盖子，直到胶原蛋白干燥。用杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐（D-PBS）洗两次。
注：可购买预涂板。
3. 准备转染混合物
注：siRNA 的最终浓度在 1 到 100 nM 之间（每 12 井板井 1 到 100 pmol 的 siRNA）。miR 模仿的最终浓度为 10 nM（10 pmol/井）。在开始实验之前，确定每个硅核素、miR 模拟或其他寡核苷酸的最佳浓度，以避免偏离目标的影响。在三叶酸中执行转染实验，以方便对结果进行统计分析。准备所有过量的试剂，以说明管道过程中的正常损失。
- 通过管道（体积/体积）混合siRNA（或其他寡核苷酸）与改进的最小基本介质（表1）。在室温下孵育5分钟。
- 将转染试剂和改进的极小基本介质添加到 siRNA 中，然后用管道混合（表 1）。在室温下孵育20分钟（在此期间，继续到第4节）。将转染混合物添加到胶原蛋白涂层板的每个井中。
4. 3T3-L1 脂肪细胞的制备
- 用 D-PBS 清洗 100 毫米培养皿中的细胞两次。将 5 倍试用素添加到细胞中（每 100 mm 盘 1 mL），确保用试丁香覆盖所有表面。等待 30s， 并小心地删除试金素。
- 在孵化器中以 37 °C 孵育 5-10 分钟的培养皿。点击 100 mm 盘以分离细胞。
- 加入10毫升不含皮鲁瓦酸的DMEM、25m葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素，以中和胰蛋白酶。小心地上下管道介质，以分离细胞和均质的细胞悬架。
- 使用 Malassez 计数室或自动细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞浓度调整为 6.25 x 105 细胞/mL 的介质。种子 800 μL 的细胞悬浮/井的 12 井板 （5 x 105 细胞） 或 400 μl 的细胞悬浮/井的 24 井板 （2.5 x 105 细胞） 包含转染组合.
注：一个100毫米的培养皿的脂肪细胞将允许准备一个12井板或一个24井板。100 mm 盘通常包含 6-7 x 106 脂肪细胞，相当于每口 12 井板的 5 x10 5 脂肪细胞。 - 在细胞培养孵化器（7% CO2 和 37 °C）中孵育板，24 小时不干扰细胞。第二天，小心地用新鲜的DMEM代替超高分子，不含丙酸酯、25m葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素。
注意：也可以将细胞播种到胶原蛋白预涂的48井和96井板中，但在更换介质时采取更多的预防措施，以避免脂肪细胞分离。
5. 转染3T3-L1脂肪细胞的功能分析
- 研究目标分别在siRNA或miR模仿mRNA和蛋白质的输送后，分别降低24-48小时和48-96小时。
- 对经感染的脂肪细胞进行功能分析，研究胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂肪素分泌、脂解和脂肪生成。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用此处描述的反向转化程序来调节 3T3-L1 脂肪细胞中蛋白质或微RNA 的表达，已证明这些脂肪细胞在转染后保留了其形态（图 1B，C）。事实上，在转染后2天，脂肪细胞传播良好，并附着在板上，并呈现了成熟3T3-L1脂肪细胞的特性多叶脂液滴。血脂含量在转染和未转染的脂肪细胞之间没有区别（图1D，E）。此外， 分化标记的mRNA表达，如渗透扩散器激活受体伽马2（Pparé2），阿迪波尼汀（阿迪波克），葡萄糖运输机4或溶质载体家族 2 成员 4（Slc2a4），胰岛素受体基质 1（Irs1），腹蛋白-1（Plin1） 在转染细胞中与未受感染的脂肪细胞 （图 1F）相比没有变化。这种反向转染协议是有效的，因为>70%的脂肪细胞被转染（图1G，H）。
佩里平-1是一种脂肪细胞特异性蛋白质，已知可促进脂质液滴的形成并抑制脂质溶解。在这里， 3T3-L1 脂肪细胞被与炒锡尔纳 （si-SCR） 或 siRNA 对普林 1 （si-PLIN1） 的变异。与si-PLIN1转染三天后，Plin1的mRNA水平下降了70%（图2A），蛋白质水平下降了63%（图2B，C）。PLIN1表达在转染后4天还通过荧光显微镜进行分析，发现与控制脂肪细胞（图2D-F）的表达相比，已减少92%，从而证明了转染协议和si-PLIN1的功效。
该协议还用于用微RNA模拟（miR模拟）寡核苷酸对脂肪细胞进行反向转染，以调节miR-34a（图3A）的表达。miR-34a的过度表达导致VAMP2蛋白质表达减少50%（图3B，C），miR-34a11，12的确认目标。最后，本研究表明，3T3-L1脂肪细胞的反向转化保留了其功能和对胰岛素刺激的反应。事实上，在3T3-L1脂肪细胞中击倒Plin1导致基础脂化增加（图4A）。此外，miR-34a在3T3-L1脂肪细胞中的过度表达导致胰岛素诱导蛋白激酶B磷酸化（图4B，C）和葡萄糖吸收（图4D）的抑制。
图1：3T3-L1成纤维细胞分化成成熟的脂肪细胞。（A） 3T3-L1成纤维细胞的播种密度为每100毫米菜3×105细胞。代表 10 倍亮场图像 3T3-L1 成纤维细胞 2 天后。（B） 汇合后两天（第0天），3T3-L1成纤维细胞被区分为脂肪细胞，使用分化鸡尾酒混合物4天（直到第4天）。代表 10 倍亮场图像的 3T3-L1 成纤维细胞区分成脂肪细胞 （第 7 天） 。多细胞脂质液滴的脂肪细胞很容易辨别。（C） 3T3-L1 脂肪细胞在第 7 天被 si-SCR 感染。代表 10 倍的变异 3T3-L1 脂肪细胞的亮场图像（第 9 天）。转染性腺细胞的形态与未转染的脂肪细胞的形态相当，这意味着转染方法温和，对脂肪细胞无毒性。比例杆：50μm.（D-E） 3T3-L1 脂肪细胞在第 7 天（上面板）被 si-SCR 感染：非转染性脂肪细胞（下面板）。两天后，细胞被用油红O孵育，以染色脂质。（D） 显示板中染色细胞的代表图像和代表 10 倍亮场图像。比例杆：50μm.（E） 细胞中加入的油红 O 被涂上 2 丙醇，并使用光谱光度计进行量化。数据以任意单位表示，吸收未受感染的细胞正常化为 1。结果表示为三个独立实验的平均值 + SEM。统计分析是由学生的t测试进行的。（F） 3T3-L1 脂肪细胞被 si-SCR 感染。转染三天后，细胞被收获以分离总RNA。脂肪细胞分化标记的表达由 qRT-PCR 测量，并使用 36B4 RNA 水平正常化。这些数据表示转染细胞中的 mRNA 表达，相对于未受感染的细胞（由虚线表示为 1），并表示为三个独立实验的平均值 + SEM。统计分析是由学生的t测试进行的。（G/H）3T3-L1 脂肪细胞被 si-SCR 或荧光染料 （FAM） 标记为 si-RNA 并镀在覆盖唇上。3T3-L1 脂肪细胞在 8 小时后通过荧光显微镜分析。（G） 显示转染 3T3-L1 细胞的代表性单平面图像。（H） FAM阳性细胞相对于细胞总数的量化。数据表示为含有荧光si-RNA的细胞的百分比。统计分析是使用曼-惠特尼测试进行的，****p <0.0001。缩写： si - scr = 炒西纳;SEM = 平均值的标准误差;qRT-PCR = 定量反转录聚合酶链反应;法姆 – 氟辛在中间;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多;西法姆 = 法姆标签的 si - rna 。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：3T3-L1脂肪细胞中的蛋白质沉默。3T3-L1 脂肪细胞与炒 si-RNA （si-SCR） 或 si-RNA 对Plin1 （si-PLIN1） 发生转染。（A） 转染三天后，Plin1的 mRNA 表达由 qRT-PCR 测量。mRNA 表达使用 36B4 RNA 水平正常化，并以任意单位表示，si-SCR 处理的细胞正常化为 1。结果表示为四个独立实验的平均值 + SEM。统计分析是使用学生测试**p <0.01进行的。（B/C）转染三天后，蛋白解质受到西式印迹，含有针对PLIN1和HSP90（加载控制）的抗体。显示代表免疫污点。（C） PLIN1 的量通过密度测量扫描分析进行量化，并使用 HSP90 量进行规范化。数据以任意单位表示，si-SCR 处理的细胞正常化为 1。结果表示为四个独立实验的平均值 + SEM。统计分析是使用学生测试进行的， *p < 0.05 。（D/F）3T3-L1 脂肪细胞被 si-SCR 或 si-PLIN1 转染，并镀在盖片上。PLIN1的表达在96小时后通过荧光显微镜进行了分析。（D） 显示3T3-L1脂肪细胞的代表性单平面图像，这些脂肪细胞沾染了抗围素抗体和抗兔-亚历克萨647结合抗体。比例条 = 10 μm.（E）使用商业软件分段在 3D 中的 3T3-L1 脂肪细胞的三维 （3D） 体积渲染。比例杆 = 10 μm.（F） PLIN1 信号强度相对于细胞总数的量化。数据以任意单位表示，si-SCR 处理的细胞正常化到 100%。统计分析是使用曼-惠特尼测试进行的，****p <0.0001。缩写： si - scr = 炒西纳;si - plin1 = 西纳对普林 1;普林 1 = 佩里平 - 1;HSP90 = 热休克蛋白 90;SEM = 平均值的标准误差;qRT-PCR = 定量反转录聚合酶链反应;法姆 – 氟辛在中间;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多;IB = 免疫印迹。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：3T3-L1脂肪细胞中的微RNA过度表达。 3T3-L1 脂肪细胞通过控制微RNA 模拟（miR-控制）或微RNA 34a 模拟（miR-34a）进行转染。转染三天后，这些细胞被收获用于（A）RNA提取或（B）蛋白质解解剂的制备。（A） miR-34a 的表示方式由 qRT-PCR 测量。miR 表达使用 U6 小RNA 水平正常化，并以任意单位表示，miR 控制处理细胞正常化为 1。结果表示为三个独立实验的平均 值 + SEM。统计分析是使用 学生测试进行的， *p < 0.05 。（B） 蛋白解质受到西式印迹与抗体针对VAMP2和TUBULIN（加载控制）。显示了三个独立实验的代表性免疫图。（C） VAMP2 的量通过密度测量扫描分析进行量化，并使用 TUBULIN 量进行规范化。数据以任意单位表示，miR 控制单元正常化为 1。结果表示为三个独立实验的平均 值 + SEM。统计分析由学生的 t 测试进行， *p < 0.05 。缩写：SEM = 平均值的标准误差;qRT-PCR = 定量反转录聚合酶链反应;VAMP2 = 与囊泡相关的膜蛋白 2;IB = 免疫印迹。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：蛋白质或微RNA调节对3T3-L1脂肪细胞功能的影响。（A） 3T3-L1 脂肪细胞被 si-SCR 或 si-PLIN1 感染。转染后 24 小时改变介质，然后收集 48 小时后测量基础脂解。结果表示为媒体（μg/mL）释放的甘油，以及四个独立实验的平均值+ SEM。统计分析是使用学生的t测试进行的， ***p < 0.001。（B） 3T3-L1 脂肪细胞被 miR 控制或 miR-34a 感染。转染后，介质变为 24h，然后，48 h 后，介质被更改为耗竭介质（DMEM 无丙烯酸酯，25m 葡萄糖，1% 青霉素和链霉素，和 0.5% BSA）为 6h。然后，用0.5nM胰岛素对细胞进行5分钟的治疗。收获细胞是为了为西式印迹制备蛋白质解质，并含有针对磷-PKB和PKB（加载控制）的抗体。显示了三个独立实验的代表性免疫图。（C） 磷-PKB的量通过密度测量扫描分析进行量化，并使用PKB的总量进行规范化。数据以任意单位表示，用胰岛素处理的miR控制细胞正常化为1。结果表示为三个独立实验的平均值 + SEM。统计分析是使用双向ANOVA测试进行的，与用胰岛素治疗的miR控制细胞相比，p<0.05。（D） 3T3-L1 脂肪细胞被 miR 控制或 miR-34a 转染。转染后，介质变为 24h，然后，48 小时后，介质改为耗竭介质 6 小时。然后，用0.5nM胰岛素对细胞进行了20分钟的治疗。测量了 3 分钟以上的（2-3H） 脱氧糖。数据以任意单位表示，在miR控制处理细胞中的基础葡萄糖吸收正常化为1。结果表示为三个独立实验的平均值 + SEM。统计分析是使用双向ANOVA测试进行的，与用胰岛素治疗的miR控制细胞相比，p<0.05。缩写： si - scr = 炒西纳;si - plin1 = 西纳对普林 1;SEM = 平均值的标准误差;PKB = 蛋白激酶 B;p-PKB = 磷-PKB;mir - ctl = mir 控制;德梅姆 – 杜尔贝科修改后的鹰的介质;BSA = 牛血清白蛋白;ANOVA = 差异分析;IB = 免疫印迹。请单击此处查看此图的较大版本。
| 每口井（12井板） | 每口井（24井板） | |
| 奥利戈努克莱蒂德斯 | 20 微升 | 10 微升 |
| （西纳， 米尔...） | ||
| 改进的最小基本介质 | 20 微升 | 10 微升 |
| 转染试剂 | 5.6 微升 | 2.8 微升 |
| 改进的最小基本介质 | 154.4 微升 | 77.2 微升 |
| 转染混合物总容量 | 200 μL | 100 μL |
表1：12井和24井板格式所需的透射试剂。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文对成熟脂肪细胞的分化和转染提出了详细的协议。这种反向转染方法是一种简单、经济、高效的方法，可将寡核苷酸（如但不限于siRNA、微RNA模仿和抗微RNA）转化为3T3-L1脂肪细胞，这是最难转染的细胞系之一。此方法有一些需要考虑的限制。此协议对于质粒DNA的转染效率不高，这限制了该技术对功能收益研究的效用。虽然包括3T3-L1细胞系在内的紫外细胞系通常用于研究体外脂肪细胞功能，但穆林组织中的微RNA表达模式和活动往往与人类观察到的不同：原细胞和细胞系也是如此。此外，用于将3T3-L1成纤维细胞分化成脂肪细胞的介质需要一种非生理激素鸡尾酒（胰岛素、脱氧核糖核糖核胺、IBMX和玫瑰花酮），而分化细胞在形态上不同于活体成熟脂肪细胞：它们呈现多细胞脂质液滴，而不是单体脂质液滴。这可以解释体外研究和体内研究在基因表达和细胞反应上的一些差异。
与电透电相比，使用这种反向传染协议的一个好处是这种方法更便宜。事实上，试剂成本较低，反向转染的高效降低了所需的寡核苷酸数量，也不需要昂贵的设备，如电热器。此外，使用较低的硅RNA浓度是有益的，因为它避免了偏离目标的影响。此外，这种反向转染是一种简单、快速、温和、直接的转染方法，需要更少的细胞，并且与电透电相比，将确保出色的细胞生存能力和更可靠的数据。虽然上述详细程序已针对小鼠3T3-L1细胞的分化和反向转化进行了优化，但人类预体细胞也可以分化为腺细胞5， 并很容易使用此协议进行反向转染。本报告显示，使用新一代非脂质嗜血性两栖转染试剂进行反向转染后，脂肪细胞对胰岛素仍然有效、健康且反应灵敏。反向转染也可以使用其他流行的转染试剂执行。然而，寡核苷酸和转染试剂的数量需要优化，以确保良好的表达调节，不会对细胞生存能力产生不利影响。
此协议有助于研究蛋白质和微RNA在脂肪细胞功能中的作用，但它也可用于调节其他非编码RNA，如 lnc-RNA、Y-RNA 或 eRNA。协议中有一些关键步骤可能会影响程序的效率。应仔细监测 3T3-L1 成纤维细胞的分化情况。重要的是要达到高度的分化，以避免在转染后剩余成纤维细胞的扩散，这将偏向实验结果。另一个重要点是对新分化的成熟脂肪细胞进行转染：最佳时间是区分协议开始后 7-8 天，相当于去除差异化鸡尾酒后的 3-4 天。这将确保强大的转染功效，并有利于将脂肪细胞很好地重新连接到板中。最后，应仔细监测使用锥蛋白的脂肪细胞的处理，以确保脂肪细胞分离而不损害细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家航空研究局、蔚蓝海岸大学和法国国家研究局（ANR）的支持，该计划旨在为未来的卓越实验室（Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01）和卓越倡议（Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001）进行投资。J.J.得到法语国家协会、法语国家协会、法国多组织技术协会（非国大）和本杰明-德莱塞特基金会的赠款支持。J.G. 得到 ANR-18-CE14-0035-01 的支持。J-F.T. 得到ANR赠款ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01和梅迪卡莱基金会（埃基佩·弗鲁姆，DEQ20180839587）的赠款的支持。我们还感谢由阿尔卑斯-海洋部和Région PACA资助的C3M成像核心设施，该设施也得到了GIS IBISA显微镜和成像平台Céte d'Azur（MICA）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
